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• 2013年, 第27卷, 第S1期
  刊出日期：2013-11-25

    

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  T3.26 两种倍半萜氮芥化合物对HepG2细胞DNA损伤、细胞周期分布和细胞凋亡的影响

  古雪岩;黄德军;张迎梅

  2013, 27(S1): 81-81.

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  目的 研究两种倍半萜氮芥化合物对人肝癌细胞HepG2的影响,探讨其是否具有潜在的抗肿瘤作用。方法 利用MTT法检测不同浓度(5, 10, 20和40 mg·L^-1)的两种倍半萜氮芥化合物S-NM1和S-NM2处理人肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞HL-7702 24 h后的细胞活力;利用流式细胞术检测HepG2的细胞周期分布和凋亡程度;利用X射线辐照和碱性单细胞凝胶电泳检测DNA链间交联的程度;利用免疫荧光技术检测HepG2细胞聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1)的表达。结果 S-NM1和S-NM2处理HepG2细胞和HL-7702细胞24 h后可以浓度依赖性地降低细胞活力,且相较于HL-7702细胞,S-NM1和S-NM2可以更好地降低HepG2细胞的活力。S-NM1和S-NM2处理HepG2细胞的IC₅₀值分别为14.74和20.82 mg·L^-1,处理HL-7702细胞的IC₅₀值分别为20.71和30.62 mg·L^-1。用不同浓度(5, 10, 20和40 mg·L^-1)的S-NM1和S-NM2处理HepG2细胞24 h后发现,S-NM1可以显著地(P<0.01)将细胞周期阻滞在S期,而S-NM2则可显著地(P<0.01)将细胞周期阻滞在G₂期。用不同浓度(10, 20和40 mg·L^-1)的S-NM1和S-NM2处理HepG2细胞24 h后,S-NM1(40 mg·L^-1)和S-NM2(20和40 mg·L^-1)均可以显著地(P<0.01)引起细胞凋亡。不同浓度(10, 20和40 mg·L^-1)的S-NM1和S-NM2均可以造成HepG2细胞核DNA链间交联,其中S-NM2引起DNA链间交联的能力较S-NM1强。以40 mg·L^-1浓度为例,S-NM1处理2 h时交联程度最强,交联率约为75.28%,在处理4 h后交联率便逐渐降低,但处理12 h时仍有明显的交联;而S-NM2处理2 h时交联率约为82.87%,在处理8 h后交联率才逐渐降低。S-NM1(40 mg·L^-1)和S-NM2(20和40 mg·L^-1)处理均可以降低PARP-1在细胞中的表达。结论 两种倍半萜氮芥化合物可以选择性地降低HepG2细胞的活力,造成明显的DNA链间交联、细胞周期阻滞和细胞凋亡,并且可能是潜在的PARP-1抑制剂。通过比较S-NM1和S-NM2对HepG2细胞造成的影响,这两种化合物的作用机制可能有所不同,需要结合其他细胞株和体内实验进一步开展研究。
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  T3.28 纳米制剂的非临床安全性评价探讨

  岳鹏;沈姣;蔡鸣;乔红群;刘晶

  2013, 27(S1): 82-82.

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  纳米技术在医药学领域中得到较为快速发展, 而纳米制剂, 因其粒径小, 比表面积大等特点, 而且有多种给药途径,能够增强药物在体内的溶解速率及口服生物利用度, 对组织或细胞具有靶向作用并延长其在作用部位的作用时间, 因而也越来越受到药学工作者的关注。然而对于药物纳米制剂的生物安全性评价标准和评价方法,目前来说国际上还没有一个统一、完善的实施办法,因此,在药物纳米制剂进入药物非临床安全性评价时,面临的问题还非常多。纳米药物制剂的长期毒性试验剂量设计应根据纳米药物制剂的特性,仔细审慎地设计试验方案和对毒性靶器官的观察。由于纳米制剂的特性,必须考虑该给药途径下,纳米材料本身可能带来的毒性,要与药物本身可能带来的毒性予以区分。Brown等将不同剂量下不同粒径的聚苯乙烯颗粒表示成表面积,发现表面积与肺部炎症指标多形核白细胞呈线性关系。故认为表面积可能为引起炎症的变量。因此,粒径越小,比表面积越大的颗粒将会对肺部组织的损害越大。此外,在经口给药后,纳米制剂在胃肠道由于颗粒微小,有可能影响生物膜的生物效应而影响肠胃蠕动、黏膜吸收以及胃肠道内酶及激素的分泌,同时,吸收的颗粒还可敬淋巴管进入血液循环到达肝及脾,对这类二次转移的器官是否具有不良效应也是应该注意的问题。超微颗粒的静脉注射除有机会沉积在血管壁上影响细胞通透, 还可能通过血脑屏障, 影响中枢神经系统。中药的长期毒性试验也是中药制剂安全性评价中非常中药的一环,尽管纳米中药出色的药物活性已被相继报道, 但是无论是单方或者复方中药在经过超微处理后再应用均可能得出毒性反应也加强的推论。叶晓川等在对雄黄的单方纳米化研究中发现,普通雄黄含有三氧化二砷,在极低浓度下仅具有很小的毒性,且能表现出与毒性无关的生物活性。如果单纯进行中药雄黄的纳米化,根据超微粉化中药的特点, 应当预见可以加速或增加砷的释放, 是否能够造成砷蓄积或产生砷毒性则需要进行相关的试验研究。在药物安全性评价,特别是纳米制剂的安全性评价,没有一成不变的试验方法,一定要根据药物自身的特性,结合纳米制剂的特性和纳米材料的特点,利用药物纳米制剂的药理、毒理研究结果,依据case by case原则,对药物纳米制剂进行系统、全面的安全性评估。
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  T20.16 细胞骨架相关的微囊藻毒素毒性机制

  徐进;涂巍巍

  2013, 27(S1): 365-365.

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  目的 探讨骨架相关信号通路在微囊藻毒素LR(MC-LR)毒性机制中的作用。方法 人肝细胞来源的HL7702细胞用MC-LR 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1和10 μmol·L^-1。MTT法检测MC-LR对HL7702细胞存活;免疫荧光法观察细胞骨架;流式细胞术检测细胞周期;AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡;实时荧光定量法检测mRNA水平;Western blotting法检测蛋白表达和磷酸化水平。结果 不同浓度MC-LR处理24 h后,细胞增殖随着染毒浓度的增高而逐渐降低。MC-LR暴露导致微丝和中间纤维结构发生改变,而微管无明显变化。随着染毒浓度增加,G₀/G₁期细胞逐渐增加,S期细胞逐渐减少。随着染毒浓度升高,细胞凋亡率逐渐上升。MC-LR对骨架相关基因的转录水平均无明显影响。MC-LR暴露后,除K8的蛋白水平下降外,其他骨架相关蛋白表达均无明显改变。MC-LR可使K8/18, Vimentin和VASP的磷酸化水平显著升高。MAPK信号通路中P38、ERK1/2和JNK的蛋白表达无明显改变,但磷酸化水平显著升高。P38和ERK1/2抑制剂能显著抑制MC-LR诱导的微丝和中间纤维相关蛋白过磷酸化,而JNK抑制剂无显著效果。结论 MC-LR的肝细胞毒性可能是通过MAPK信号通路(P38和ERK1/2)的激活,引起骨架相关蛋白的过磷酸化,进而发生微丝和中间纤维的重排、破坏,并最终导致细胞增殖抑制、细胞周期阻滞和细胞凋亡。
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  T20.24 DNA甲基化抑制剂逆转苯代谢物抑制K562细胞转铁蛋白受体表达

  李怡然;余春红;李扬;苏日咕嘎;唐恪雅;姜良;易宗春

  2013, 27(S1): 370-370.

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  目的 观察苯代谢物对K562细胞转铁蛋白受体表达的影响以及DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-CdR)的干预作用。 方法 K562 细胞用苯代谢物处理72 h,处理期间的后48 h加入DNA甲基化抑制剂5-aza-CdR进行干预,然后利用荧光标记抗体与流式细胞技术分析细胞表面转铁蛋白受体的表达,应用反转录PCR技术分析细胞转铁蛋白受体mRNA的表达水平。结果 K562细胞经三种苯代谢物苯酚(200, 400和800 μmol·L^-1)、氢醌(10, 20和40 μmol·L^-1)或1,2,4-苯三醇(5, 10和20 μmol·L^-1)处理24, 48和72 h,三种苯代谢物均能浓度和时间依赖性抑制转铁蛋白受体在细胞表面的表达,其中最高浓度的苯酚组(800 μmol·L^-1)处理72 h抑制率达59.5%,最高浓度的氢醌组(40 μmol·L^-1)处理72 h抑制率达71.6%,而最高浓度的1,2,4-苯三醇组(20 μmol·L^-1)处理72 h抑制率达46.3%;且三种苯代谢物处理72 h均能浓度依赖性抑制转铁蛋白受体mRNA在K562细胞内的表达。进一步观察DNA甲基化抑制剂5-aza-CdR对苯代谢物抑制转铁蛋白受体在K562细胞表面表达的干预作用。结果显示,5-aza-CdR单独处理并不改变转铁蛋白受体在K562细胞表面的表达;而当苯代谢物处理24 h后,再加入5-aza-CdR共同处理K562细胞48 h,转铁蛋白受体在细胞表面的表达得到明显恢复,其中苯酚(800 μmol·L^-1)处理细胞在存在5-aza-CdR情况下从41.4%恢复到83.4%,氢醌(40 μmol·L^-1)处理细胞在存在5-aza-CdR情况下从31.7%恢复到82.4%,1,2,4-苯三醇(20 μmol·L^-1)处理细胞在存在5-aza-CdR情况下从51.7%恢复到87.7%。观察5-aza-CdR对苯代谢物抑制K562细胞转铁蛋白受体mRNA表达的干预作用发现,5-aza-CdR单独处理并不改变K562细胞转铁蛋白受体mRNA表达水平;而当苯代谢物处理K562细胞24 h后,再加入5-aza-CdR共同处理48 h,细胞转铁蛋白受体mRNA表达水平相对于单纯苯代谢物处理细胞均有显著提高。结论 苯代谢物可抑制K562细胞转铁蛋白受体的表达,5-aza-CdR可以从转录水平逆转苯代谢物对转铁蛋白受体在K562细胞表达的抑制作用,提示DNA甲基化可能参这一过程;转铁蛋白受体的表达抑制会影响细胞铁的摄入,从而影响血红素合成,继而抑制血红蛋白合成影响红系分化。
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  T20.27 镉恶性转化人支气管上皮细胞的异常甲基化和lncRNA表达

  雷毅雄;周志衡;刘海柏;黄钦海;王敏

  2013, 27(S1): 371-372.

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  目的 探讨DNA甲基化和长链非编码RNA在镉致癌过程中的作用机制。方法 应用DNA甲基化技术和lncRNA表达谱对镉恶性转化人支气管上皮细胞(16HBE)的DNA修复相关表观遗传机制进行探讨。通过HPLC, RT-PCR, WB和MSP等方法对镉恶性转化16HBE不同阶段细胞(对照细胞、镉转化第5代、15代及35代细胞及裸鼠成瘤细胞)进行基因表达和DNA甲基化检制,运用 lncRNA芯片技术对第35代转化细胞及对照细胞分别进行lncRNA表达谱分析,并用生物信息学和RNA干扰分析lncRNA的功能。结果 在镉恶性转化细胞过程中,DNA 总体甲基化水平显著上调,并与DNA甲基转移酶基因DNMT1和DNMT3a的过量表达相关,但未见与DNMT3b的表达有联系。LncRNA表达谱分析得到33,045条lncRNA, 经过对原始数据进行预处理及均一化后,筛选出21409 条lncRNAs。与对照组细胞比较,第35代镉恶性转化细胞有369条lncRNA表达上调,90条lncRNAs表达下调(2倍以上变化, P<0.05)。隨着镉诱导细胞恶变进程,发现DNA修复基因hMSH2, ERCC1, XRCC1 and hOGG1的mRNA及其蛋白表达量均逐步显著下降,并有8条lncRNA(ENST00000414355, ENST00000504222, ENST00000431648, ENST00000436765, ENST00000457776, ENST00000439302, ENST00000446135, AK000930)表达显著上升,更可见第35代镉恶性转化细胞和裸鼠成瘤细胞的hMSH2, ERCC1, XRCC1和hOGG1启动子区域高甲基化。进一步的研究表明,甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷可逆转镉诱导的DNA 总体高甲基化水平、DNMT过度活跃及hMSH2, ERCC1, XRCC1和hOGG1沉默,并具有时间依赖性。通过生物信息学分析和RNA干扰实验,显示某些lncRNA(ENST00000414355和ENST00000446135)与DNA修复基因的表观调控有关。结论 在镉恶性转化16HBE细胞过程中,可发生DNA异常甲基化及lncRNA表达谱改变,其在镉致癌相关DNA修复基因表观遗传中起作用,可能是镉诱发16HBE细胞恶变的重要机制之一。
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  T20.30 转化生长因子β激活激酶1信号通路在刀豆蛋白A诱导的肝损伤中的作用

  秦佩;雷志明;吴双;尚兰琴;郝卫东

  2013, 27(S1): 373-374.

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  目的 建立刀豆蛋白A(Con A)诱导的肝损伤模型,了解转化生长因子β激活激酶1(TAK1)信号通路在Con A诱导的小鼠肝损伤模型中的作用,为进一步研究该疾病模型的发病机制及其应用提供依据。方法 小鼠尾静脉注射Con A 0, 4, 8, 12和16 mg·kg^-1,给药后6 h处死,检测血清ALT, AST以及LDH,用ELISA法检测肝匀浆TNF-α,用Western blot法检测TAK1以及磷酸化TAK1蛋白表达情况;小鼠尾静脉注射Con A 16 mg·kg^-1,分别于0, 3, 6, 12和15 h后处死,处理同上。为进一步证明TAK1在该模型中的作用,采用5Z-7-oxozeaenol(OZ)特异性地抑制TAK1信号通路。将SPF级ICR小鼠随机分为正常对照组、模型组、模型组+OZ(尾静脉注射Con A 16 mg·kg^-1,提前15min注射OZ 10 mg·kg^-1),6 h后取血清测ALT, AST以及LDH,制备肝匀浆用ELISA法检测TNF-α,提取肝脏蛋白用Western blot法检测TAK1以及磷酸化TAK1表达情况。结果 与溶剂对照组相比,12和16 mg·kg^-1剂量组小鼠血清ALT, AST以及LDH浓度明显增高(P<0.05),16 mg·kg^-1剂量组,肝匀浆中TNF-α水平呈现一定的时间反应关系,3~6 h达到高峰;Western blot结果显示,Con A 16 mg·kg^-1所诱导的肝损伤模型中,肝脏TAK1磷酸化水平明显增高(P<0.05),且呈现一定的时间反应关系。采用OZ特异性抑制TAK1信号通路的结果表明,给予OZ的小鼠,与模型组小鼠相比,给药6 h后血清中ALT, AST以及LDH的浓度明显降低(P<0.05),肝匀浆中TNF-α水平也明显下降(P<0.05),肝TUNEL染色结果显示,肝细胞凋亡比例明显降低(P<0.05)。结论 Con A诱导的肝损伤模型中TAK1信号通路发挥着关键性作用,并且TAK1特异性抑制剂5Z-7-oxozeaenol可以改善Con A引起的肝损伤。
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  T20.32 MAP4K4基因敲除对CD4⁺ T淋巴细胞功能的影响

  黄鸿鹏;唐秋琼;褚洪迁;郝卫东;魏雪涛

  2013, 27(S1): 374-375.

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  目的 探讨MAP4K4基因在CD4⁺ T 淋巴细胞中的功能。方法 应用MTT法检测正常型C57小鼠和特异CD4⁺ T淋巴细胞MAP4K4基因缺陷型C57小鼠外周淋巴结中CD4⁺ T淋巴细胞在给予佛波酯(PMA)和离子霉素刺激72 h后的细胞增殖功能。同时将刺激72 h后的CD4⁺ T淋巴细胞染AnnexinⅤ-FITC和PI-PE抗体,利用流式细胞仪检测两种小鼠外周淋巴结中凋亡的CD4⁺ T淋巴细胞所占百分比。用荧光定量PCR法检测两种C57小鼠外周淋巴结中CD4⁺ T淋巴细胞给予PMA/离子霉素刺激72 h后IL-2和IFN-γ的相对表达量。用流式细胞仪检测两种C57小鼠外周淋巴结中CD4⁺ T淋巴细胞给予PMA/离子霉素刺激6 h后,IL-4, IL-17, IFN-γ和Foxp3细胞因子及转录因子的表达水平。用Western blot法检测两种小鼠CD4⁺ T淋巴细胞ERK, JNK和p38蛋白磷酸化表达水平。结果 用PMA/离子霉素刺激72 h后,MAP4K4基因敲除后可以抑制CD4⁺ T淋巴细胞的增殖,对照组和MAP4K4基因敲除组凋亡的CD4⁺ T 淋巴细胞百分比无统计学差异并且MAP4K4基因敲除后可以显著降低IL-2和IFN-γ mRNA的相对表达量。用PMA/离子霉素刺激6 h后,MAP4K4基因敲除后增加了Foxp3转录因子的表达,同时降低IFN-γ细胞因子的表达水平,但是MAP4K4基因敲除并不影响IL-17和IL-4细胞因子的表达。MAP4K4基因敲除显著抑制CD4⁺ T 淋巴细胞磷酸化ERK, JNK和p38蛋白的表达。结论 MAP4K4基因在CD4⁺ T淋巴细胞中具有重要的作用,它可以促进转录因子Foxp3的表达,同时抑制IL-2和IFN-γ细胞因子的表达。MAP4K4基因对CD4⁺ T淋巴细胞的增殖具有不可或缺的作用,其潜在的作用机制可能与抑制ERK, JNK和 p38蛋白磷酸化有关。
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  T20.34 锰对大鼠脑片神经细胞内质网应激相关分子GRP78和CHOP表达的影响

  徐斌;邓宇;刘巍;李乐慧;杨天瑶;徐兆发

  2013, 27(S1): 375-376.

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  目的 观察神经细胞的锰染毒损伤情况,探讨内质网应激通路相关分子。方法 用出生4~7 d的SPF级Wistar胎大鼠数只,切取300 μm厚度脑片,在实体解剖显微镜下切取大脑基底核部位组织。脑片于饱和湿度、37℃、5%CO₂的孵箱中培养15 d,用锰400 μmol·L^-1分别处理0, 6, 12, 18和24 h后,检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量,神经细胞凋亡率以及葡萄糖调节蛋白78(GRP78),CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和胱天蛋白酶12的基因蛋白表达。结果 随着锰暴露时间的增加,培养液中LDH释放量和神经细胞凋亡率均逐渐升高,锰处理24 h后达到最高值,分别是对照组的2.75和11.15倍(P<0.01),表明此时脑片细胞损伤明显。脑片用锰400 μmol·L^-1处理后,细胞GRP78, CHOP及胱天蛋白酶12的mRNA和蛋白表达水平均随着锰暴露时间的增加逐渐上升,在锰处理24 h后达到最高值。结论 锰可以导致神经细胞内质网功能失衡,一些促凋亡蛋白被激活,诱导内质网应激反应性细胞凋亡的发生。
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  T20.36 百草枯对小鼠中脑黑质Nrf2核转位的作用机制

  吴思英;王章敬;陈钱钱;李煌元

  2013, 27(S1): 376-377.

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  目的 探讨百草枯(PQ)致小鼠黑质细胞核Nrf2水平改变的可能机制。方法 (1)C57BL/6小鼠,每隔2 d, PQ 5和10 mg·kg^-1,共10次。应用蛋白酶体特异性底物检测小鼠黑质蛋白酶体活性改变。(2)C57BL/6小鼠随机分为对照组、PQ组、泛素蛋白酶体抑制剂ALLN组、ALLN+PQ 组、蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)组、CHX+PQ组(n=6)。PQ组:PQ制备小鼠帕金森病模型组,即每间隔2 d腹腔注射PQ 7 mg·kg^-11次,共10次;ALLN组:经腹腔注射ALLN 30 mg·kg^-1后1 h;ALLN+PQ组:于最后一次PQ染毒之前1 h经腹腔注射ALLN 30 mg·kg^-1;CHX组:皮下注射CHX 2.5 mg·kg^-1后1 h。CHX +PQ组:于最后一次PQ染毒之前1 h皮下注射CHX 2.5 mg·kg^-1。(3)染毒结束后处死小鼠,取中脑黑质提取细胞核蛋白,用Western blot方法测定细胞核中Nrf2表达水平相对量。结果 (1)与对照组比较,PQ 10 mg·kg^-1处理组小鼠黑质组织胰蛋白酶的活性下降,差异有统计学意义;PQ 5 mg·kg^-1处理组小鼠黑质组织胰蛋白酶的活性也下降,但差异未见统计学意义;而PQ 5和10 mg·kg^-1处理组小鼠黑质组织糜蛋白酶样活性、多肽-谷氨酰-多肽水解酶活性均未见明显变化。(2)与对照组比较,PQ, ALLN以及ALLN+PQ处理组细胞核Nrf2水平均升高,差异均有统计学意义,结果表明PQ或ALLN处理可诱导Nrf2细胞核转位;与PQ组或ALLN组相比较,ALLN+PQ处理组细胞核Nrf2水平均未见明显变化,差异均无统计学意义;结果提示,ALLN抑制蛋白酶体对Nrf2的降解而促进Nrf2核转位,而泛素蛋白酶体降解Nrf2途径可能不参与PQ致黑质细胞Nrf2核转位。(3)与对照组比较,PQ和CHX处理组细胞核Nrf2均升高,差异均有统计学意义,这表明PQ或CHX处理可诱导Nrf2细胞核转位;与PQ组或CHX组相比较,CHX+PQ处理组细胞核Nrf2水平降低至对照组水平,差异有统计学意义;结果提示,蛋白合成抑制剂CHX预处理抑制PQ对PC12细胞Nrf2的核转位。结论 高剂量PQ处理可选择性降低胰蛋白酶的活性,泛素蛋白酶体功能障碍可能是PQ神经毒性作用机制之一。PQ致黑质细胞Nrf2核转位(激活)的机制不涉及泛素蛋白酶体降解Nrf2途径,而涉及Nrf2蛋白合成途径。
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  T18.6 1-氯-3-丁烯-2-酮与脱氧鸟嘌呤核苷反应产物的结构鉴定

  张新宇;李艳

  2013, 27(S1): 337-337.

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  1-氯-3-丁烯-2-酮(CBO)是1,3-丁二烯的一种代谢产物。丁二烯是一种致癌性环境污染物,主要环境来源为汽车尾气以及香烟烟雾等。丁二烯致癌性由其代谢物引起。它产生多种代谢物,如3,4-环氧-1-丁烯、1,2,3,4-双环氧丁烷和3,4-环氧-1,2-丁二醇等。CBO是最近新发现的一种代谢物。我们研究了CBO以及其前体1-氯-2-羟基-3-丁烯(CHB)的细胞毒性、遗传毒性和致突变性,发现CHB和CBO都有细胞毒性和遗传毒性,但CBO毒性比CHB强100倍。CHB具有致突变性,而CBO的毒性阻碍了对其致突变性的研究。为进一步探索CBO遗传毒性的分子机制,寻找可能的CBO生物标志物。研究了CBO与2'-脱氧鸟嘌呤核苷(dG)在体外生理条件(pH 7.4,37℃)下的反应。CBO通过两步反应合成。与dG的反应在磷酸缓冲溶液中进行,摩尔比CBO:dG为8:1,使用HPLC跟踪反应的进行。产物在制备级HPLC上分离纯化,用MS和一维/二维NMR光谱鉴定结构。结果显示,CBO容易与dG发生反应,产生6种产物,按照洗脱顺序依次从G1命名到G6。分离并鉴定了三个主产物(G1、G3和G4)。G3和G4无法分离,表明它们是处于快速平衡中的一对异构体。鸟嘌呤通常是DNA中最容易受到亲电攻击的碱基,因其反应性较强,且有最多的反应位点。CBO与dG容易发生反应,形成多种产物,与此相符。CBO与核酸碱基的反应可能是CBO强遗传毒性的分子基础。
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  T19.4 风险评价毒理学意义

  应贤平

  2013, 27(S1): 343-344.

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  我国虽然有众多毒理学检验机构或检验报告,但无法做到定量分析人类健康危害,毒理学试验指标不仅需要考虑统计学、生物学意义,更重要应该关注毒理学意义。毒理学是揭示物质毒性特征或研究毒物剂量、作用模式、疾病形成关系一门学科。风险评价毒理学意义在于弥补毒性检测指标应用中存在不确定性和缺乏生物学科学依据缺陷,利用现有毒性资料和科学技术按毒作用机制过程将人体毒性发生精确概率进行科学严密推算,目的是期望毒性风险确定并在人们可控制范围,避免社会发生不必要恐慌。风险评价暴露评定、剂量-反应评定和发病率评定内容应当纳入毒理学研究剂量、作用模式、疾病形成相应定量关系中。据《2012中国肿瘤登记年报》数据,全国肿瘤发病率为285.91/10万,是风险评价可接受水平底线(百万分之一)近3000倍,不乏显示"全民皆癌"趋势恐慌。非致癌毒性作用最常用暴露评定首先确定关键作用起始点(POD)剂量。POD可以选用毒理学试验结果未观察到有害作用水平(NOAEL)实验剂量或者采用评估特定暴露期限内目标暴露人群产生不可观察到有害作用暴露量限值的最低风险水平值(MRL),才能作为我们专业工作者决定是否需要进一步评估人类健康风险筛选工具,不宜采用不同于毒理学数据来源的营养学可耐受最高摄入量(UL)等指标。美国环境保护署(EPA)免费提供基准剂量(BMD)方法软件,基准剂量与NOAEL方法相比有如下优点:① 更依赖于完整的数据报告,包括汇总资料统计值(如各组的样本量、反应数、或者均数与标准差)以用于分析,整合了生物学作用和统计学信息;② 起始值不局限于实验剂量,而且基准剂量的计算过程允许在只有观察到有害作用的最低水平(LOAEL)剂量存在的情况下进行;③ 基准剂量反映了剂量-反应曲线的斜率;4④ 基准剂量模型检验(χ²P >0.1)、选择(AIC最低值)及运行,得出外推10%风险95%可信限下限值BMDL₁₀和BMD₁₀,作为安全值和异常值参考点,把BMDL₁₀和BMD₁₀用于安全边际(MOS)和暴露边际(MOE)推算起始点(POD)做法对样本量问题的处理显的更为合理。所谓安全评价实际上与风险评价的内容一致,差别可能在参考点选择意义上,经风险评价事件知道其风险值大小同时也就清楚其安全域范围;⑤ MOE=OD/Ⅱ适用非线性毒性作用,MOE值越大,关注可以越低,MOE值变化能够反映风险控制效果。采用MOE评价时需要考虑剂量-反应关系斜率、作用类型、作用模式、不确定因子来源和大小、人群易感性差异5方面因素。
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  T19.7 欧盟REACH法规中的毒理学评估

  汪涵;叶芳毅

  2013, 27(S1): 345-345.

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  欧盟REACH 法规通过注册、评估、授权及限制的手段,控制化学品带来的风险,保护人类健康和生态环境,对人类健康相关的毒理学评估以及环境毒理学评估方面都做了严格的要求。法规在化学品安全评估过程中的思路是通过危害评估和暴露评估来最终完成风险表征并得到合理可行的风险管理措施。本文的重点在于介绍REACH法规在人类健康危害(毒理学范畴)和环境危害(环境和生态毒理学范畴)两大评估中所采取的一般思路及评估的流程步骤和有关参数、方法,详细阐述了相关阈值的推导。在评估中,阈值参数DNEL(推导无影响水平)是人类健康危害评估的重要数据,为风险表征提供一个定量的基准数值,DMEL(推导最小影响水平)则为物质的致癌性和致畸性等风险提供一个定性评估的基础。而PNEC(预期无影响浓度)是物质在环境暴露中的安全阈值,反映不同环境区划的剂量反应关系,为定量环境风险评估提供依据,是REACH法规化学品安全评估中环境风险表征的一个重要参数。本文以这些阈值参数的推导作为前提,结合了实际的评估案例,所选取的案例涵盖了有机物、无机物、液体、固体、低危化学品和高危化学品等不同情形类别,来全面细致地展示REACH法规中风险评估的技术要点。作为目前全球化学品管理法规中最复杂也是最科学的一部法规,REACH法规在各种人类健康和环境暴露评估模型方面做出了令人瞩目的成绩,其中有许多值得学习和借鉴的地方。
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  T19.10 中欧工业化学品管理中毒理数据要求的差异分析

  白利强

  2013, 27(S1): 347-347.

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  工业化学品的管理以欧盟的化学品注册、评估、授权及限制法规(REACH)最为严格。在美国、日本等大多数国家还在对新物质与现有物质区别管理时,欧盟就通过REACH法规将现有物质和新物质纳入了同样的管理体系。此外,REACH法规还将管理范围从物质延伸到混合物和最终制品;将管理手段从注册登记扩展到供应链信息要求、高度关注物质(SVHC)、授权及限制。中国工业化学品管理是从1994年由原国家环保局公布的《化学品首次进口及有毒化学品进出口环境管理规定》开始的,该规定首次提出了工业化学品进口要提供毒理等数据,管理对象是首次进口化学品,此规定在2003年初被废止。在2003年4月份原国家环保总局公布了17号令《新化学物质环境管理办法》,管理对象从首次进口化学品变化为新化学物质。2010年环保部公布了7号令《新化学物质环境管理办法》以取代2003年公布的17号令,在新版的办法中对申报的类型做了细化,同时对不同级别申报的数据要求做了细致的规定,另外将风险评估报告作为常规申报的申报材料之一。企业在准备工业化学品申报注册的时候,花费最多的部分是数据(尤其是毒理数据)的取得。本文通过对比在中国7号令《新化学物质环境管理办法》及欧盟REACH法规中工业化学品注册申报过程中的毒理数据要求的差异,对毒理数据要求在不同申报注册类型、申报注册级别、毒理数据要求、豁免规则、数据产生实验室、数据提交期限等方面的差异进行了系统的阐述。本文意在使企业更好地了解环保部7号令与欧盟RECAH法规在毒理数据要求的差异,了解中国目前工业化学品的毒理学要求的独特性,为后续工业化学品管理措施的完善提供素材。
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  T4.11 魔芋低聚糖对实验性结肠炎的治疗作用

  张波;冯莉;齐妍;刘昱

  2013, 27(S1): 126-126.

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  目的 研究魔芋低聚糖对实验性结肠炎的治疗作用。方法 套管经小鼠肛门插入结肠至4 cm处,注入0.1ml 50%乙醇溶解的三硝基苯磺酸100 mg·kg^-1制备肠炎模型,1 h后经口分别灌胃魔芋低聚糖25和100 mg·kg^-1。1 次/d,共10 d。第11d脱臼处死小鼠,称取脏器胸腺、脾、肝、肺、肾、心脏的重量。截取4 cm结肠,称重并计算结肠溃疡面积,并另取4 cm结肠组织甲醛固定, 常规切片,HE 染色,观察结构变化。结果 与对照组比较,模型组结肠溃疡面积显著增加。与模型组比较, 魔芋低聚糖高剂量组(100 mg·kg^-1)能显著缩小结肠溃疡面积。与对照组比较,模型组组织病理切片腺体缺失,上皮细胞排列不紧密,结构不完整,杯状细胞形态改变,黏膜层淋巴细胞浸润严重,黏膜下层水肿。与模型组比较, 魔芋低聚糖高剂量组黏膜层淋巴细胞浸润减少,有完整上皮细胞和腺体,但结构完整性仍不如对照组。结论 灌胃魔芋低聚糖对TNBS诱导的小鼠结肠炎具有显著的治疗作用。
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  T4.13 四种植物活性单体毒性剂量下对CHO细胞线粒体功能的影响

  赵晓红;孙健;刘涛;郭辰;栾娜

  2013, 27(S1): 127-128.

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  目的 研究竹叶黄酮中的代表性单体物质荭草苷、异荭草苷、绿原酸和阿魏酸对CHO细胞线粒体功能的影响,以了解四种单体都对线粒体的损伤作用及作用差别,并从中找出早期细胞损伤指标,为生物活性物质的毒理学研究及单体活性物质的开发提供科学依据。方法 选用正常中国仓鼠卵巢细胞(CHO),采用CCK-8法检测细胞增殖情况,采用回归中概率单位计算IC₅₀值。以IC₅₀、1/2IC₅₀值、1/4IC₅₀值、1/8IC₅₀值作为实验剂量,作用细胞24 h后,流式细胞仪测定线粒体膜电位、试剂盒法测定细胞内ATP含量变化、 Western blot检测细胞色素c的表达。结果 四种单体化合物作用于CHO细胞24 h后,CCK-8检测后计算得出IC₅₀值可以看出,四种单体化合物对细胞存活率的影响虽不同,但毒性不大。绿原酸、阿魏酸、荭草苷与异荭草苷四种单体化合物的IC₅₀值分别为:2857.36, 1685.47, 1883.76和2344.35 μmol·L^-1,以阿魏酸的毒性作用最大。不同剂量的四种单体对CHO细胞线粒体膜电位的影响的结果显示,与对照组比较,均在IC₅₀剂量下能引起线粒膜电位明显降低,但四种物质之间无明显差别。随剂量增加, 四种单体均引起细胞内ATP生成量逐渐降低, 与空白组比较,IC₅₀组细胞胞内ATP的生成减少差异显著或极显著;阿魏酸和荭草苷在1/2IC₅₀组也有显著差异,而在1/4IC₅₀候剂量下,四种单体作用产生的ATP与空白组比较均无显著性差异。不同剂量的四种单体化合物对细胞色素c释放的影响结果显示,与空白对照组比较,绿原酸与异荭草苷无明影响,阿魏酸与荭草苷在IC₅₀组有统计学差异,阿魏酸在1/2IC₅₀剂量组也具有显著性差异。结论 四种植物活性物质在细胞毒性剂量下均能引起细胞线粒体功能指标改变,以ATP含量变化最明显改变,阿魏酸的细胞毒性最大且对线粒体功能指标的影响也最明显,荭草苷和异荭草苷次之,绿原酸最小。
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  T4.16 奶源不同或销售地区不同的同一品牌配方奶粉对实验动物生长发育的影响

  许崇辉;温巧玲;潘芳;刘慧智;李华燕;程树军

  2013, 27(S1): 128-129.

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  目的 同一品牌的国产奶源的婴儿配方奶粉和进口奶源的婴儿配方奶粉、和同一品牌内地销售和香港婴儿配方奶粉分别喂养实验动物,研究比较不同奶源或不同销售地区的配方奶粉对实验动物生长发育过程和营养生物效应的差异。方法 刚断乳SD大鼠,通过饲料添加奶粉和饮奶液的方式,连续30 d喂养,观察实验动物的生长发育过程,检测实验动物的安全性和营养学指标。结果 受试品牌奶粉在实验动物体重和体重增长趋势、食物利用率明显高于各自的空白对照组(P<0.05或P<0.01);而不同奶源的配方奶粉和不同销售地区的配方奶粉,在动物生长发育过程、体重和体重增长趋势、食物利用率、血常规指标及血液生化指标都没有明显的差别。结论 同一品牌的国产奶源的婴儿配方奶粉和进口奶源的婴儿配方奶粉、和同一品牌内地销售和香港婴儿配方奶粉在实验动物上引起的营养生物效应是相同的,没有优劣之分。
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  T4.18 转Bt基因水稻TT51大鼠两代生殖毒性

  王二辉;于洲;方海琴;胡静;耿桂英;冯晓莲;徐海滨

  2013, 27(S1): 129-130.

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  目的 探讨转Bt基因水稻TT51对大鼠亲代生殖与子代发育的影响。方法 4周龄 F0 Wistar大鼠给以基础饲料喂养适应1周后,按体重随机区组分为AIN93G对照组、MingHui63组和TT51组,每组30只雌鼠15只雄鼠。饲喂相应饲料70 d后,各组雌雄大鼠于每晚18:00按雌雄比2:1合笼交配,次日晨7:00 做阴道涂片或者观察阴栓,在光学显微镜下观察到精子或者发现阴栓当天记为孕0 d,孕鼠单笼饲养。交配结束后处死F0代雄鼠,并进行相关检查。仔鼠出生后第4天调整到8只/窝,雌雄各半。至F1代断乳应保证每组不少于20窝。在交配期、妊娠期,直至子代F1断乳期间,F0代雌鼠持续给予受试物。F1代断乳后,给予相应受试物,重复上述过程并将一直延续到F2 代40 d。① 生殖指标:测定雄性大鼠的精子数量、精子活力和精子畸形率; 检测大鼠的血清性激素水平。记录F0和F1代大鼠生殖相关指标 (交配成功率、受孕率、妊娠时间和活产率、仔鼠出生成活率、窝平均仔鼠数、仔鼠雌雄比率、仔鼠出生平均体重)。记录大鼠生长发育期及雌鼠妊娠期和哺乳期体重、进食量并计算食物利用率;检测成年大鼠血常规、血生化指标,记录成年大鼠脏器系数并进行组织病理学检查。② 发育指标:仔鼠出生后仔鼠以窝为单位,检查全部F1和F2代仔鼠生理发育指标 (耳廓分离、门齿萌出、睁眼、阴道开放、睾丸下降) 和神经发育指标 (平面翻正、悬崖回避、空中翻正、前肢悬挂) 检查。各发育指标达标标准为:同窝所有仔鼠该项指标均达标的天数。每组观察20窝以上。仔鼠断乳后,腹腔注射3%戊巴比妥钠(50 mg·kg^-1)麻醉取材, 10%甲醛固定, HE染色对亲代和子代大鼠进行组织病理学检查。结果 转Bt基因大米TT51组与明恢63大米组相比,上述各项指标均无显著性差异;与对照组相比,部分血液与生化指标和性激素水平存在显著差异,但不具有生物学意义。各组组织病理学检查均未见异常改变,因此未见转Bt基因大米对大鼠生殖系统的结构和功能产生不利影响。转Bt基因大米组与明恢63大米组和市售组比较,F1和F2代早期部分生理发育指标和神经发育指标未见显著差异。结论 与对照和亲本相比转Bt基因水稻对大鼠繁殖能力和子代早期部分发育指标的影响无显著性差异。
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  T4.20 食用小龙虾(克氏鳌虾)对大鼠的急性毒性作用

  梁婕;吕中明;施伟庆;俞萍;石根勇;赵荣;徐德洲;陈耿;陆罗定;董蓉莲;卞倩;王民生

  2013, 27(S1): 130-131.

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  目的 探讨食用小龙虾(克氏鳌虾)对大鼠的急性毒性作用,提供大鼠对食用小龙虾的最大耐受量(MTD)和相关生理和病理指标的数据,为类推到人群食用小龙虾等水产品致横纹肌溶解综合征的疾病发生过程和病因学研究提供依据。方法 对从盱眙和南京各采集的食用小龙虾商品虾分两批次试验。第一批次将5 kg商品虾分别剥出虾肉和虾黄两个可食部分,匀浆后作为受试物,给予SD大鼠1次灌胃、2次灌胃(每次灌胃之间间隔4 h)急性毒性试验。第二批次将5 kg商品虾分为两组,一组直接剥出可食部分,一组煮熟后剥出可食部分,分别匀浆后给予SD大鼠1次灌胃急性毒性试验。对照组灌予纯净水作为受试物,每组大鼠20只,雌雄各半,每次灌胃容积均为最大灌胃量(10 ml·kg^-1)。各实验组和对照组大鼠灌胃后5 h采血检测其红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白等血液学指标;与横纹肌溶解综合征密切相关的肌酸激酶、乳酸脱氢酶、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶等生化指标。同时对各组大鼠进行大体解剖,对心、肝、脾、肾、胸腺等重要脏器进行组织病理学检查并计算脏器系数。结果 与各自的对照组相比,两批次多个实验组雌雄大鼠在血常规和白细胞分类,以及与横纹肌溶解综合征密切相关的生化指标均未发现有明显的差异,各实验组大鼠的脏器系数均无明显差异。病理组织学检查结果未发现试验组大鼠心、肝、脾、肾、胃、十二指肠、胸腺等脏器出现与食用小龙虾急性毒性试验明显相关的组织病理改变。各试验组动物经口给予不同剂量的小龙虾可食部分,折算成小龙虾的生虾重量(耐受剂量)相当于42~385 g生虾/kg。由此推算到人,成人按60 kg体重计算,则达到每人2.52~23.1 kg,远超过人正常一次性摄入量。结论 未发现食用小龙虾(克氏鳌虾)对SD大鼠的明显急性毒性作用,人群食用小龙虾等水产品致横纹肌溶解综合征的疾病发生过程和病因学研究有待进一步探讨。
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  T4.22 维康粉安全性研究

  王丽云;陈耿;肖竟;赵荣;施伟庆;陆罗定

  2013, 27(S1): 131-132.

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  目的 维康粉由L-精氨酸、维生素C、玉米低聚肽粉、L-瓜氨酸、还原型谷胱甘肽、叶酸、α-硫辛酸、乙基麦芽糖等为原料,经充填分装而成,成人推荐剂量为5 g·d^-1,即83.3 mg·kg^-1。为保障消费者使用安全,对维康粉进行毒理学安全性评价。方法 按卫生部《食品安全性毒理学评价程序和方法》(2003)进行。结果 维康粉急性毒性试验最大耐受剂量(MTD)大于15000 mg·kg^-1,根据急性毒性分级标准属无毒级。① 维康粉2.5, 5和10 g·kg^-1组,雌、雄小鼠骨髓细胞微核发生率为0.22%~0.24%,3个剂量组小鼠睾丸染色体畸变率分别为0.4%, 0.2%和0.4%。表明维康粉剂量达10 g·kg^-1未检出对雌雄小鼠骨髓嗜多染红细胞的致微核作用和对雄性小鼠睾丸初级精母细胞染色体的诱变活性。② 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验(平板掺入法),剂量达5 mg/皿无论加及不加S₉,两次试验样品各剂量组的回变菌落数均未高于自发回变的2倍,亦无剂量效应关系,对标准测试菌TA97, TA98, TA100和TA102均无直接和间接诱变作用。③ 30 d喂养试验将大鼠随机分入 0, 2083, 4167和8333mg/kg(相当于推荐剂量的25, 50和100倍)各4个剂量组,每组20只,雌雄各半。维康粉推荐使用剂量5 g·d^-1,在饲料中掺入量>5%,在各剂量组饲料中分别添加了酪蛋白83.4, 167和333 g(蛋白含量按20%计算),以补充蛋白质到与对照组相当的含量,以约每日100 g·kg^-1的摄食量给予大鼠自由食用按上述比例拌制的喂饲料。测定指标为生长发育,食物利用率, 血红蛋白(HGB)、红细胞总数(RBC)、血小板总数(PLT)、白细胞总数(WBC)及中性粒细胞(NE)、淋巴细胞(LY)、单核细胞(MO)、嗜酸细胞(EO)、嗜硷细胞(BA)分类。肝、肾、脾、睾丸脏体比,丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖((GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG),大体解剖和肝、肾、脾、胃、小肠、睾丸、卵巢病理组织学检查。30 d喂养结果显示,雌雄大鼠各剂量组动物活动、生长正常;体重、增重、摄食量、食物利用率、肝、肾、脾、睾丸绝对重量、肝/体,肾/体,脾/体,睾/体比、WBC、PLT、LY、MO、AST、ALT、CRE、TG、GLU、TP、ALB值与对照组值相比均无显著性差异(P>0.05);高剂量组雌鼠RBC值和HGB及雄鼠NE值升高(P<0.05)和低剂量组雄鼠BA值升高(P<0.05);低和高剂量组雌鼠CHO值下降(P<0.05);高剂量组雄鼠CHO值升高(P<0.01),上述血液和生化指标的改变仍在本实验室历史正常值范围内,且无剂量-反应关系,故不认为具生物学意义。大体解剖和病理组织学检查,肉眼检查均未见明显异常,高剂量组镜下见雌鼠2例和雄鼠1例肝叶边缘局部肝细胞轻度脂肪变性,雄鼠1例肝叶门管区轻度炎细胞浸润。雌鼠1例胃黏膜局部轻度炎细胞浸润。其余大鼠、肾、胃、十二指肠、脾、性腺均未出现与维康粉明显有关的组织病理学改变。连续30 d喂养雌雄大鼠实际摄入维康粉量分别为11 703, 11 319 mg·kg^-1(实际摄入量相当于推荐剂量35, 70和140;33, 70和135倍)。结论 维康粉急性毒性属无毒级,未见潜在致突变作用、30 d喂养未见明显毒性。
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  T4.25 染料木黄酮对哺乳动物卵母细胞成熟的影响

  张岭;王茵

  2013, 27(S1): 133-134.

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  染料木黄酮(GEN)是人类接触较多的一种植物雌激素。习惯食用大豆及其制品的亚洲人群的GEN摄入量较高,可达1 mg·kg^-1;大豆蛋白婴儿配方奶粉则可使染料木黄酮的摄入水平增加10倍左右(6~11 mg·kg^-1)。大量证据表明,GEN可对哺乳动物的雌性生殖功能产生不良影响。健康的成熟卵母细胞是维持正常受精、胚胎形成和发育的物质基础。有研究表明,GEN可干扰卵母细胞的生成和成熟过程。GEN可抑制小鼠卵母细胞的体外成熟启动;若在生发泡破裂(GVBD)后行染毒,GEN可抑制第一极体(PB1)排出和MII期细胞的皮质颗粒释放。GEN对卵母细胞成熟抑制作用与卵母细胞成熟生理抑制剂次黄嘌呤的作用相似。用GEN对小鼠进行染毒后,体外培养成熟的卵母细胞的受精率也明显降低。该研究中GEN的最高剂量不超过1.0 mg·kg^-1。有证据提示雌激素样活性或雌激素受体可能介导外源性化学物对卵母细胞成熟的影响。GEN可干扰体内雌激素水平。有研究表明,生理剂量GEN处理新生小鼠后,青春期前后的血浆雌激素水平未见变化。但体外卵泡培养发现,低剂量(0.1 nmol·L^-1)的GEN可降低卵泡内雌激素水平,而高剂量(1 nmol·L^-1)的GEN则可升高雌激素水平。此外,人体在摄入GEN后,血浆中GEN的绝对水平远高于雌激素,故GEN在体内的雌激素样活性也不容忽视。此外,有一项研究表明,用GEN处理小鼠后,卵泡膜细胞中的ERα表达明显升高,而将ERβ基因敲除可防止GEN诱导的多卵卵泡形成,提示两种ER在GEN影响卵母细胞发育中有重要作用。通过上面分析可见,GEN可干扰卵泡内雌激素稳态,影响ER的表达。鉴于雌激素活性和ER在卵母细胞成熟中的可能作用,我们推测GEN对雌激素水平和(或)ER表达的干扰可能是GEN影响卵母细胞成熟的作用机制之一,值得我们更深入探讨。
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  T4.27 生育三烯酚抑制结肠癌细胞增殖中Notch信号蛋白的表达及意义

  何宁;张静姝;刘英华;姜淑卿;张静;管彤;王晓军;张书婧

  2013, 27(S1): 135-135.

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  目的 探讨δ-生育三烯酚对人结肠癌细胞 SW620 细胞增殖抑制作用,研究Notch信号通路中关键蛋白在δ-生育三烯酚抑制结肠癌细胞增殖中的表达及意义。方法 (1) 观察δ-生育三烯酚抑制结肠癌细胞增殖的作用(MTT试验)。接种于24孔板的人结肠癌细胞SW620进入对数生长期后,将SW620换成给予不同浓度的δ-生育三烯酚(终浓度为0, 5, 10, 15, 20, 25和30 μmol·L^-1)的培养基,溶剂对照组为无水乙醇,继续于相同条件下培养24 h后,加入MTT溶液,继续培养4 h,酶标仪检测各孔OD值,并计算细胞存活率。(2) 通过免疫细胞化学方法检测Notch信号通路关键蛋白Notch, Jagged的表达变化。(3) 放线菌酮(CHX)对生育三烯酚抑制结肠癌细胞增殖作用的影响。接种于24孔板的人结肠癌细胞SW620进入对数生长期后,加入CHX的完全培养液,37℃培养1 h后,加入终浓度为20 μmol·L^-1的δ-生育三烯酚,上述方法进行MTT试验,并计算细胞存活率。结果 (1) 在5, 10, 15, 20, 25和30 μmol·L^-1的剂量范围内,随着δ-生育三烯酚浓度的增加,SW620细胞的存活率呈显著下降的趋势,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2) Notch信号通路关键蛋白Notch1在生育三烯酚作用一定剂量范围内表达量降低,Jagged1蛋白随着生育三烯酚作用剂量的增加,其的表达量在一定剂量范围内逐渐降低。(3) 经放线菌酮CHX处理过的细胞,再加入δ-生育三烯酚,作用24 h后,细胞存活率较单独加入生育三烯酚作用的细胞存活率显著增高,结果有统计学意义。结论 δ-生育三烯酚抑制人结肠癌细胞SW620增殖的过程与Notch信号通路的激活有关,细胞的死亡的方式可能为paraptosis样死亡。
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  T4.30 THI对免疫系统影响的研究综述

  姜思源;吴双;尚兰琴;郝卫东

  2013, 27(S1): 136-137.

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  焦糖色是一种复杂的混合型化合物,其生产工艺分为四类:Ⅰ类为普通法、Ⅱ类为加亚硫酸盐生产、Ⅲ类为加氨生产、Ⅳ类为亚硫酸铵法。2-乙酰基-4-(1R,2S,3R)-1,2,3,4-四羟基丁基)咪唑(THI)是Ⅲ类焦糖色生产加工过程中产生的一种副产物。20世纪70年代的一些毒性研究表明Ⅲ类焦糖色能引起大、小鼠淋巴细胞计数减少,扰乱啮齿类动物免疫功能及降低传染病模型动物的抵抗力,尤其是当实验动物的饮食中维生素B6含量较低时。之后研究发现上述对免疫系统的影响是由THI产生的。THI主要引起啮齿类动物外周血、淋巴结和脾脏淋巴细胞数的可逆性减少,在停止给药后,淋巴细胞数目恢复正常。对其机制的研究得出THI引起淋巴细胞减少的三种可能途径:① THI使得血和脾脏中的B细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞迁移并滞留于肝脏、肺及肾等非免疫器官中,THI给药中止后,这些细胞又重新出现于血液和脾脏中,表明THI能够可逆性调节淋巴细胞的再循环与向脾脏的归巢;② THI阻碍成熟CD4⁺和CD8⁺T细胞由胸腺输出,因此新迁移至淋巴结和脾脏等处的成熟淋巴细胞减少;③ THI降低淋巴组织中1-磷酸鞘氨醇裂解酶活性,使得1-磷酸鞘氨醇水平升高,从而引起外周淋巴细胞减少。由于焦糖色可作为着色剂用于酱油、醋、糖果、饮料、酒等食品中,因此也曾有Ⅲ类焦糖色对人体的免疫毒性研究。结果表明,轻度缺乏维生素B6的人在每天摄入200 mg·kg^-1(ADI,1992) Ⅲ类焦糖色7 d后,血液淋巴细胞数目没有减少,即未发现Ⅲ类焦糖色和THI对人体有免疫毒性。另有研究表明低剂量的THI无长期毒性,且具有免疫抑制活性。已有试验证明THI可以作为免疫抑制剂,例如THI能有效抑制接触性过敏反应,其机制可能是通过组胺样受体位点改变脾细胞功能或阻止引流淋巴结中CD4⁺T细胞的招募;THI还可降低淋巴组织中1-磷酸鞘氨醇裂解酶活性,使得1-磷酸鞘氨醇水平升高,从而引起外周淋巴细胞减少,推测其可用于治疗自身免疫疾病。
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  T4.33 酶联免疫吸附法测定粮食中真菌毒素

  戚红卷;王莉莉;安代志;靳连群;刘雪林

  2013, 27(S1): 137-138.

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  目的 ELISA测定米面中玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、及脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)三种毒素的方法学进行验证。验证内容包括标准曲线的线性、各种毒素的最低检测限、加标回收率及加标回收精密度,同时考察样品前处理方法。方法 倍肯BK-iRT(B型)数字化食品安全快速检测系统,以及ZEN, AFB1及DON ELISA快速检测试剂盒(倍肯恒业科技发展有限责任公司);大米、面粉(古船牌,购自超市);ZEN, AFB1及DON标准品(购自Fermentek公司)。样品前处理方法:称取少量粉碎的大米或面粉样本,置于离心管中,加入样品提取液,震荡混匀;离心取上清,用样品稀释液稀释并涡旋混匀,待用。检测步骤包括:试剂回温、微孔板编号、加标准品/样本、洗板、显色、上机测定及数据处理。结果 三种毒素的标准曲线线性相关系数均大于0.99;ZEN, AFB1及DON的最低检测限分别为41, 1.69及184 μg·kg^-1,均远低于食品中真菌毒素限量国家标准;平均加标回收率在80%~100%之间;加标回收的相对标准偏差(RSD)在10.0以内;样品前处理方法统一,前处理时间大约30 min。结论 倍肯BK-iRT(B型)数字化食品安全快速检测系统及配套试剂盒对粮食中真菌毒素检测的样品前处理简单、检测速度快、结果准确性高,具有较强的适用性。
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  T4.35 二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯在免疫毒理学中的应用

  陈锦瑶;张立实

  2013, 27(S1): 139-139.

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  将二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯 (CFDA-SE)结合流式细胞术的淋巴细胞增殖试验结果与传统的检测针对有丝分裂原的T淋巴细胞增殖的结果有良好的相关性,且省时省力,可避免传统的TdR掺入法的放射性污染,还可对特殊淋巴细胞亚群设门,在体内/体外追踪某个亚群的淋巴细胞增殖,并研究细胞分化/调亡相关活化分子和(或)细胞内蛋白的表达。CFDA-SE亦可用于检测细胞混合样本中的死亡细胞,即先用CFDA-SE标记靶细胞,再用可标记死亡/调亡细胞的染料PI或7-AAD标记混合样本,以检测死亡的靶细胞,此技术可定量、敏感、客观的检测受试物对靶细胞的细胞毒作用。已有研究将其应用于人外周血淋巴细胞、大/小鼠淋巴细胞的细胞杀伤活性检测。还有研究使用CFDA-SE/7-AAD双染和与细胞杀伤能力 的传统测试方法⁵¹Cr释放法同时测定大鼠CD95介导的细胞杀伤能力,结果显示两法所得结果具有较好的相关性,且CFDA-SE/7-AAD双染法更为灵敏。另一项研究应用CFDA-SE/PI染色测定了从大鼠外周血中分离出的NK细胞的杀伤活性,结果表明该方法准确性较好,可将其应用于常规的免疫毒理学动物试验中。本实验室近期研究中已证实以一定浓度CFSE-DA染料负载淋巴细胞,其荧光染色稳定、不易渗漏沾染,且在所选剂量范围内不影响细胞增殖;并将CFDA-SE染色方法测定淋巴细胞增殖及NK细胞杀伤活性的方法结合应用于食品中农药残留的免疫抑制作用评价的动物实验中,结果表明该方法与目前国内常用的MTT方法所得结果的一致性较好,且更为直观灵敏。
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  T5.11 重离子诱导端粒延长作用

  张睿凤;王超;郭月凤;刘建功;刘红艳;张忠新;原雅艺;任越;段志凯

  2013, 27(S1): 148-149.

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  目的 探讨重离子对人体淋巴细胞端粒长度的影响,从而进一步了解端粒在辐射损伤以及修复中的作用。方法 将培养人淋巴细胞按照射剂量分为0.1, 0.5, 1.0和2.0 Gy实验组及0 Gy对照组,使用¹⁴C重离子(中国科学院近代物理研究所)照射,剂量率为0.3~0.5 Gy·min^-1,实验组按照后时间分为2, 12, 24, 48和72 h组。提取各样品基因组DNA, 采用荧光实时定量PCR检测端粒相对长度,样品包含待测基因组DNA和对照单拷贝基因36B4(位于12号染色体)。所有样本均进行两组扩增,一为端粒片段(T) 扩增,一为参照基因(S) 扩增。荧光实时定量PCR反应条件为:95℃10 min,95℃15 s,54℃120 s,30个循环。结果 培养人淋巴细胞经重离子照射后0.1 Gy组相对T/S比率介于1.06~1.24,0.5 Gy组相对T/S比率介于1.01~1.38,1 Gy组相对T/S比率介于1.24~1.66,以上各组较对照组0Gy组均有不同程度的增加,并且随时间延长相对T/S比率呈现上升趋势,到72 h达到最大值,2 Gy组相对T/S比率于2, 12和24 h分别为0.95, 0.98和 0.97,较对照组未见明显增加,48 h相对T/S比率为1.13,到72 h达到1.33,同样出现上升趋势。比较24, 48和72 h三个照射后时间组不同剂量的相对T/S比率结果显示,1 Gy剂量组的相对T/S比率在各时间组均出现峰值,分别为1.24, 1.25和1.66较0.1, 0.5以及2 Gy时增加。结论 重离子可以诱导淋巴细胞端粒延长,并具有一定的剂量依赖性和时间依赖性,其可能在辐射损伤修复中发挥重要作用。
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  T20.64 基于TLP功能障碍的硝化应激介导血管内皮细胞损伤分子机制

  陶蓉蓉;陆楠楠;洪玲娟;黄继云;王欢;廖美华;楼宜嘉;韩峰

  2013, 27(S1): 392-392.

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  目的 探讨硝化应激介导脑血管内皮细胞损伤的分子毒理学关联机制。方法 采用Peroxynitrite 供体(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)和糖氧剥夺(OGD)处理血管内皮细胞,构建血管内皮细胞硝化应激损伤模型;免疫印迹法及免疫共沉淀法考察血管内皮细胞硝化应激损伤引起相关蛋白水平变化;免疫荧光法考察相关蛋白的分布变化及相互关联性。结果 硝化应激介导血管内皮细胞TLP蛋白表达快速上升,增强血管内皮细胞抗氧化防御体系功能,与细胞免疫荧光结果一致。但随着硝化应激的不断加剧,TLP蛋白后期反而呈下降的趋势。与此同时,免疫印迹结果表明硝化应激后期血管内皮细胞TLP蛋白在大分子量处呈现明显的聚集堆积现象并呈现SIN-1浓度依赖性地增强。结论 血管内皮细胞硝化应激损伤病理过程中,TLP表现为明显的应激反应蛋白特征,具有很好的维持血管内皮细胞氧化-还原系统稳态功能。过度硝化应激介导使得TLP发生降解,从而导致氧化-还原系统稳态失衡,加重了血管内皮细胞损伤病理进程。
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  T20.66 无机砷及其代谢物对人成纤维细胞的毒性作用

  吴顺华;陈文军;李静

  2013, 27(S1): 393-393.

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  目的 体外培养人真皮成纤维细胞,用无机砷及其代谢物进行染毒,观察染毒后细胞增殖、周期及凋亡,并检测DNA修复相关的XPA, XPC, PARP1和ERCC3基因的表达变化,探讨砷及其代谢物导致细胞皮肤损伤的分子机制。方法 取8例6~10岁健康儿童志愿者包皮组织进行原代培养、分离人真皮成纤维细胞。传代培养至第10代后,分别以无机砷化合物亚砷酸钠(Na₂AsO₂)、二甲基胂酸(DMA^Ⅴ)、单甲基胂酸(MMA^Ⅲ)进行染毒,混匀分为4组,即高、中、低、对照组。在72 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,检测不同浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ和MMA^Ⅲ(0, 5, 10, 15和25 μ mol·L^-1)对人真皮成纤维细胞体外增殖的变化。流式细胞仪(Flow cytometer)检测不同浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ和MMA^Ⅲ(0, 5, 15和25 μmol·L^-1)刺激人真皮成纤维细胞的凋亡和周期变化状况。通过实时荧光定量(PCR)检测不同浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ和MMA^Ⅲ(0, 5, 15和25 μmol·L^-1)刺激人真皮成纤维细胞后,修复基因XPA, XPC, PARP1和ERCC3的表达水平。结果 人真皮成纤维细胞通过MTT比色法检测得出结果:和对照组对比,人真皮成纤维细胞经不同浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ刺激后,吸光度值发生变化,存在剂量-反应关系(P<0.05);用0, 5, 15和25 μmol·L^-1的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ的浓度作用人真皮成纤维细胞,G₀/G₁期细胞比例明显下降(P<0.05),G₂/M期和S期细胞比例较对照组明显增加(P<0.05);高、中剂量iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ处理组细胞G₁期细胞所占百分数增多,提示细胞在G₁期出现阻滞的趋势,G₂和S期细胞所占百分数较少。XPA, XPC, PARP1, ERCC3在iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ药物作用下,mRNA在0~10 μ mol·L^-1浓度的表达量出现上升趋势,而随着iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ药物作用浓度的增加,在15~25 μmol·L^-1浓度的mRNA表达量显示有下降趋势,有统计学意义(P<0.05)。结论 在细胞增殖试验中,不同浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ诱导人真皮成纤维细胞后,吸光度产生了明显的变化,0~10 μmol·L^-1浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ对人真皮成纤维细胞有促进细胞增殖作用,而15~25 μmol·L^-1浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ对人真皮成纤维细胞有抑制细胞增殖作用。0~10 μmol·L^-1浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ对人真皮成纤维细胞促进XPA, XPC, PARP1和ERCC3基因的表达,15~25 μmol·L^-1浓度的iAs^Ⅲ, DMA^Ⅴ, MMA^Ⅲ对人真皮成纤维细胞抑制XPA, XPC, PARP1和ERCC3基因的表达。
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  T20.68 1-溴丙烷吸入染毒对大鼠海马及血液miRNA表达谱的影响

  王海兰;蒋柳权;李宏玲;赵娜;宋向荣

  2013, 27(S1): 394-395.

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  目的 明确1-溴丙烷(1-BP)的毒性作用机制,寻找能够反映1-BP毒性的生物标志物。方法雄性Wistar大鼠整笼放入动式吸入染毒柜内染毒浓度为1-BP 1250, 2500和5000 mg·m^-3,每天8 h,每周染毒5 d,休息2 d,连续4周。染毒结束后次日,将大鼠麻醉后测定大鼠左右两侧坐骨神经传导速度;分离左右大脑半球、海马、小脑和脑干,称重后放入保存管在液氮中将组织迅速冷冻后转移至-80℃冰箱保存。对每组3只大鼠的海马组织和3只大鼠的全血进行miRNA芯片检查。微阵列实验由LC Sciences公司进行。杂交反应利用微循环泵的循环作用在μParaflo微流体芯片上过夜进行。RNA与探针杂交后,与标记特异结合的Cy3和Cy5染料在微流体芯片上循环流动进行染色。利用激光扫描仪采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件进行图像数字化转换。数据分析首先是减除背景值,然后使用LOWESS过滤进行信号归一化。对于双色标记实验,将计算两种检测信号的比值(log2 转换)和t检验。结果 4周暴露结束后,各染毒组大鼠左右侧运动和感觉神经传导速度均低于对照组,运动末端潜伏期较对照组延长。miRNA芯片检查发现在海马组织miRNA有5个表达上调, 9个表达下调(P<0.05);在血液miRNA有19个表达上调, 19个表达下调(P<0.05)。其中miR-133b-5p和miR-377-3p在海马和血液中均与暴露水平具有密切关联。结论 1-BP暴露降低大鼠坐骨神经传导速度,引起海马和血液miRNA表达谱的改变。miR-133b-5p和miR-377-3p可能与其神经毒性机制有关。
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  T20.70 氯喹对肾小管自噬的影响

  徐玉英;许淑珍;徐钦;郑一凡;朱心强

  2013, 27(S1): 395-396.

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  目的 观察临床应用剂量下的氯喹(CQ)对肾小管自噬的影响及其肾毒性,为拓展CQ的临床应用奠定基础。方法与结果 ICR小鼠每2 d灌胃给予CQ 0, 5, 20和40 mg·kg^-1,持续1个月。CQ 40 mg·kg^-1组中可见肾小管上皮细胞空泡化、水肿、坏死,脱落到管腔,甚至出现裸基膜;肾间质炎症细胞浸润,胶原蛋白增多。随着CQ浓度的升高,肾小管上皮细胞p6蛋白表达和TRPM2蛋白表达变化不大,肾小管上皮细胞p62蛋白表达增多,LC3蛋白表达降低。综上所述,本部分研究结果表明,CQ抑制肾小管上皮细胞基础自噬,肾小管上皮细胞发生水肿、坏死。根据ICR小鼠研究结果,选择CQ 20 mg·kg^-1作为长期给药的剂量,以饮食限制(DR)诱导自噬和二乙基亚硝胺(DEN)/苯巴比妥(BP)诱导氧化应激进行预处理1周,然后腹腔注射给予CQ,观察CQ作用6个月和8个月后对肾小管上皮细胞自噬的影响。C57小鼠给予CQ 20 mg·kg^-1 CQ 8个月后,肾间质明显充血,肾小管上皮细胞水肿,体积大,胞浆丰富。CQ给予6个月和8个月时,肾小管上皮细胞p6蛋白表达增加;而TRPM2在6个月时增加不明显,在8个月时明显增加。在6个月和8个月的正常对照组中肾小管上皮细胞的p62和LC3蛋白水平很低。给予CQ 6个月,肾小管上皮细胞的p62和LC3变化不明显,但给予CQ 8个月后,肾小管上皮细胞p62和LC3表达明显增加,肾小管管腔内p62表达明显增加。与CQ组相比,DR+CQ组肾小管管腔内并没有表达p62,肾小管上皮细胞表达p62降低、LC3增加;DEN/BP+CQ组肾小管及其管腔内的p62表达更多,肾小管LC3表达增加。与CQ组相比较, DEN/BP和DR进行预处理后,CQ并没有使肾小管管腔内表达p62。结论 CQ抑制肾小管上皮细胞自噬,氧化应激可以促进CQ的毒性作用,而促进自噬可以抑制CQ的毒性作用。
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  T20.82 ROS依赖性p53活化在Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞早衰中的作用研究

  肖芳;曾明;王安;关岚;刘新民;罗磊;谢颖;钟霞丽;钟才高

  2013, 27(S1): 401-402.

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  目的 探讨ROS依赖性的p53活化在Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞早衰中的作用机制。方法 用低剂量Cr(Ⅵ) 处理L-02肝细胞,SA-β-Gal染色检测早衰的发生;流式细胞术分析细胞周期;用氧化敏感型荧光探针CM-H2DCFDA在荧光显微镜下检测ROS水平;检测Cr(Ⅵ)诱导的早衰肝细胞中线粒体呼吸链复合体(MRCC)Ⅰ~Ⅴ活性;检测有或无抗氧化剂NAC预处理时Cr(Ⅵ)作用后肝细胞中p53 mRNA表达水平、p53磷酸化蛋白水平以及衰老通路(p53-p21和Rb-p16)蛋白水平、肝细胞中促存活基因以及细胞周期S期相关蛋白表达水平;为证实是否ROS诱导早衰的功能依赖于p53,本研究用脂质体转染在肝细胞中敲除p53后检测Cr(Ⅵ)诱导肝细胞早衰发生以及衰老细胞百分比;检测p53敲除对Cr(Ⅵ)暴露后肝细胞中促存活基因以及细胞周期S期相关蛋白表达水平的影响。结果 低剂量长期Cr(Ⅵ)暴露引发L-02肝细胞发生早衰。早衰细胞出现明显的S期细胞周期阻滞,SA-β-Gal活性明显增高。早衰细胞中Cr(Ⅵ)选择性抑制MRCCⅠ和MRCCⅡ而诱导ROS的大量堆积。衰老细胞中磷酸化p53(ser 15)明显升高,p53被明显激活, NAC预处理明显降低了对照组和早衰细胞中p53水平,提示ROS可以对p53进行转录调控。对Cr(Ⅵ)诱导的早衰肝细胞中衰老通路的分析发现p53-p21通路,而不是Rb-p16通路参与了肝细胞早衰的过程。早衰细胞中ROS调节p53后进而调节促存活基因Bcl-2和Mcl-1的表达而抑制肝细胞的增殖能力,通过调节S期相关蛋白CDK2和Cyclin E进而诱导S期细胞周期阻滞。NAC预处理明显抑制了细胞早衰的发生。肝细胞中敲除p53后发现p53的缺失抑制早衰的发生。虽然Cr(Ⅵ)处理后的L-02-p53 shRNA细胞未发生早衰,但其ROS生成量仍明显增高,证实Cr(Ⅵ)诱导的L-02细胞发生早衰依赖于ROS,而ROS功能的发挥依赖于p53。结论 低剂量长期Cr(Ⅵ)暴露引发L-02肝细胞发生早衰,p53-p21通路参与早衰过程。Cr(Ⅵ)诱导产生的ROS通过调节促存活基因以及S期相关蛋白而诱导S期周期阻滞。敲除p53的肝细胞经Cr(Ⅵ)诱导后不发生早衰,提示早衰的发生依赖于ROS-p53功能。
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  Toxicity testing in the 21st century：taking a pathway-led approach

  Paul L CARMICHAEL

  2013, 27(S1): 406-407.

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  In 2007, the US National Research Council's publication‘Toxicity Testing in the Twenty-First Century (TT21C): A Vision and a Strategy’(Krewski et al 2010) outlined an approach to safety assessment that‘could transform toxicity testing from a system based on whole-animal testing to one founded primarily on in vitro methods that evaluate changes in biologic processes using cells, cell lines, or cellular components, preferably of human origin’. At the core of this vision is an understanding of key biological pathways (termed‘toxicity pathways’in the original report) which, if sufficiently perturbed by a chemical, would result in an adverse outcome for the exposed human/environment. More recently, this concept of pathways-based approaches to risk assessment has been built upon by the description of‘Adverse Outcome Pathways’(AOPs). Each AOP begins with a Molecular Initiating Event (MIE) in which the chemical interacts with a biological target leading to a sequence of events across different levels of biological organisation (Ankley et al, 2010). The OECD has begun to formalize the use of this framework based on AOPs to capture and peer review the mechanistic understanding of specific toxic effects for the evaluation of non-animal methods (OECD, 2011). Our goal has been to take the above strategy and vision from the conceptual, to the practical;developing the necessary steps to use the TT21C/AOP foresight as the basis for the safety assessment of new ingredients in consumer products, without animal testing. Recently, members of a work-team in the Transatlantic Think Tank of Toxicology (t⁴) produced a workflow on how to implement TT21C for a given ingredient (Blaauboer et al ATLA in preparation). The workflow begins with the chemical of concern and some initial assessment of the route of, and the extent of exposure. However, the toxicity pathways of relevance must be identified for that particular agent. This will require a combination of both in vitro high-throughput screening (HTS) for pathway inference, and chemical profiling through chemico-informatics. HTS methods involve screening to identify particular stress/toxicity pathways activated in potentially adverse responses. Additionally, specific receptor screening methods may be needed, as well as faster-throughput transcriptomics, bioinformatics and connectivity mapping of biologically relevant networks associated with the chemical agent or its analogues. The concurrent chemical profiling can be at the level of‘expert knowledge’on the potential chemical impacts and putative molecular initiating events (MIE) associated with the parent chemical and expected metabolic products, plus quantitative structure-activity relationship (QSAR) alerts. The resulting output of these steps is a decision on the stress/toxicity pathways that are most likely to be affected by the chemical and/or any specific agonist- or antagonist-ligand events at G protein, tyrosine kinase, ion-channel or nuclear receptors. These outputs will therefore guide the selection, development and use of appropriate in vitro assays needed to adequately characterise the in vitro concentration response. It is important to note that in vitro biokinetics will be required to understand, measure or model the free concentration of the test compound in the in vitro system(s), so that meaningful dose response curves can be constructed. It is anticipated, however, that these assays will not be sufficient in their own right to define the required in vitro adversity point of departure (POD) concentration;they will be used in conjunction with computational systems biology models that will more completely overview the network/pathways of concern. An iterative synergy between the two will be created where the shortcomings of the in vitro systems/assays will be compensated for by the in silico network and, in turn, the assay outputs will feed and improve the model network. A decision will then be made on the most sensitive and appropriate POD concentration that can factor into a biokinetic model that has been previously populated with appropriate physicochemical parameters. A quantitative in vitro to in vivo extrapolation (QIVIVE) can then be performed to make a decision on the in vivo human safety estimation.
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  T9.35 纳米二氧化硅颗粒对16HBE支气管上皮细胞毒性作用

  李艳博;郭彩霞;于洋;李阳;孙志伟

  2013, 27(S1): 231-231.

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  目的 研究纳米二氧化硅颗粒对支气管上皮细胞的毒性。方法 本实验以体外培养的人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial cells)16HBE为模型,对暴露于纳米二氧化硅颗粒可能产生的生物学效应及其机制进行初步的探索。MTT法测定细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞膜的完整性;实时荧光定量PCR法检测细胞内氧化还原相关的核转录因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA水平,以及细胞内炎症相关的白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)和细胞间粘附分子1(ICAM-1)mRNA水平的变化。结果 纳米二氧化硅颗粒对支气管上皮细胞毒性作用存在明显的剂量依赖关系。纳米二氧化硅颗粒作用于16HBE细胞,可引起细胞存活率下降,且随着作用剂量的增加,细胞存活率逐渐下降(P<0.05),其中50 mg·L^-1剂量作用24 h后细胞存活率下降至69.65%。纳米二氧化硅颗粒可引起细胞膜完整性的改变,导致培养液中LDH释放增加,且随颗粒作用剂量的升高而逐渐升高,呈现一定的剂量依赖关系(P<0.05)。同时,50 mg·L^-1纳米二氧化硅颗粒作用下,细胞内氧化还原相关因子Nrf2, HO-1和SOD2 mRNA表达水平显著升高,炎性细胞因子IL-6和IL-8 mRNA表达水平显著升高,而ICAM-1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。结论 纳米二氧化硅颗粒对支气管上皮细胞存在明显的细胞毒性作用,且呈现明显的剂量依赖性,可降低细胞存活率,引起细胞膜完整性的改变,调节细胞内氧化还原相关、炎症相关基因转录,导致细胞氧化还原失衡及炎症的发生。
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  T9.36 纳米材料的毒理学效应及其关键影响因素

  陈春英;徐莺莺;王鹏

  2013, 27(S1): 231-232.

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  纳米材料的一般定义为, 至少在一维尺度上长度小于100 nm的材料。纳米材料具有特殊的性质, 包括量子尺寸效应、表面效应以及宏观量子隧道效应等。这些特性赋予纳米材料不同于块体材料的新的物理化学性能。随着纳米技术的发展, 越来越多的应用了纳米材料的纳米产品开始进入人们的日常生活, 纳米材料的毒性因此成为人们日渐关注的问题。对纳米材料的毒性效应研究衍生出纳米科学的一个重要分支学科: 纳米毒理学。纳米毒理学的概念在2003-2005年间提出, 这一领域主要研究纳米材料与生物体系, 包括组织、器官、细胞、亚细胞结构以及生物大分子的相互作用及其引起的毒性效应。阐明纳米材料对生物体的影响及其作用机制, 对于纳米材料的合理设计和安全应用具有重要的指导意义。近年来, 纳米材料毒性的研究取得了很大进展, 包括体内和体外实验研究纳米材料与生物大分子、细胞、器官和组织的相互作用以及其引起的毒性。大多数纳米材料通过诱导氧化应激和炎症反应等机制产生一系列毒性效应。例如,在诸多影响碳纳米管毒性评价的因素中,碳纳米管的长度和金属杂质被认为是重要因素。我们发现不同种类金属残留物可诱导自由基的生成,造成细胞的氧化损伤;在动物肺部吸入实验中,短的碳纳米管毒性比较小,长的碳纳米管激活巨噬细胞并通过TGF-β/Smad信号通路促进肺纤维化。纳米材料对细胞自噬的抑制或激活也是纳米材料毒性效应的一个重要方面。目前已经报道多种纳米材料可以诱导细胞自噬, 包括各种金属氧化物、贵金属Au, 树枝状聚合物、富勒烯C60, SWCNT等。自噬与很多细胞功能相关联, 包括免疫、炎症和细胞凋亡等。纳米材料本身的物理化学性质,包括尺寸、形状、表面电荷、化学组成、表面修饰、金属杂质、团聚与分散性、降解性能以及"蛋白冠"等等对其毒性有决定性的影响。本文对影响纳米材料毒性的关键因素进行了总结和分析, 对近年来纳米材料毒性效应的研究进展进行了综述。通过合理的合成设计, 能够调控纳米材料与生物体的相互作用, 降低甚至消除毒性作用。
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  T3.87 p53基因状态对体外微核试验结果影响的研究进展

  欧红梅;涂宏刚;常艳

  2013, 27(S1): 113-114.

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  体外微核试验常用的啮齿类细胞系,如CHO, V79, CHL和L5178Y,试验结果假阳性率高,可能原因是啮齿类细胞系p53基因功能缺陷。p53基因在细胞周期调节、凋亡、DNA修复过程发挥重要作用,不同p53基因状态的细胞系对DNA损伤反应不同。因而比较不同p53基因状态的细胞系对体外微核试验的影响具有重要意义。目前已有国外实验室比较了多种化合物在不同p53基因状态的细胞系微核试验的假阳性率,Unilever等实验室的结果表明,p53基因功能缺陷的细胞系CHO,CHL和V79假阳性率分别为:53%, 66%和60%;而p53基因功能完整的TK6,HepG2和HuLy细胞,假阳性率明显低于p53基因功能缺陷的细胞系,分别为:40%,23%和17%。出现上述差异的机制可能是p53基因功能完整的细胞系在遗传毒性化合物处理后,通过阻滞细胞周期,或促进细胞凋亡,或帮助基因修复等减轻遗传毒性损害。而p53功能缺陷的啮齿类细胞系缺乏以上功能,暴露于遗传毒性化合物后细胞存活率高,可在DNA损伤的情况下进行复制,导致微核率显著增加。目前已有研究证明,TK6细胞对DNA损伤敏感,遗传毒性化合物作用后细胞分裂周期阻滞,因而微核形成减少,假阳性率降低。虽然目前的实验结果表明选择p53基因功能完整的细胞系,尤其是灵敏度和特异性都较好的TK6细胞可以减少体外微核试验假阳性结果,但不同实验室间联合验证及实验室内重复性验证仍是毒理学工作者未来的研究方向。此外,阐明p53基因功能降低体外微核试验假阳性率的机制将有助于研究的顺利进行。这些问题的解决也可以为法规、指导原则修订和遗传毒性评价提供可靠依据。
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  T3.88 脱氢乙酸小鼠骨髓细胞微核试验

  杜玉锋;史玉静;束婧婷

  2013, 27(S1): 114-114.

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  目的 本实验通过检测小鼠骨髓细胞中嗜多染红细胞(PCE)中的微核出现率来判断DHA是否具有致突变作用,为DHA作为广谱食品添加剂的安全性评价提供基本数据。方法 按照1/10LD₅₀, 1/5LD₅₀和1/2LD₅₀设置三个剂量组,另设置阴性对照组和环磷酰胺(CP)阳性对照组(100 mg·kg^-1)。每组10只小鼠,雌雄各半,灌胃给药,两次攻毒时间间隔24 h。在第二次灌胃后6 h,处死小鼠,制片,观察并计数嗜多染红细胞的微核率,并与阳性对照组和隐形对照组进行比较分析。结果 1/5LD₅₀和1/10LD₅₀剂量时,与正常对照组无显著差异;1/2LD₅₀剂量组与正常对照组有显著差异(P<0.05),但无剂量-效应关系,微核实验结果为阴性。讨论 660 mg·kg^-1剂量组微核率与正常对照有显著差异(P<0.05),其他剂量组未引起显著差异,且没有明显的剂量-反应关系,故判定脱氢乙酸小鼠骨髓细胞微核试验为阴性结果,笔者认为尽管本次实验结果判定为阴性,但脱氢乙酸作为常用的食品添加剂,其安全性与人民群众的健康息息相关,因此有必要对其安全性进一步做更全面的评价。
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  T4.23 环磷酰胺对大鼠免疫抑制的影响

  包汇慧;贾旭东;汪会玲;胡静;陈浩;支媛;于洲;杨华

  2013, 27(S1): 132-133.

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  目的 利用口服环磷酰胺(CTX)建立大鼠免疫抑制模型,确定体液免疫、天然免疫及细胞免疫相关指标在大鼠免疫抑制模型中的变化,为食品免疫毒理学评价建立科学有效的免疫抑制模型。方法 4周龄健康Wistar雌性大鼠,分别 ig给予CTX 5,10和20 mg·kg^-1),每组10只,连续灌胃30 d。每周称重1次,并记录进食量。在实验结束后取新鲜血液进行血常规、FACS分析,取新鲜组织器官固定后进行病理组织学检查,利用免疫组化方法检测免疫相关因子。结果 口服给予大鼠环磷酰胺30 d后,各实验组大鼠与对照组比较体重显著下降(P<0.01),饲料利用率降低(P<0.05)。大体剖检可见:环磷酰胺实验组大鼠皮下脂肪菲薄,胃内空虚,胃黏膜潮红。十二指肠、空肠黏膜出血,肠内容物为水样淡黄色液体,膀胱积尿。脾深紫黑色,质地坚实。镜检可见:脾淤血,多处白髓淋巴细胞坏死,局部白髓出血。肠道表现为肠炎症状,黏膜上皮变性脱落,阶段性黏膜上皮坏死脱落,炎性细胞浸润,黏膜固有层血管扩张充血。血常规分析表明,CTX各实验组白细胞数量与对照组比较有不同程度的升高,淋巴细胞百分比不同程度降低,红细胞数量也呈下降趋势,与CTX剂量呈正相关。流式细胞分析结果表明,外周血B细胞、NK细胞百分比与对照组比较显著降低(P<0.01);外周血T细胞百分比与对照组比较略有上升,但差异不显著。CTX实验组外周血Th细胞百分比与对照组比较显著降低(P<0.01),Tc细胞百分比与对照组比较略有下降,差异不显著。脾脏中,CTX各实验组与对照组比较,B, T, NK细胞百分数显著降低(P<0.01);CTX实验组脾脏Th细胞百分比与对照组比较显著降低(P<0.01),Tc细胞百分比与对照组比较显著降低(P<0.05)。结论 口服给予大鼠不同剂量的CTX可抑制大鼠免疫反应。CTX引起组织器官损伤、抑制中枢免疫器官免疫细胞的生成及转化。在中枢免疫器官中引起T和B细胞凋亡及坏死,进而影响外周血循环中的免疫细胞数量。CTX的免疫抑制作用主要表现为对体液免疫、天然免疫的抑制作用。在细胞免疫中主要影响T细胞的分化,显著抑制T细胞向Th细胞的分化。CTX对体液免疫、天然免疫及细胞免疫的抑制作用有明显的剂效关系,大鼠口服给予CTX 10 mg·kg^-1具有线性剂效关系,可作为食品安全免疫毒理学评价的免疫抑制模型。
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  T4.24 转Bt Cry1Ah基因抗虫玉米的免疫毒性

  宋雁

  2013, 27(S1): 133-133.

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  目的 利用啮齿类动物一级和二级体内/体外免疫毒性筛选体系研究转Bt Cry1Ah基因抗虫玉米的免疫毒性,初步探索其产生免疫毒性的靶点和可能的毒性机制。方法 选用雌性BALB/c小鼠,体质量18~22 g。动物经适应性饲养3 d后按体重将动物随机分组,每组动物10只,按组分笼饲养。试验周期为30 d。一级筛选设4个免疫组,每个免疫组设4个试验组,即阴性对照组、亲本玉米组、转基因玉米组和阳性对照组(试验结束前24 h一次性注射环磷酰胺200 mg·kg^-1)。分别喂饲小鼠普通饲料、亲本玉米70%(W/W)配合饲料、转Bt cry1Ah基因抗虫玉米70%(W/W)配合饲料和小鼠普通饲料,动物自由摄食和饮水。如一级筛选有一项检测项目为阳性,则需进行二级筛选。二级筛选设5个免疫组,每个免疫组的分组情况同一级筛选。免疫毒性一级和二级筛选免疫病理学、体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫相关指标和方法。结果 ① 一级筛选:免疫病理学观察结果可见,转Bt cry1Ah基因抗虫玉米在喂饲BALB/c小鼠第4周时体重较阴性对照组显著增加,外周血单核细胞数显著下降,但与亲本玉米组比较无差异;转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对BALB/c小鼠脾、胸腺、淋巴结、肝和肾的重量及其组织病理学、血生化指标均无影响。转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对反映体液免疫的空斑形成细胞数和免疫球蛋白水平,反映细胞免疫的T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力以及反映非特异性免疫的NK细胞活性均未见影响。② 二级筛选:免疫病理学观察结果可见,转Bt cry1Ah基因抗虫玉米可引起小鼠骨髓细胞分型中淋巴细胞和分叶状粒细胞系比例较阴性对照组显著降低,而杆状粒细胞系比例显著升高,但与亲本玉米组比较无差异;脾脾动脉周围淋巴鞘大小较阴性对照组显著降低,而脾生发中心大小较阴性对照组显著升高,但与亲本玉米组比较无差异。转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对反映细胞免疫的细胞毒性T淋巴细胞活性和迟发型变态反应以及反映非特异性免疫的巨噬细胞吞噬能力均未见影响,转Bt cry1Ah基因抗虫玉米组动物血清细胞因子IL-5水平较阴性对照组显著下降,未见与亲本玉米组有差异。结论 转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对BALB/c小鼠的免疫系统的影响与其亲本玉米基本相同,与其亲本玉米在免疫毒性评价方面具有"实质等同性"。可以认为,转Bt cry1Ah基因抗虫玉米与其亲本玉米在免疫毒性评价方面具是同等安全的。
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  T3.58 食蟹猴单次静脉注射CM对其心血管系统和呼吸功能的影响

  田璐;魏金锋;王爱平

  2013, 27(S1): 98-98.

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  目的 观察治疗类风湿性关节炎的化学药物CM对食蟹猴呼吸、血压和心电等指标的影响,从而评价该药物对心血管系统和呼吸功能的影响,为临床安全用药提供参考。方法 选用遥测技术观察注射用CM对食蟹猴心血管系统和呼吸系统的影响。实验设CM 1, 5和25 mg·kg^-1,以及赋形剂对照组。每组6只动物雌雄各半。单次静脉注射给药,给药体积为5 ml·kg^-1,各组平行给药。采用无创动物心电血压遥测系统记录给药前后心电指标、呼吸频率、呼吸强度和血压的变化。给药结束点为0 min,设-15, 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120和180 min时间点,以-15 min所测指标作为自身对照,给药后各指标与自身对照比较,进行方差分析。结果 食蟹猴单次静脉注射注射用CM(剂量为1, 5和25 mg·kg^-1)后,受试动物一般状况良好,未见肌颤、流涎等反应,呼吸状况良好,活动正常、粪便性状等正常。受试动物RR间期、心率、PR间期、P波时程、QRS时程、QT间期、QTcF、呼吸频率、呼吸强度、平均动脉压、舒张压、收缩压在给药后5, 15, 30, 45, 60, 90, 120和180 min与给药前15 min比较均无异常改变(P >0.05)。结论 在本实验条件下,食蟹猴单次静脉注射注射用CM剂量为1, 5和25 mg·kg^-1(相当于人临床等效剂量的2, 10和50倍)后,对心电指标、呼吸功能、血压无影响。
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  T3.32 动物气溶胶吸入毒理关键技术研究和平台建立

  李劲松;温占波;杨文惠;李娜;王洁

  2013, 27(S1): 84-84.

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  随着人类社会活动的快速发展,大气环境污染日益严重,新发空气传播疾病越来越频繁。2013年初,我国东部大部分地区遭受到前所未有的大气污染,特别是华北地区;另外,从2003年至今,已经新发的呼吸道传染性疾病有SARS、高致病性禽流感H5N1、甲流H1N1病毒、流感H7N9病毒、耐多药结核分枝杆菌等。所有这些都是通过呼吸道导致人类健康危害的。所以,研究气溶胶吸入毒理,对探讨大气污染颗粒物和空气传播感染的预防控制具有现实的意义。动物气溶胶吸入毒理研究的关键技术是建立一个良好的气溶胶吸入暴露系统,该系统包括:气溶胶发生系统、动物暴露腔、动物固定装置、污染气流净化系统、气溶胶采样系统。我们在已有的微生物气溶胶发生、动物暴露感染技术研究的基础上,充分研究了动物暴露系统中气流流速、动物的呼吸量等关系,研制出动物气溶胶吸入暴露系统。为了研制研制的暴露系统的气溶胶均一性和稳定性,使用粘质沙雷氏菌8039和噬菌体D29气溶胶对此系统进行了评价。应用TSI3321气溶胶测试仪测试分析了所有粒子分布情况,用微生物采样器检测分析了生物粒子气溶胶的分布情况,测试实验结果表明,无论生物粒子气溶胶还是所有粒子气溶胶的采样暴露装置上下层和每层各暴露口气溶胶浓度差异不显著。建立的暴露系统即使在高浓度微生物气溶胶评价时也没有发生气溶胶泄露,证明暴露系统对环境无危害。另外,还进行了动物口鼻气溶胶暴露系统,成功建立了豚鼠口鼻气溶胶暴露测试评价模型。该暴露系统所发生的噬菌体D29气溶胶属于可到达肺深部粒子粒径范围,系统运行过程当中无气溶胶泄露发生,豚鼠在该系统运行过程中状态良好,未见死亡。
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  T3.33 银杏叶片等三种药物联合用药对燃煤型砷中毒大鼠免疫损伤的干预作用

  李军;张爱华;韩雪;徐玉艳;贺芳

  2013, 27(S1): 84-85.

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  目的 探讨银杏叶片、强化SOD刺梨汁及二巯基丙磺酸钠单独及联合作用对燃煤型砷中毒大鼠免疫功能的影响,为寻找燃煤污染型地方性砷中毒免疫调控药物提供实验依据。方法 通过建立燃煤型砷中毒大鼠干预模型(以贵州省燃煤型砷中毒病区高砷煤烘烤的玉米粉为主要原料配制高砷饲料喂饲大鼠建立的模型),采用健康断乳的Wistar大鼠48只,随机数字表法将其分为6组[正常对照组、砷中毒组、银杏叶片拮抗组、强化SOD刺梨汁(CJSOD)拮抗组、二巯基丙磺钠(DMPS)拮抗组、银杏叶片+CJSOD+DMPS拮抗组(联合拮抗组)],每组8只。正常对照组喂饲标准饲料;砷中毒组喂饲含砷(100 mg·kg^-1)饲料;银杏叶片拮抗组喂饲含砷(100 mg·kg^-1)饲料同时给予银杏叶片(灌胃,25 mg·kg^-1,6 d/周)干预;CJSOD拮抗组喂饲含砷(100 mg·kg^-1)饲料同时给予CJSOD(灌胃,10 ml·kg^-1, 6 d/周)干预;DMPS拮抗组喂饲含砷(100 mg·kg^-1)饲料同时给予DMPS(腹腔注射,5 mg·kg^-1,用药3 d, 停药4 d为1个周期)干预;联合拮抗组喂饲含砷(100 mg·kg^-1)饲料同时给予银杏叶片、CJSOD和DMPS,干预剂量及用法同上;实验期限均为3个月。采用单克隆抗体APAAP桥联酶标法测定外周血T淋巴细胞亚群CD3⁺, CD4⁺和CD8⁺细胞的变异情况;免疫比浊法测定血清中IgG, IgM, IgA, C3和C4含量。结果 与正常对照组比较,砷中毒组CD3⁺和CD4⁺细胞阳性率及CD4⁺/CD8⁺比值明显降低,C4含量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与砷中毒组比较,银杏叶片拮抗组、CJSOD拮抗组和联合拮抗组CD3⁺和CD4⁺细胞阳性率及CD4⁺/CD8⁺比值显著升高, DMPS拮抗组CD3⁺细胞阳性率显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);DMPS拮抗组的CD3⁺和CD4⁺细胞阳性率明显低于银杏叶片拮抗组、CJSOD拮抗组,联合用药组的CD3⁺细胞阳性率明显著低于银杏叶片拮抗组、CJSOD拮抗组,差异均有统计学意义(P<0.05);各拮抗组IgG, IgA, IgM, C3和C4与砷中毒组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 燃煤砷暴露可通过改变CD3⁺和CD4⁺细胞数量及C4含量,导致大鼠免疫功能受损。银杏叶片、CJSOD能刺激体内T淋巴细胞活化,促进T淋巴细胞增生和维持T淋巴细胞亚群间适度比例,提升燃煤型砷中毒大鼠的免疫功能;DMPS及三种联合用药亦有一定作用,但提升效果弱于银杏叶片和CJSOD。
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  T3.57 蛋白精氨酸甲基转移酶5在人结直肠癌中的作用及其机制

  张宝来;岑小波

  2013, 27(S1): 98-98.

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  目的 研究蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)在人结直肠癌中的作用及其表观遗传学机制。方法 采用Real-Time PCR和Western blot等检测PRMT5在人结直肠癌患者和人结直肠癌细胞株中的表达差异。用Cell Counting Kit-8和BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型检测PRMT5 siRNA对人结直肠癌细胞的体内外抗肿瘤活性。用抗PRMT5、抗组蛋白H3R8和抗H4R3抗体对人结直肠癌细胞进行染色质免疫共沉淀(ChIP),荧光定量PCR分析不同处理细胞FGFR3和eIF4E基因启动子区甲基化H3R8和H4R3水平。结果 与癌旁组织比,PRMT5在人结肠患者癌组织中的表达明显增高,mRNA和蛋白水平分别为78.1% (25/32)和83.3(10/12)。同时,与人正常肠上皮FHC细胞比,PRMT5在HCT116和SW480等7株人结肠癌细胞中的表达也均有不同程度增高。通过siRNA敲除PRMT5后,在体内外均可抑制HCT116和SW480等人结直肠癌细胞的增殖克隆及裸鼠皮下移植瘤的生长,抑制率在30%~60%之间,且与相应的对照组比,差别均有显著性(P<0.05)。此外,RT-PCR结果显示,与癌旁组织比,FGFR3和eIF4E在人结直肠癌患者癌组织中的表达也明显升高,分别为75.0% (15/20)和80.0(16/20)。经PRMT5 siRNA处理后,FGFR3和eIF4E在人结直肠癌细胞中的蛋白含量则显著降低。ChIP实验结果,与siRNA对照组细胞比,PRMT5 siRNA处理组FGFR3和/或eIF4E基因启动子区H3R8和H4R3甲基化水平分别降低0.67和0.60倍(P<0.01)和0.87和0.58倍(P<0.05)。结论 PRMT5在人结直肠癌患者的癌组织和人结直肠癌细胞株中表达均异常升高。PRMT5敲除后在动物体内和体外均可显著抑制人结直肠癌细胞的增殖克隆及裸鼠皮下抑制瘤的生长,其机制可能是PRMT5 siRNA降低FGFR3和eIF4E基因启动子区甲基化作用,致使FGFR3和eIF4E等癌基因合成减少。
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  T3.90 药物临床前安全评价中肝脏的毒理病理学意义

  周天胜;朱琳;郁红;王蕾;张秀娟;郑艳生;冯怡;杨秀英

  2013, 27(S1): 115-115.

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  肝是体内最大的器官,其在毒理实验中常常是靶器官,其主要原因包括:肝因含有大量的Ⅰ相反应酶,特别是细胞色素P450酶系,是化合物生物转化的主要场所;肝接受大量的血液,且是暴露于经消化道接受外源化学物的第一个器官;肝血窦上的内皮细胞不具有基膜,并有孔,以致于血流中的化学物直接与肝细胞接触;肠肝循环可延长化合物在肝中的高浓度。许多药物由于在临床前研究中发现其对肝的有害作用而被终止研发,有些药物在临床前安全评价中虽未发现其有害作用,但在进入临床试验阶段或上市后才发现其对肝脏的毒性,同时有些中草药以及食品添加剂引起的肝毒性已愈来愈受到政府相关部门的高度重视。毒理病理学家对肝毒理病理学的评价通常结合其重量的变化,肉眼病变,组织病理学形态变化,临床病理学变化(肝血清特异酶)以及动物给药阶段的相关数据(如摄食量、体质量的变化数据等)来进行。相别与犬和非人灵长类而言,啮齿类动物的重复给药实验常常会引起剂量依赖的肝重量的增加,通常,肝重量增加20%以上可在镜下见有相关联的组织形态学变化,而中央小叶区的肝细胞肥大常与药物引起的酶诱导相关。肝重量的增加在镜下可表现为细胞肥大、增生、和/或细胞内物质的蓄积。肝细胞的肥大常与肝细胞内滑面内质网、过氧化酶体或线粒体的增殖相关,其在镜下显示的染色强度以及累及细胞的区域也会不同。肝细胞空泡变也常与肝脏重量增加相关联,可由于糖原、脂肪蓄积和/或水分增多所致,除了通过常规HE染色镜下所见空泡的形状,我们还需借助特殊染色方法、组织化学或电子显微镜的方法进行佐证,如过碘酸希夫反应(PAS)阳性可以鉴别空泡是由于糖原的蓄积,通过冰冻切片并借助油红或苏丹Ⅲ染色方法可以鉴别空泡是由于是脂肪的蓄积而非水分增多所致,通过电子显微镜观察是否存在板层小体可鉴别空泡是由于磷脂沉积所致。此外,肝的其他形态学变化如肝细胞坏死、胆汁淤积以及炎症反应等急性变化在毒理实验中也常常遇见,需要毒理病理学家的细心观察。在临床前研究中,药物常常会引起肝的毒理病理学变化,但形态学变化多种多样,这需要毒理病理学家与毒理学家密切交流,深入探究其毒性机制,为我国的新药研发以及药物临床前研究提供更科学的依据,最终以保障人民身体健康而做出应有的贡献。
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  T3.35 分枝杆菌噬菌体D29的急性吸入毒性试验

  杨文慧;胡凌飞;王洁;温占波;李娜;李劲松

  2013, 27(S1): 85-86.

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  目的 观察结核病治疗候选生物制剂分枝杆菌噬菌体D29的急性吸入毒性,以评价其吸入给药安全性。方法 实验根据受试品类型分为3组,分别为药物组(噬菌体D29制剂),溶媒对照组(7H9培养液)、阴性对照组(蒸馏水)。实验动物共采用42只Wistar大鼠、42只Hartley豚鼠,随机分入以上3组,每组大鼠与豚鼠各14只,雌雄各半。动物吸入给药时将同组动物按种属、性别均匀装入动物口鼻气溶胶暴露装置的暴露主腔上、中、下三层暴露筒中。动物装载完毕后将20 ml受试品作为发生液加入DV40气溶胶发生器中,其中药物组发生液中噬菌体D29浓度为1×10⁸ PFU·ml^-1,之后调节装置输送气流流量至10 L·min^-1、排气气流流量50 L·min^-1,开始发生相应受试品气溶胶颗粒。各组动物依次在装置内动式吸入人工发生的受试品气溶胶1 h。药物组吸入给药过程当中用AGI-30液体冲击式采样器对暴露主腔内噬菌体D29气溶胶颗粒进行采集,之后通过双层平皿培养计数法检测噬菌体D29气溶胶浓度。吸入给药结束后各组动物连续观察14 d,记录动物的死亡情况以及临床症状,于d 0和d 14测量动物体质量,计算体重增长值。于d 14对所有存活动物采集血液样本进行血细胞检测,之后进行大体解剖,着重观察呼吸道、肺的病变情况,同时观察肝、脾、肾的脏器病变情况,称量肺湿重,计算肺器重量指数。大体解剖如观察到器官的病变,则进一步进行组织病理切片检查。结果 豚鼠与大鼠一次连续1h吸入噬菌体D29气溶胶浓度为126 000 PFU·m^-3。各组动物14 d内未见明显中毒症状,动物一般活动情况无明显异常,动物死亡率为0和14 d后大体解剖各脏器均未见明显病变。药物组、溶媒对照组、阴性对照组豚鼠、大鼠d 14体重增长值、肺脏器重量指数、WBC、RBC、HGB、PLT、LYM检测结果经统计分析均无明显差异。结论 在本实验条件下,未测出大鼠与豚鼠急性吸入噬菌体D29制剂的LC₅₀(LC₅₀>126 000 PFU·m^-3),未观察到动物的明显病理学变化,表明分枝杆菌噬菌体D29制剂吸入给药具有较高安全性。
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  T3.36 Sirt1及Mn-SOD通路参与芝麻素改善多柔比星致H9C2细胞损伤的作用

  郭会彩;刘诣;张荣;苏素文;王永利

  2013, 27(S1): 86-87.

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  目的 观察芝麻素对多柔比星致H9C2细胞损伤的保护作用及Sirt1及Mn-SOD在其中的作用。方法 采用H9C2细胞,多柔比星2 μmol·L^-1孵育24 h造成多柔比星细胞损伤模型。MTT法测定细胞存活率。分别利用DCFH及RH123荧光探针测定细胞ROS及膜电位水平。生化法测定Mn-SOD活性。Western蛋白质印迹法检测Mn-SOD蛋白含量。结果 与对照组相比,多柔比星2 μmol·L^-1孵育24 h细胞存活率下降约40%。预先孵育芝麻素40 μmol·L^-1 24 h后再给予多柔比星2 μmol·L^-1可使细胞存活率明显增加约15%;与多柔比星组相比,具有统计学差异(P<0.01)。H9C2细胞多柔比星2 μmolL^-1孵育24 h细胞ROS水平明显升高,线粒体膜电位明显降低,提示多柔比星引起细胞氧化应激水平增强及线粒体损伤。预先孵育芝麻素40 μmol·L^-1 24 h可明显减弱多柔比星引起的ROS增加及膜电位水平的下降,具有统计学差异(P<0.01),提示芝麻素可降低多柔比星对细胞的氧化应激损伤。H9C2细胞单独孵育芝麻素40 μmol·L^-1 24 h可增强Mn-SOD的活性和上调Mn-SOD的蛋白表达。单纯给予多柔比星可减低Mn-SOD的活性和降低Mn-SOD的蛋白表达,但预先孵育芝麻素40 μmol·L^-1可拮抗多柔比星对Mn-SOD活性及蛋白表达的作用。预先孵育尼克酰胺(20 mmol·L^-1),Sirt1抑制剂,可部分拮抗芝麻素对多柔比星所引起的细胞存活率、ROS及膜电位水平的改变,并且可取消芝麻素对Mn-SOD活性和表达的改变。提示Sirt1可能通过上调Mn-SOD参与了芝麻素对多柔比星细胞损伤保护作用。结论 芝麻素可对抗多柔比星引起的H9C2细胞氧化应激损伤, 其机制之一可能是芝麻素通过Sirt1上调Mn-SOD从而拮抗多柔比星的细胞损伤作用。
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  T7.13 阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白的神经毒性

  王倩;张力;张丹参;田慧;刘靓靓

  2013, 27(S1): 189-189.

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  研究表明,β淀粉样蛋白(Aβ)本身不会导致神经退行性病变,其异常产生和沉积是导致老年痴呆症的根本环节,从而引发了难以逆转的神经变性如痴呆等,而阿尔茨海默病是痴呆症中最常见的一种。Aβ是一种由39~43个氨基酸残基组成,分子量大约为4 KD,在三维结构中呈β型折叠的物质。脑内的Aβ低聚体、Aβ多聚体、纤维性Aβ都具有广泛的神经毒性作用。但如果Aβ产生过多,则会引起神经元损伤,影响大脑活动,出现痴呆症状。现就Aβ的产生及其神经毒性作简要阐述。Aβ是由β淀粉样前体蛋白(APP)在β-分泌酶的作用下产生的。APP是编码基因位于21号染色体,由695~770个氨基酸组成,分子量为 87 ku的Ⅰ型跨膜糖蛋白。其分为胞内区、跨膜区和胞外区三部分,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达最高。APP695是脑内神经元中的主要形式,APP分别经α、β-分泌酶在氨基末端切割生成sAPP,包括sAPPα和sAPPβ。研究表明,sAPPα具有神经营养作用和神经保护作用,sAPPβ则产生神经毒性作用,使细胞凋亡,引起炎性反应。经过 β-分泌酶降解后,sAPPβ和C端肽段C99又经过 γ-分泌酶降解为Aβ。Aβ的神经毒性作用涉及到复杂的分子机制,主要包括以下几个方面:① 钙稳态失衡 胞浆内Ca²⁺浓度是细胞进行生理活动的重要条件,Aβ能在胞膜上形成选择性的阳离子通道或破坏K⁺通道,导致大量细胞外Ca²⁺内流,并触发内质网和线粒体内储存的Ca²⁺释放,致使钙稳态的失衡。② 线粒体异常 Aβ主要是通过损害氧化磷酸化、提高反应性氧的产生、与线粒体相关蛋白相互作用等方式,影响线粒体平衡。③ 突触损伤 低于致死浓度的可溶性 Aβ就可以快速而有效地抑制海马长时程增强,从而损伤突触的可塑性。④ Aβ通过诱导产生氧自由基,而使得脑细胞膜系统的脂质和蛋白受到氧化修饰,从而使活性氧增加。氧化应激可以促进Aβ的生成和沉积,并上调阿尔茨海默病分子伴侣;同时, Aβ也加入自由基的氧化损伤过程。Aβ的神经毒性虽然涉及到很多方面,但是他们之间是相互联系的。在病理状态下,脑内APP产生的Aβ不断累积,扰乱Ca²⁺稳态引发氧化应激、线粒体功能障碍、突触损伤,致神经性炎症反应,最终使神经元变性凋亡,从而引发多种神经系统性疾病,而Aβ已被广泛认为是阿尔茨海默病的主要病因。因此拮抗Aβ的毒性作用是治疗阿尔茨海默病的重点。
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  T3.38 七叶皂苷肾细胞毒性与热休克蛋白表达呈负相关

  张鑫;杨秀伟;杨晓达;王旗

  2013, 27(S1): 87-88.

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  目的 研究七叶皂苷的肾细胞毒性与热休克蛋白(HSP)表达水平间的关联,并初步探讨代谢对七叶皂苷毒性的影响。方法 MDCK细胞导入pHSE-SEAP质粒,以热休克与重金属刺激考察模型的有效性;通过检测分泌型碱性磷酸酶(SEAP) 活性,研究七叶皂苷对MDCK细胞内HSP表达水平的影响, 同时用MTT法考察七叶皂苷对MDCK细胞存活率的影响。用β-葡萄糖醛酸苷酶(β-GU)水解七叶皂苷,MTT法检测酶解前后七叶皂苷对HK-2细胞的毒性差异,高效液相色谱法检测酶解前后七叶皂苷主要成分的含量变化。结果 热休克处理或1 μmol·L^-1的HgCl₂使MDCK细胞的HSP表达上调,而10 μmol·L^-1的HgCl₂或CdCl₂降低细胞内的HSP表达水平。不同浓度的七叶皂苷钠作用细胞24 h后,分别在恢复24及48 h的SEAP活性显著低于对照组(P<0.01),而同浓度的七叶皂苷钠作用MDCK细胞后,其存活率与SEAP活性的变化趋势不完全相同。 较低浓度(5, 10和15 μmol·L^-1)的七叶皂苷钠在降低细胞HSP表达水平的同时未表现出细胞毒性作用,细胞存活率显著高于对照组(P<0.05)。较高浓度(25和30 μmol·L^-1)的七叶皂苷钠则表现出明显的细胞毒性作用,细胞存活率显著低于对照组(P<0.01)。经β-GU水解后,较高浓度(20和30 μmol·L^-1)的七叶皂苷钠细胞毒性显著低于酶解前(P<0.05);七叶皂苷中四个主要成分的含量随水解时间延长而逐渐减少。结论 七叶皂苷可显著降低MDCK细胞内的热休克蛋白表达水平,减弱细胞的损伤修复能力。七叶皂苷经β-葡萄糖醛酸苷酶水解后,其肾细胞毒性降低。
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  T3.39 浅谈在GLP实验中的实验动物的福利伦理

  雷夏凌;杨威;郭秋平;黄远铿;李海华;柳璐

  2013, 27(S1): 88-88.

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  实施GLP的主要目的是提高实验室研究与检验工作的质量,确保实验数据和结果的真实性和可靠性,动物实验在新药研发中起到不可替代的作用,实验动物心理和生理的发育,会造成各种可见和不可预见的个体差异和病理状态,这些因素将会严重干扰实验结果的准确度,影响科研质量和水平。本文就GLP实验中如何体现动物福利伦理进行探讨,旨为提高GLP实验质量和改善实验动物的福利提出一些思路。
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  T3.41 30种黔产中药材饮片中农药残留调查与研究

  程寿峰;张明时

  2013, 27(S1): 89-89.

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  目的 对黔产中药材饮片中3类常见农药残留现状展开调查研究,建立中药材中农药残留的检测方法,制定技术和规范,评估黔产中药材饮片中农药残留的现状,为贵州省与中药现代化相关的企业提供技术支撑。方法 收集贵阳中药市场上30种黔产中药材饮片共计121个批次样品,经过提取、净化,并用气相色谱对黔产中药材饮片中12种有机磷、11种有机氯、5种拟除虫菊酯农药进行检测。结果 黔产中药材饮片中的主要农药污染为六六六和DDT两类农药,检出率为75.24%;其次是5种拟虫菊酯类农药,检出率为21.14%;12种有机磷农药均未检出。参照2010版中国药典一部标准,只有机氯农药检出超标,合格率为95.87%;5种拟除虫菊酯类农药和12种有机磷农药残留含量均合格。参照国外相关标准(中草药日本肯定列表制度等),有机氯农药合格率为90.01%;5种拟除虫菊酯类农药合格率为95.06%。结论 贵州曾经大量使用过六六六和DDT农药,由于此类农药半衰期长,将来还会污染黔产中药材的质量;拟除虫菊酯农药也在种植过程中有所使用,但是由于此类农药稳定性较差,所以对黔产中药材的污染影响较小;有机磷农药极易分解所以未对黔产中药材造成污染。与国内不同的地方中药材相比,贵州中药材中有机氯农药残留污染在国内处于较低水平,证明自从采取GAP基地以来,黔产中药材中农药残留得到了一定的控制。在评估过程中,对国内外农药残留限量标准进行比较,可知我国关于农药残留限量的标准较少,且限值较高,需要完善农残限量标准,使其与国际标准接轨,为中药走向国际市场提供有力的支撑。
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  T3.42 药物体外3T3细胞光毒性(中性红摄入)评价方法的建立

  涂宏刚;欧红梅;黄鹏程;顾珺;常艳

  2013, 27(S1): 89-90.

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  目的 采用Balb/c 3T3小鼠成纤维细胞建立符合国际规范的体外光毒性评价方法(3T3 中性红摄入试验),并通过评价光毒性资料明确的药物验证该方法的可靠性,为该方法在药物临床前光毒性评价的推广及其在新药研发过程中的应用提供支持。方法 将生长状态良好的BALB/c 3T3细胞接种于96孔培养板(外围一圈除外),使每孔含有100 μl密度为1.0×10⁸ L^-1的细胞悬液。在37℃,5%的CO₂条件下培养约24 h后,除去培养基,以平衡盐溶液(HBSS)洗涤细胞2次后,每孔加入100 μl含有不同浓度盐酸氯苯嗪、盐酸胺碘酮和蒽的HBSS溶液,同时设置空白对照和溶媒对照,每个处理3个复孔,每种受试物2块板。将培养板置于37℃±1℃, (5±1)%CO₂条件下加湿培养约1 h后,将光照板置于光强度为(1.7±0.1)mW·cm^-2的UVA条件下照射至剂量达5.0 J·cm^-2,无关照板用锡箔纸包裹后于室温暗室条件下培养相同时间。光照结束后,除去含供试品(对照品)的HBSS溶液,用150 μl预热的HBSS洗涤细胞2次后,换上新鲜的培养液继续培养18~22 h。培养结束前约3 h,加入含50.0 mg·L^-1中性红无血清的DMEM培养液继续培养。培养结束后,弃去含中性红的培养基,用150 μl预热的HBSS洗涤细胞,然后每孔加入150 μl中性红洗脱液,置于振荡器快速振荡直至形成均匀的溶液。用分光光度计在540 nm下测定各孔的A值(A₅₄₀)。以Phototox软件计算光刺激因子(PIF)值。结果 在本试验条件下,盐酸氯苯嗪、盐酸胺碘酮和蒽的PIF值分别为27.5, 5.9和大于25.1,与指导原则OECD432中的参考数据一致。结论 成功建立了符合国际规范的体外3T3细胞光毒性(中性红摄入)评价方法,可用于药物早期光毒性体外筛选和临床前光毒性评价。
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  T3.60 刺五加氨基酸运动饮品缓解小鼠体力疲劳的作用

  周轶琳;王凤岩;陈瑞仪

  2013, 27(S1): 100-100.

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  目的 研究刺五加氨基酸运动饮品缓解小鼠体力疲劳的作用。方法 SPF级昆明种雄性小白鼠,随机分为0.83, 1.67和5.00 g·kg^-1组和纯水对照组,各剂量组每日灌胃给予刺五加氨基酸运动饮品,纯水对照组按同等容量灌胃给予纯净水,共30 d。实验结束时测定小鼠负重游泳时间、尿素氮含量、血乳酸曲线下面积和肝糖原含量。结果 刺五加氨基酸运动饮品可延长小鼠负重游泳时间,实验结果为阳性;不能降低小鼠运动后血清尿素氮水平,实验结果为阴性;可降低小鼠运动前后三时点乳酸曲线下面积,实验结果为阳性;可增加小鼠肝糖原的贮量,实验结果为阳性。结论 刺五加氨基酸饮品具有缓解体力疲劳功能。
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  T3.61 蜂胶软胶囊的辅助降血糖功能

  武昕;赵伟健;严家荣;黄红坤;钟志勇;唐小江

  2013, 27(S1): 100-100.

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  目的 利用链脲菌素诱导的糖尿病小鼠测定蜂胶软胶囊是否有辅助降血糖的保健功能,为临床应用提供一定的依据。方法 糖尿病小鼠和正常小鼠给予蜂胶软胶囊连续30 d,观察其对正常小鼠空腹血糖、模型小鼠空腹血糖和糖耐量的影响。结果 蜂胶软胶囊高剂量(0.6 g·kg^-1·d^-1)对正常小鼠体重及空腹血糖值无影响。蜂胶软胶囊中、高剂量(0.3和0.6 g·kg^-1·d^-1)对糖尿病小鼠有升高空腹血糖下降率、降低空腹血糖值及降低给予葡萄糖后0, 0.5和2 h血糖曲线下面积的作用。结论 蜂胶软胶囊对糖尿病小鼠有辅助降血糖的作用。
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  T14.23 香烟烟雾致BEAS-2B细胞恶性转化中相关基因表达及启动子甲基化改变

  李建祥;

  2013, 27(S1): 280-281.

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  目的 为了建立香烟烟雾致体外人支气管上皮细胞恶性改变的细胞模型,研究香烟烟雾染毒诱发恶性转化中相关基因表达和启动子DNA甲基化状况。方法 将人支气管上皮细胞(BEAS-2B)细胞接种于Transwell膜培养皿后置于动态气体染毒装置中进行直接细胞染毒。检测染烟后细胞增殖抑制率确定染烟浓度及时间。染烟2次后将Transwell培养皿中细胞消化下置于培养瓶中常规培养,待生长至对数生长期后进行下一代染烟,共染烟40代。比较对照组细胞、染烟5, 10, 15, 20, 25, 30, 35和40代细胞的一般生物学状况,血清抗性实验、锚着独立性生长实验等细胞恶性转化指标。检测各组p16, survivin, RASSF1A和MGMT基因mRNA的表达水平,分析处于恶性转化各阶段中RASSF1A, MGMT, p16, DAPK-1, APC基因启动子特异位点的甲基化状况。结果 随染烟代数的增加,人支气管上皮细胞BEAS-2B可发生恶性转化,形态学和生长特性发生明显变化,细胞传代周期由4 d缩短为2 d,随染烟代数的增加,细胞形态学及生长趋于稳定,表现出类似癌细胞的生长特性。细胞凋亡率明显降低,呈现凋亡抑制状态。对细胞恶性程度的变化分析发现:香烟烟雾染毒至5代时细胞即已获得恶性转化,表现为抗血清生长能力增强,在含10%血清培养基中细胞克隆形成率可达32.34%,同时获得锚着独立生长能力,其克隆形成率可达8.48%。至染毒40代细胞时上述两项指标分别达到97.11%和89.17%,表明该细胞恶性程度已相当高。对照组细胞RASSF1A和MGMT基因无甲基化表达,自染烟5 代细胞开始即已开始甲基化表达,至染烟40代细胞一直稳定表达;Survivin基因mRNA在对照组细胞中无表达,随着染毒代数的增加均高表达,呈现剂量效应关系。RASSF1A和MGMT基因mRNA在对照组细胞中高表达,各染烟组细胞mRNA表达水平均显著降低,并呈现剂量依赖性关系。结论 本研究建立了香烟烟雾诱导BEAS-2B细胞体外恶性转化的细胞模型。RASSF1A和MGMT基因启动子区甲基化和表达水平降低可能在香烟烟雾诱导BEAS-2B细胞恶性转化中发挥重要作用并显现出凋亡状态的改变。
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  T14.26 应用体外微核高内涵筛选法检测三种化学物的遗传毒性

  李庆;黄俊明;杨颖;陈美芬;李欣;梁扬盛;陈秀娟;易资梅

  2013, 27(S1): 282-283.

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  目的 建立快速高效的体外微核试验高通量筛选方法,并应用该方法检测香兰素、尼泊金甲酯和对苯二胺三种化学物的遗传毒性。方法 上述3种化学物分别设10个染毒剂量,香兰素剂量范围1.22~625 μg·ml^-1、尼泊金甲酯剂量范围2.44~1250 μg·ml^-1、对苯二胺剂量范围2.44~1250 μg·ml^-1,同时设阳性对照(+S9为10 μg·m;^-1环磷酰胺、-S9为0.50 μg·ml^-1丝裂霉素C)和溶剂对照(1%二甲基亚砜)。应用Cellomics Toxinsight Reader高内涵筛选系统在加和不加代谢活化系统两种条件下,检测上述化学物对中国仓鼠肺细胞(CHL)微核形成率和细胞毒性的影响。结果 香兰素在加和不加代谢活化系统两种条件下均不能诱发微核发生率显著增加(P>0.05),在156~625 μg·ml^-1剂量范围细胞毒性大于50%。尼泊金甲酯在有代谢活化系统条件下156~625 μg·ml^-1剂量范围可诱发微核发生率显著增加(P<0.01),在625 μg·ml^-1剂量细胞毒性大于50%;在无代谢活化系统条件下不能诱发微核发生率显著增加(P>0.05),在312 μg·ml^-1剂量细胞毒性大于50%。对苯二胺在加和不加代谢活化系统两种条件下,19.5~156 μg·ml^-1剂量范围均可诱发微核发生率显著增加(P<0.01),在78~156 μg·ml^-1剂量范围细胞毒性大于50%。结论 香兰素未检测出遗传毒性;尼泊金甲酯和对苯二胺具有遗传毒性,可导致CHL细胞染色体断裂或诱发非整倍体。
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  T15.1 横纹肌溶解在甲基苯丙胺及苯乙胺类药物中毒中的研究进展

  杨幸怡;徐静涛;刘超;王慧君

  2013, 27(S1): 283-284.

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  甲基苯丙胺(MA)属于苯丙胺类(PEA)兴奋剂,苯乙胺是MA中的重要成分。MA具有药物依赖性(主要是精神依赖性)、中枢神经兴奋、致幻、食欲抑制和拟交感效应等药理、毒理学特性,其毒性可以引起机体多内脏器官的损害,其中横纹肌溶解是MA及PEA急性中毒中常见的症状。MA滥用与发生横纹肌溶解与否与哪些因素相关,如何提防吸毒者产生的横纹肌溶解,其产生的相关机制仍不明确,其今后的研究方向及现有研究中所存在的不足及需深入研究的地方仍不清楚。近10年来,研究者从MA使用如使用剂量、MA使用至横纹肌溶解发生的时间、MA使用方式等与横纹肌溶解发生的关系;MA引起横纹肌溶解的相关病理生理机制如MA导致的横纹肌缺血缺氧,MA所致高热导致的横纹肌溶解,MA所致肾上腺素能系统激活导致横纹肌过度兴奋造成的损伤,MA使用导致吸毒者发生横纹肌溶解的个体差异等角度进行研究,并提出了MA吸毒者产生横纹肌溶解的相关机理假说。同时本进展也介绍临床上及法医学上对MA及PEA引起横纹肌溶解的诊断、预防及治疗的进展。本文意在通过介绍MA及PEA中毒对横纹肌溶解产生的机理研究和进展,发现及提出MA及PEA等引起横纹肌溶解中尚未能解决的关键问题,从而为研究MA及PEA类药物引起横纹肌溶解提供研究方向以及为法医学尸检及临床诊断、预防提供参考。
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  T15.4 马兜铃酸-Ⅰ致Beagle犬肝损伤激活IL-6/STAT3炎症通路

  金珂;李彤;郑雪花;朱夏青;马葵芬;朱丹雁;楼宜嘉

  2013, 27(S1): 285-285.

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  目的 建立马兜铃酸-Ⅰ(AA-Ⅰ) 致beagle犬亚急性肝损伤模型,检测炎症细胞因子白介素-6(IL-6)引发肝组织非特异性炎症及IL-6/STAT3炎症通路激活状态,为进一步研究炎症恶性转变分子网络调控提供依据。方法 Beagle犬连续口服AA-Ⅰ(3 mg·kg^-1·d^-1)10 d,第11天处死,搜集肝样本,部分放入4%福尔马林固定后石蜡包埋切片,部分液氮速冻后-80度储存备用。采用H&E染色观察肝组织损伤,TUNEL染色检测肝组织凋亡,分别采用RT-PCR及ELISA法检测肝组织中IL-6基因表达水平及含量,原位免疫荧光检测IL-6受体IL-6R表达情况,采用免疫组织化学法检测肝组织STAT3及其激活形式p-STAT3分布及表达,Western-blot法检测STAT3激活相关分子事件。结果 HE染色可见给药组肝组织肝索结构紊乱,中央静脉呈现出塌陷状,部分区域出现坏死灶,并可见大量炎症细胞浸润,提示AA-Ⅰ造成beagle犬肝损伤并伴有炎症发生。TUNEL染色结果显示给药组肝组织出现大量细胞核阳染,证明肝损伤过程中伴有大量肝实质细胞凋亡。RT-PCR检测给药组肝组织IL-6基因表达显著性上调(P<0.05),与ELISA法检测IL-6含量显著增高相一致(P<0.05),提示炎症细胞因子IL-6参与AA-Ⅰ致肝损伤非特异性炎症。原位免疫荧光结果显示给药组IL-6受体(IL-6R表达上调,证实IL-6经由其受体激活下游分子事件。免疫组织化学结果显示给药组胞浆区出现大量STAT3阳染,大量p-STAT3阳染区则部分出现于胞浆,部分位于胞核,证明IL-6炎症信号直接激活其下游分子STAT3,并由其活化形式p-STAT3入核后放大炎症信号。运用Western blot检测IL-6至STAT3相关分子事件发现, 给药组IL-6R,JAK2,p-STAT3蛋白表达均显著上调(P<0.05),进一步证实IL-6/STAT3通路全面激活。结论 Beagle犬连续经口给予AA-Ⅰ(3 mg·kg^-1·d^-1)10 d,可致肝组织损伤并伴有非特异性炎症"IL-6/STAT3通路"信号激活。
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  T15.6 大鼠腹腔注射脂多糖致大鼠学习记忆能力损伤

  张艺瀚;窦沅;张翔南;刘琰;何良艳;朱丹雁;楼宜嘉

  2013, 27(S1): 286-287.

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  目的 大鼠腹腔注射脂多糖(LPS)引起学习与记忆能力损伤的基础上,进一步探索损伤后皮质与海马前列腺素E₂以及白三烯C₄的合成变化。方法 利用Morris水迷宫实验评价大鼠腹腔给予LPS(2 mg·kg^-1)后学习与记忆能力损伤。探索外周炎症刺激对大鼠大脑皮质及海马中PEG₂和LTC₄的合成变化。ELISA法检测PEG₂水平,Western blot检测微粒体前列腺素E合酶1(mPEGS-1)、微粒体谷胧甘肤S转移酶2(mGST2)、微粒体谷胧甘肤S转移酶3(mGST3)、白三烯C4合酶(LTC₄S)在大脑皮层以及海马组织中的表达情况。RT-PCR检测上述组织中mPEGS-1, mGST2, mGST3, LTC₄S mRNA表达。结果 腹腔注射LPS 后,大鼠学习能力受到损伤,定位航行达到相同学习水平需要训练时间显著延长;空间探索实验结果显示,第一阶段大鼠短期记忆能力受LPS 影响不明显;第二阶段大鼠过台次数显著减少,提示腹腔注射LPS 后大鼠长期记忆能力受到明显影响。ELISA法检测组织内PGE₂含量,结果显示LPS致炎24 h内,可分别导致海马及皮层组织内PGE₂水平呈时间依赖性升高,提示腹腔注射LPS后大鼠皮层以及海马组织内PEG₂合成增加。Wtem Blot结果显示,mPGEs-1蛋白以及LTC₄S蛋白在大鼠大脑海马及皮层组织内均有表达。LPS致炎后,可导致海马及皮层组织内mPGES-1蛋白以及LTC₄S表达上调,RT-PCR结果显示LPS腹腔注射1 h后,可导致LTC4s的mRNA呈现一过性上调趋势,提示在炎症模型中海马中炎症分子前列腺素E₂以及白三烯C₄合成增加。结论 大鼠腹腔注射脂多糖LPS可引起学习与长期记忆能力损伤并致海马前列腺素E₂以及白三烯C₄合成增加。
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  T16.1 基于毒物转运转化性质的毒理学评价和机制

  李桦

  2013, 27(S1): 287-288.

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  毒物对于机体而言是外源性物质,进入体内后经被动转运或经摄取或外排转运体介导转运,吸收入血、分布至靶器官或排泄器官,发挥毒理效应或者加速排出体外;在代谢酶的作用下经历生物转化,生成活化产物或无毒产物。毒物的体内转运转化过程直接影响其吸收、分布、代谢和排泄过程,进而导致毒物的增毒或减毒。因此,毒物的转运转化研究是理解其中毒机制和解毒过程的必要前提,通过调控毒物基于转运体和代谢酶的体内处置过程,可以达到减毒或抗毒的目的。体外试验体系是研究毒物基于转运转化的毒理学机制的首选方法,具有通量高、易控制、重复性好、可分别考察多个因素的影响及机制、以及可应用人源性材料、便于进行种属之间的比较等优点。应用肝S9、肝微粒体等亚细胞成分或人重组Ⅰ相和Ⅱ相酶,以及在体肝肠灌流模型,可以评价代谢酶对毒物的代谢转化作用;应用单层细胞转运模型或脑内皮细胞和胶质细胞的共培养模型,可以评价毒物的血脑屏障通透性及中枢分布与毒性的关系;应用原代培养肝细胞,可以评价毒物肝摄取、代谢、胆汁外排及肝毒性。本报道介绍了基于转运转化的毒物减毒或增毒作用,以及相关的机制研究。例如,在体外代谢转化试验体系中,研究了硫代磷酸酯农药经细胞色素P450酶氧化脱硫或酯酶水解的活化增毒及减毒过程,以及代谢转化的种属差异。硫代磷酸酯农药在大鼠肝微粒体主要以氧化脱硫、生成毒性更高的活化产物为主;在人肝微粒体中则以酯酶代谢、生成无毒的水解产物为主。由此预测,其在人体的毒性可能低于大鼠。应用体外单层细胞转运模型和体内稳态分布模型,研究了外排转运体介导的强效麻醉性镇痛药跨血脑屏障通透性,以及转运体调控与其毒副作用的相关性。研究发现,这类药物是外排转运体的底物,与转运体抑制剂合用能显著改变药物的血脑屏障通透性,成倍提高其脑组织分布水平,引起显著的呼吸抑制毒性。应用原代培养的大鼠肝细胞模型,评价了转运体介导的雷公藤甲素肝摄取和胆汁排泄,以及肝代谢酶介导的代谢转化,研究了转运转化调控与其毒性的关系。研究确定雷公藤甲素是代谢酶和转运体的双重底物,肝代谢酶或转运体的抑制和诱导均能引起雷公藤甲素肝细胞浓度的变化,使肝毒性增大或降低。由此提示,当雷公藤甲素与其他临床药物合用时,存在药-药相互作用的益处或风险。
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  T16.6 相思豆毒蛋白P2纳米药物的代谢动力学

  鹿晓晶;李丽琴;石童;张瑞华;王陈;徐建富

  2013, 27(S1): 291-291.

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  目的 研究子相思豆毒蛋白P2纳米化(abrin P2-PLGA-NP)后在小鼠体内的血药浓度,计算了其纳米化后的绝对生物利用度,了解了abrin P2-PLGA-NP的小鼠血浆中的动力学过程,为abrin P2新剂型的研究提供了技术资料。方法 单次ig[¹²⁵I]abrin P2-PLGA-NP 21.9, 43.8, 87.5 μg·kg^-1,给药后不同时间点取血,分离血浆,采用三氯乙酸沉淀法沉淀abrin,然后检测沉淀中的放射性,采用PKS软件分析abrin在小鼠体内分布的房室模型及各种动力学参数。结果 小鼠单次灌胃给予21.9, 43.8和87.5 μg·kg^-1的¹²⁵I-abrin P2-PLGA-NP后,其血药浓度数据拟合为二房室模型,各剂量代谢动力学参数如下:吸收半衰期(T_1/2Ka)分别为0.21, 0.30和0.50 h;消除半衰期(T_1/2β)分别为45.98, 37.68和38.35 h;时间曲线下面积(AUC_0~∞)分别为23.19, 55.05和91.07(ng·ml^-1)h;最大血药浓度(C_max)分别为2.70, 3.78和5.16 ng·ml^-1;血药浓度达峰时间(T_max)分别为0.79, 0.99和1.29 h。结论 小鼠单次灌胃不同剂量的abrin P2-PLGA-NP后,在体内的分布均呈现二房室模型。在受试剂量范围内,纳米化相思豆毒蛋白P2在小鼠体内的T_1/2β基本一致,而T_1/2Ka随着剂量的增加而延长,反映了纳米药物在体内的消除与药物本身性质有关,而与剂量无关,而药物的吸收,与剂量相关,且药物经纳米化后明显延长了其在体内的半衰期;AUC_0~∞, C_max均分别与给药剂量呈正相关;T_max随着给药剂量的增加而延长。
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  T16.8 CYP2A13在低浓度黄曲霉毒素B1所致BEAS-2B细胞恶性转化中的作用

  张展;陆慧媛;王守林

  2013, 27(S1): 292-292.

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  目的 本研究利用稳定表达CYP2A13的人支气管上皮细胞(BEAS-2B),系统探讨CYP2A13在低浓度黄曲霉毒素B1(AFB1)所致人支气管上皮细胞恶性转化中的作用及其分子机制,为阐明AFB1与人群呼吸系统肿瘤的关系、并为AFB1的健康风险评估提供重要线索和技术支撑。方法 利用慢病毒系统分别构建稳定表达CYP2A13的BEAS-2B(B-2A13)单克隆细胞、B-1A2细胞(AFB1的优势代谢酶)、B-2A6细胞(CYP2A13的同源酶)以及B-Vector细胞(空载细胞)。AFB1 0.1~10 nmol·L^-1连续处理上述细胞30~50代,通过软琼脂集落实验、划痕实验以及裸鼠荷瘤实验比较AFB1对不同细胞的恶性转化效应。在此基础上,运用免疫荧光检测细胞的AFB1-DNA加合物和8-OHdG的含量、流式细胞仪检测细胞的凋亡、Western blot检测相关蛋白的表达,初步分析其作用机制。最后,再利用siRNA干扰和关键蛋白的抑制剂等进一步确认相关的分子机制。结果 与B-Vector相比,不同浓度AFB1处理40代(P₄₀)的B-2A13, B-1A2细胞,其克隆形成数目以及迁移能力显著增加,而B-2A6与B-Vector相似,未见明显的克隆形成和迁移能力的改变。裸鼠荷瘤实验证实,P₃₀ B-2A13即可使裸鼠皮下成瘤,而P₅₀ B-1A2才能使裸鼠皮下成瘤,P₅₀ B-2A6则和B-Vector细胞一样,不能使裸鼠皮下成瘤。显示低浓度AFB1可经CYP2A13或CYP1A2的代谢活化而诱发细胞发生恶性转发并致瘤,但CYP2A13的能力明显高于CYP1A2。与B-Vector相比,AFB1 0.1 nmol·L^-1处理可引起P₄₀ B-2A13显著的DNA损伤,AFB1-DNA加合物、8-OHdG生成增加,DNA损伤修复相关蛋白如p-ATR, p-BRCA1, Rad51, Mre11和Rad50表达显著增加。此外,AFB1 0.1 nmmol·L^-1处理的P₁₀细胞凋亡率显著增加,而P₄₀ B-2A13细胞的凋亡则下降至未处理细胞的水平,提示长期持续处理,细胞出现了抗凋亡现象,可能与细胞的恶性转化有关。ATR-siRNA或NU6027(ATR的抑制剂)与AFB1联合处理,可以显著增加P₄₀ B-2A13细胞凋亡,并与P₁₀ B-2A13细胞的凋亡相当。ATR-siRNA或NU6027可以显著地抑制AFB1诱导的DNA损伤修复相关蛋白如p-ATR, p-BRCA1, Rad51, Mre11, Rad50的激活,还可以使P₄₀ B-2A13细胞中Bax, C-胱天蛋白酶3等表达增加,但对P₄₀ B-Vector细胞无显著影响。软琼脂集落实验进一步显示,ATR-siRNA或NU6027可以显著地抑制P₄₀ B-2A13在软琼脂上的锚定生长。结论 CYP2A13的代谢活化在低浓度AFB1导致的BEAS-2B恶性转化中发挥了关键作用;ATR介导的DNA损伤修复与凋亡失衡是其作用的重要途径和分子机制。
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  T16.10 纳曲酮前体化合物在兔体内的代谢动力学

  王陈;李丽琴;张靖;鹿晓晶;石童;徐建富;张瑞华

  2013, 27(S1): 293-294.

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  目的 灵敏度高,操作简单快速的LC-MS/MS分析方法,研究纳曲酮十一碳酸酯前体化合物在兔体内的代谢动力学过程。方法 1)血浆样品预处理方法:取血浆0.1 ml置于10 ml的具塞玻璃试管中,加入内标纳洛酮(200 ng·ml^-1)5 μl,加入10 μl 0.1 mol·L^-1的NaOH溶液,涡旋振荡1 min后,加甲基叔丁基醚2 ml,涡旋振荡2 min,于1500 rpm离心10 min,分取有机层,在50℃条件下氮吹仪吹干。残留物用流动相100 μl溶解,10 000 rpm离心10 min,再用0.22 μm的滤膜过滤,取5 μl进样。2)LC-MS/MS液相色谱质谱联用方法:采用Agilent 6410型液相色谱质谱联用仪分析检测;采用Agilent Zorbax SB-C₁₈(1.8 μm 2.1×50 mm)型色谱柱;以甲醇/0.1%FA水溶液(50:50)作为流动相,流速0.2 ml·min^-1;正离子MRM检测模式:纳曲酮(342.1→324.1),纳洛酮(328.1→310.0),Fragmentor电压135 v,干燥气温度300℃,干燥气流速12 L·min^-1,毛细管电压4 kv。3)药代动力学研究:选用6只兔,肌注纳曲酮十一碳酸酯10 mg·kg^-1,分别于给药前及给药后0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 54, 60, 72, 78, 84和96 h静脉取血0.3 ml,置于加有抗凝剂的塑料离心管中,离心,取血浆。结果 本文所建立的血浆样品纳曲酮LC-MS/MS测定方法,血浆内源性物质均不干扰样品峰,绝对回收率大于78%,日间和日内相对标准差小于等于7.6%,血浆中纳曲酮的最低定量限为0.5 ng·ml^-1,线性范围为0.5~200 ng·ml^-1。说明该方法符合生物样品的分析要求,可以用于纳曲酮的代谢动力学研究。纳曲酮十一碳酸酯的代谢动力学参数为:T_max为5.3 h;C_max为21.4 ng·ml^-1,T_1/2为13.1 h;AUC_tn为615.3 ng·h^-1·ml^-1。结论 所建立的LC-MS/MS方法灵敏度高,操作简便快速,满足纳曲酮在兔体内的药代动力学研究需要。与纳曲酮相比,纳曲酮十一碳酸酯的半衰期明显延长,证明其能在体内缓慢释放纳曲酮,达到缓释长效的效果。
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  T16.13 一种稳定高效的原代小鼠肝细胞分离纯化培养方法

  孟涛;戴宇飞;牛勇;段化伟;宾萍;郑玉新

  2013, 27(S1): 295-295.

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  目的 建立一种稳定、高效的原代小鼠肝细胞分离、纯化与培养方法。方法 在传统的两步胶原酶灌流法的基础上进行5个方面的优化和改进,包括将门静脉正向灌流改为下腔静脉逆向灌流、将持续灌注改为间断灌注、灌注胶原酶时将门静脉近心端夹闭、根据小鼠体重严格限制胶原酶的消化时间以及将分离的肝细胞悬液进行Percoll单密度梯度低速离心纯化。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法进行检测。将分离后的肝细胞分别采用单层胶原培养法和"三明治"夹层体外培养法进行培养,并观察不同时期(24 h, 48 h, 72 h, 5 d, 7 d, 10 d, 14 d)小鼠肝细胞的形态变化。结果 新鲜分离的原代小鼠肝细胞经Percoll低速离心纯化后,活率达到90%±5%,纯度达到95%±4%,产量达到9×10⁵~1×10⁶ g体质量。绝大部分原代小鼠肝细胞在体外培养3 h后贴壁生长,换无血清培养基体外培养24h后90%以上肝细胞呈典型的肝细胞形态特征(肝细胞为多边形,排列整齐,界限清晰,胞体较大,胞核呈圆形,大部分有双核以上的细胞核)。单层胶原培养的肝细胞,出现肝板样结构时间较短,4~5 d后细胞开始不断脱落、死亡;夹层培养的肝细胞可相对较长时间(>10 d)维持肝板样结构。结论 优化的肝细胞分离和纯化方法能更为稳定、有效获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞,用"三明治"夹层培养法能更为有效维持肝板样结构。
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  T17.16 基于化学品趋避和趋向试验的线虫亚急性毒性

  高珊;曾迎新;孔庆征;李煜;童英;李国君

  2013, 27(S1): 308-308.

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  目的 应用模式生物线虫的趋避试验和趋向试验这两个指标,来研究化学品的亚急性毒性。寻找趋避系数、趋向系数与化学品毒性分级间的联系,及线虫亚急性毒性指标与急性毒性指标之间的内在关联,探讨以亚急性毒性指标评价化学品毒性的可能性,并据此提出化学品的线虫亚急性毒性检测推荐指标及推荐染毒剂量范围,为今后本实验室的线虫毒性研究提供理论及实验基础。方法 选择了不同毒性等级的20种化学品,每种化学品以不同浓度梯度对线虫染毒6 h后,分别进行线虫趋避试验和趋向试验,并根据趋避及趋向公式,计算得出趋避系数及趋向系数。通过统计分析结果,判定化学品是否为趋避试验和趋向试验阳性。结果 本研究的结果表明,化学品的线虫的趋避系数及趋向系数与其化学品毒性分级(GHS)、24 h的LC₅₀有一定关联:GHS级别越高,出现趋避阳性的概率越低,且趋避阳性的阈剂量也越大;GHS分级越高,出现趋向阳性概率越高,且趋向阳性的阈剂量越小。结论 趋避试验和趋向试验结果与化学品毒性大小相关联,可以将这两个指标作为研究化学品的线虫亚急性毒性检测的推荐指标。趋避试验的剂量可以推荐为其24 h LC₅₀的1/3~1/6;趋向试验的剂量可以推荐为其24 h LC₅₀的1/2~1/19。
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  T20.31 百草枯对人胚胎神经干细胞细胞周期及调控的影响

  常秀丽;窦婷婷;王新金;周志俊

  2013, 27(S1): 374-374.

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  目的 观察百草枯对人胚神经干细胞细胞周期及细胞周期调控基因的影响。方法 以百草枯0.00, 0.10, 1.00和10.00 μmol·L^-1染毒人胚神经干细胞24 h后,为P1代细胞,收获P1代细胞继续培养48 h后即为D1代细胞,依次获得D2代细胞。百草枯染毒后用MTT法测定染毒细胞活力;用EdU法测定染毒母代及子代两代细胞的增殖情况,利用PCR测定染毒母代及子代两代细胞p53, p16和p21mRNA的表达情况。结果 随着百草枯浓度升高,ReNcell CX细胞活力逐渐下降,到100μmol·L^-1时,细胞活力已出现明显下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。百草枯1.0 μmol·L^-1时可明显抑制DNA的复制,且新合成DNA随着剂量的升高而减少,与对照组相比在统计学上差异具有显著意义(P<0.01),到D1及D2代10.0及100.0 μmol·L^-1组细胞在D1及D2代有所恢复,但与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。百草枯显著上调P1代细胞p53mRNA的表达,百草枯10.0 μmol·L^-1时,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),但在D2代细胞中与对照组相比差异无统计学意义。百草枯显著上调P1, D2代细胞p16mRNA的表达,在P1代细胞低剂量(1.0 μmol·L^-1)时,与对照组相比差异已有统计学意义(P<0.05);在D2代细胞中低、中剂量组未发现明显升高,高剂量(100.0 μmol·L^-1)与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。通过观察百草枯染毒24 h后P1代细胞及之后正常培养D2代细胞中细胞周期G₁/S转换抑制因子p16, p21mRNA的表达,发现在P1及D2代细胞中,百草枯都能上调p16, p21mRNA的表达,并且这一效应持续到未直接接触百草枯的子代细胞中。但发现在百草枯未上调D2代细胞中p53mRNA的表达时,p21mRNA的表达依旧升高。结论 百草枯在未引起明显细胞毒性剂量下已能抑制神经干细胞的增殖,并且增殖抑制作用可持续到未直接接触百草枯的子代细胞中,提示具有长期效应。细胞周期调控基因结果表明p53参与诱导了细胞周期阻滞,但还有不依赖于p53基因的调控通路的p21激活参与。
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  T20.35 多不饱和醛类化合物的生物学效应研究进展

  胡宇

  2013, 27(S1): 376-376.

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  多不饱和醛是一类广泛存在于环境中有机物.在外环境中,多不饱和醛类主要产生于有机物的不完全燃烧,如工业生产、香烟烟雾、机动车尾气、和烹饪油烟等.因而,人类可通过多种途径暴露于不饱和醛类化合物,同时,机体自身的生物化学作用过程也可产生内源性的不饱和醛类。 在氧化应激过程中,多不饱和醛类化合物是脂质过氧化的中间产物。近年来不饱和醛类的毒性作用和健康效应引起关注,并已取得一定成果。主要体现在如下方面:(1)多不饱和醛类与肿瘤发生的关系:研究发现一些不饱和醛,如丙烯醛,巴豆醛等已证明可诱导基因突变;抑制DNA修复;在肺癌患者肺组织中丙烯醛,巴豆醛DNA加合物水平明显升高;并且在流行病学研究中发现接触烹饪油烟与妇女肺癌的发生有关,因而提示其与肺癌、肝癌等肿瘤的发生有关。(2)多不饱和醛类与心血管系统疾病有关 研究发现丙烯醛可引起心肌氧化应激、相关蛋白修饰、心肌肥厚和炎症进而导致心功能下降;(3)多不饱和醛类与神经退行性系统疾病的关系:在对阿尔兹海默症的病人的研究发现,在临床前期的阿尔茨海默病患者的海马旁回(HPG),上、中颞脑回(SMTG)和小脑(CER)的丙烯醛水平明显增加。离体实验则提示丙烯醛可抑制抗氧化能力、诱导神经细胞的凋亡和坏死,因而可能是阿尔兹海默症的重要致病机制之一。今后应关注的研究热点:1)加强在人群流行病研究中针对多不饱和醛类化合物暴露和生物效应标志物,如蛋白和DNA加合物水平与相应健康危害关联的验证性研究;2)多不饱和醛类化合物毒性和致癌模型的研究;3多不饱和醛类化合物毒性作用机制,包括致癌机制和在心血管和神经退行性疾病中作用机制的研究。
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  T19.5 免疫毒理学和其在风险评估中的应用

  方瑾;贾旭东;李宁

  2013, 27(S1): 344-344.

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  免疫毒理学是研究外在因素影响机体后,免疫系统所被迫做出的一系列调节反应。毒理学评估已经证明免疫系统是机体暴露于各种外源物后的一个靶点,这些外源物包括:紫外辐射、化学污染物、治疗和康复药物。目前免疫反应抑制和对感染抵抗力下降以及不同类型肿瘤的形成之间已经有明确的因果关系。对于人体,轻微至中度的免疫抑制与社区获得性感染的抵抗力下降是有联系的;而对于那些出现严重免疫抑制的个体来说,出现机会致病菌感染的情况就会很普遍,虽然机会致病菌感染在普通人群中是很少见的。外源性物质暴露可能也会导致无意的免疫功能刺激,虽然这种无意的免疫功能刺激和一些不良后果之间还没有被确定下来,但是有证据显示当易感人群暴露于某种特殊的外源性物质时,过敏症、自身免疫性和病理性发炎将会恶化。外源物能作为过敏原和导致超敏反应,或者它们还能对其他过敏原导致的过敏反应进行调节,比如花粉或尘螨常起到"佐剂"的作用,增强了过敏反应的发展或者表达。过敏性接触性皮炎、过敏性鼻炎和哮喘这些生活中十分常见的过敏反应,都是暴露在化学物后导致的结果。自身免疫反应所涉及到的免疫效应物和机制与外来的抗原产生的反应是一样的;但是这些反应至针对宿主自身的细胞。然而,化学物诱导的免疫抑制、非特异性的免疫刺激或者超敏反应可能都会影响自身免疫性。针对免疫毒性的风险评估所遵循的方法和原则与针对其他非致癌效应的风险评估是一样的。但是,由于外源物影响对免疫功能的影响往往是多方面的,因此免疫毒性数据可能应该划分开来并逐个评价,这其中就包括了:免疫抑制、免疫刺激、致敏反应和自身免疫性。
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  T19.6 化学品人体系统毒性风险评估中的评估因子

  李昭元;宋健

  2013, 27(S1): 344-345.

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  对人体健康可能产生的潜在系统毒性进行风险评估是各国管理机构对化学品进行管理的重要环节。风险评估通过对化学物质的危害识别、剂量-反应关系评估、暴露评估和风险表征以确定人体暴露的风险可接受程度,并结合相应的风险交流以及风险管理措施,最终实现化学品的安全生产及使用。不同机构根据不同的化学品类别所发布的风险评估指南有所不同。欧盟消费者安全科学委员会(SCCS)发布的关于化妆品成分的检测及安全性评估指南,通过对合适的毒理学终点的剂量水平与消费者使用化妆品导致的对其中成分的暴露剂量进行比较,得出两者之间的安全边际(MoS)或者终生癌症风险度(LCR);欧洲化学品管理局(ECHA)发布的对化学品人体健康的风险评估指南通过对合适的毒理学终点的剂量水平施加评估因子(AF),最终推导出对人体健康的无作用水平(DNEL)或者最小作用水平(DMEL);人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)发布的关于药物中溶剂残留的指南文件,通过选取合适的毒理学终点的剂量水平,对其进行人体体重的调整以及施加必要的修正系数,最终推导出残留溶剂的允许每日暴露量(PDE)并且确定该残留溶剂的分类和残留量限值。而在缺乏针对某一化学物质的毒理学数据时,通常采用指南文件中的推荐(或默认)的评估因子进行定量评估。尽管在不同的指南规范中,对于评估因子的考虑内容和推荐(默认)的数值选取不尽相同,然而基本可将其概括为如下几个方面:1)种间差异:体现毒理学试验中的实验动物与人类之间的物种差异。并可进一步分为种间毒代动力学差异和种间毒效动力学差异。2)个体差异:体现人群内部不同个体间易感性的差异。并可进一步分为种内毒代动力学差异和种内毒效动力学差异。3)染毒时长:体现毒理学试验中的染毒时长与人体对化学物质的实际暴露时长之间的差异性,例如亚急性染毒向亚慢性/慢性长期染毒推导(取决于毒理学试验中的染毒时长和人体对化学物质的实际暴露时长之间的区别)。4)剂量-反应关系:体现毒理学试验中所发现的剂量-反应关系的可靠性,包括选取最低可见有害作用水平的不确定性、剂量-反应关系曲线的斜率和陡峭程度、试验方案的科学可靠性、毒作用模式的不确定性以及试验中表现出的毒作用严重程度的潜在不确定性等。5)数据库质量:体现现有毒理学资料数据库的数据可靠性,包括所有资料的完整性和一致性、替代方法的可靠性等。此外在选取合适的毒理学终点的剂量水平时,必须考虑毒理学试验中的染毒途径与人体对化学物质的实际暴露途径之间的相关性,以及两种途径之间推导时的生物利用度差异。同时也需要考虑毒理学试验中的染毒方式/条件与人体对化学物质的实际暴露方式/条件之间的相关性和差异性(每日染毒时间、染毒浓度-时间修正)以及潜在的毒作用恢复期差异等因素。通过从以上的评估选取合适的评估因子并相乘可得到总体评估因子,结合合适的毒理学实验结果剂量水平,推导出化学物质对人体健康的安全剂量,并与测量或估算的人体暴露剂量进行比较,最终确定化学物质的生产和/或使用过程的安全性风险是否可接受和可控(ECHA和ICH所采用)。或者通过比较合适的毒理学实验结果的剂量水平与测量或估算的人体暴露剂量之间的安全边际,判断安全边际是否充分,以确定化学物质使用过程的安全性风险是否可接受和可控(SCCS所采用)。在选择评估因子时,除考虑以上几方面的因素外还需遵循毒理学的个案分析的原则进行风险评估。
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  T2.11 化学品的降解性及其预测方法

  严超

  2013, 27(S1): 31-31.

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  化学品的降解性在化学品安全评估体系中是一个至关重要的性质,目前,物质的降解性数据主要来源于测试,但是已经有一些能够预测降解性的非测试方法。这种预测往往是用统计的方法将物质结构中的不同基团与降解性进行关联,从而判断物质整体的降解性。欧盟REACH法规中对于降解的定义为:会导致化学物质在环境中的损失或转化的行为。在欧盟REACH法规和我国的《新化学物质环境管理办法》中,物质的降解性质主要应用于三个方面:环境危害评估和分类,PBT/vPvB评估,暴露评估以及风险表征。物质在环境中的降解分为非生物降解和生物降解两类。非生物降解是物质通过化学或物理过程的降解,例如,水解、光解、氧化还原。其中,水解为主要途径。而生物降解是物质以生物为媒介发生的降解或转化,这里的生物通常是指微生物。生物降解的实质是微生物将污水中的有机物作为基质完成其代谢活动的过程。这一过程能否顺利进行最终取决于微生物的酶系统能否识别污水中的有机物。根据降解产物的不同,又分为初级生物降解和最终生物降解(Ultimate biodegradation)。在选择测试项目时,一般先做快速生物降解实验,如果物质不满足快速生物降解,会考虑开展固有生物降解实验,而模拟生物降解测试则需要根据危害评估,PBT/vPvB评估和风险表征的结果来判断是否需要开展。降解性的预测方法也分为非生物降解和生物降解两类。对于非生物降解,可以使用美国环境保护局(EPA)开发的QSAR软件EPI Suite,用于预测和筛选化学物质的性质。其中的HYDROWIN插件能够较为准确地预测具有水解基团的物质的水解性质。而AOPWIN插件能够预测物质与光照产生的羟基自由基或臭氧反应的速率和半衰期。预测生物降解性质的软件有几种。目前常用的软件是OECD组织开发的OECD TOOLBOX,它是一款集成了众多数据库和非测试方法,并且可以用于制作欧盟REACH法规下的QSAR软件。但是它的预测模型采用的是EPI Suite中的BIOWIN。另外,BIOWIN的模拟结果还可以用于预测PBT/vPvB评估中的的持久性。除了EPI Suite,还可以使用Toxtree来预测,其START biodegradation and persistence 插件,是由德国Molecular Networks GmbH公司为欧洲委员会联合研究中心开发的。此外,有些文献中也对预测模型有一定研究,其中比较被认可的是用基团贡献法预测有机物的生物降解性,即化合物的生物降解性与其基本结构和功能团有关,并由此证明可以由骨架结构和功能团以及受制于一定骨架结构的子结构来预测有机物生物降解性。
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  T2.13 单壁碳纳米管暴露致大鼠血管外膜损伤促进血管内膜病变作用

  林治卿;袭著革;闫峻;林本成;张华山

  2013, 27(S1): 32-33.

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  目的 探讨单壁碳纳米管(SWCNT)暴露致大鼠血管外膜损伤促进内膜病变的作用及影响机制。方法 ① 整体水平:形态结构学检测方面利用HE染色,高倍显微镜下观察外膜损伤效果及内膜的病理变化;通过对α-actin进行免疫组化染色,了解病变主要细胞成分;透射电镜观察血管外膜损伤后血管内膜细胞超微结构的改变。功能学检测方面利用免疫组织化学技术检测三种特异性抗原vimentin, desmin, α-SM-actin在血管内外膜的表达水平;应用BrdU标记阳性增殖细胞,免疫组化观察血管内外膜细胞增殖情况;利用免疫组化技术观察血管内、外膜胶原合成及分布变化;利用免疫组化技术观察TGF-β1, MCP-l, ICAM-1和VCAM-l及NADPH氧化酶p47phox在血管内、外膜的表达水平变化。② 细胞水平:采用胰酶消化法体外原代培养大鼠血管外膜成纤维细胞(AF)观察其在SWCNT暴露不同剂量和时相点细胞氧化应激、表型转化、迁移、增殖和细胞因子表达等方面的差异,从基因、蛋白和细胞水平对比分析SWCNT暴露条件下AF损伤的动态变化规律;采用贴块法体外原代培养血管内皮细胞(RAEC),观察不同浓度SWCNT处理AF不同时间在RNA干扰及特异性抑制剂预处理前后RAEC损伤相关分子的表达变化,从正反两方面探讨SWCNT暴露激活血管外膜及其成纤维细胞诱导血管内膜病变形成的分子机制。结果 整体水平研究结果表明与对照组比较,血管外膜胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ表达量显著增加;H-E染色显示,与对照组比较,SWCNT暴露组血管内膜在外膜损伤5 d及7 d 时正常,10 d开始出现轻微的增生性病变,30 d时形成了明显的内膜病变;透射电镜结果显示AF和RAEC均发生超微结构的改变;免疫组化结果显示SWCNTs暴露组血管内膜ICAM-1和VCAM-1呈过表达现象。细胞水平研究结果提示SWCNT暴露早期可通过激活非Smads依赖的JNK途径,后期主要通过激活TGF-β1/Smads信号传导途径,二者共同调控SM22α蛋白的表达,促进AF转化为MF;RAEC出现明显的氧化应激,活性氧激活血管内皮细胞内的核转录因子κB,启动血管内皮细胞内核转录因子κB信号途径而增加血管内皮细胞表面细胞间粘附分子-1的表达,介导中性粒细胞与血管内皮细胞的牢固粘附。结论 SWCNT暴露致血管外膜损伤与内膜病变的形成相关。SWCNT暴露致血管外膜发生氧化应激损伤致外膜成纤维细胞发生表型转化为肌成纤维细胞,后者发生增殖、迁移至内膜诱导血管内皮细胞分泌黏附因子,致血管内皮功能紊乱,促进血管内膜损伤的形成及发展。
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  T2.19 丙烯醛对PC12细胞的毒性作用及其机制

  陈佳红;朱文秀;潘菲菲;胡宇

  2013, 27(S1): 35-36.

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  目的 探讨丙烯醛对其毒性作用及其可能机制,为丙烯醛对阿尔兹海默症(AD)的发病机制研究提供依据。方法 通过细胞急性毒性实验(CCK-8毒性实验和集落形成实验)测得LC₅₀;运用Spectra Max M3型酶标仪对不同浓度丙烯醛处理后的细胞内总GSH含量和胱天蛋白酶3酶活性进行测定,并通过Western blot检测胱天蛋白酶3蛋白质在不同浓度丙烯醛处理PC12细胞后的表达情况,从而了解细胞内氧化还原状态和细胞死亡机制;同时通过测序初步筛查丙烯醛诱导PC12细胞的miRNAs差异表达。结果 丙烯醛经CCK-8急性毒性实验测定其LC₅₀=29.9065 μmol·L^-1,集落形成实验测定LC₅₀=21.6159 μmol·L^-1;不同浓度丙烯醛处理PC12细胞24 h后可引起细胞内总GSH的下降,且浓度越大,细胞内总GSH含量下降更明显;不同浓度丙烯醛处理24 h后细胞内胱天蛋白酶3酶活性未见明显上调,但处理较短时间(2, 4和8 h)可见上调倾向;用胱天蛋白酶3作为一抗对不同浓度丙烯醛处理24后进行Western blot实验可见胱天蛋白酶3蛋白表达,其中丙烯醛浓度越高,蛋白表达越低;较低剂量(16和32 μmol·L^-1)丙烯醛处理PC12细胞24 h后可诱导部分miRNA的差异表达。结论 丙烯醛对PC12细胞产生较强的细胞毒性,其可能机制为通过细胞内GSH的耗竭和DNA氧化性损伤,造成氧化应激;不同浓度丙烯醛处理PC12细胞可诱导细胞凋亡。
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  T2.21 多氯联苯引起幼年大鼠学习记忆损伤及对CREB信号通路的影响

  刘承芸;白文琳;陈浔;刘君;牛侨

  2013, 27(S1): 36-37.

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  目的 探讨多氯联苯(PCB)对幼年大鼠学习记忆的损伤以及CREB信号通路在其中的作用。方法 将健康新生SD大鼠48只随机分为4组,每组12只。分别为对照组(玉米油组)、aroclor1254低剂量组(2 mg·kg^-1)、中剂量组(4 mg·kg^-1)、高剂量组(8 mg·kg^-1 BW),出生后第7天、9天、11天分别对大鼠进行腹腔注射染毒。每组4只大鼠于出生2周后处死,8只于出生4周后进行Morris水迷宫实验,然后处死,提取脑组织,匀浆,提取mRNA,采用荧光定量PCR检测CREB、BNDF表达。结果 定位航行实验:经重复测量的方差分析,各组仔鼠逃避潜伏期随训练时间延长而明显缩短(F=3.197,P=0.00)。同一天中,各染毒组仔鼠逃避潜伏期较对照组相对延长,但差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组穿越平台的次数依次减少,差别有统计学意义(P<0.05)。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别与对照组比较潜伏期均明显延长,差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量组、中剂量组、高剂量组相互间比较差异无统计学意义。与对照组相比,低、中、高剂量组CREB mRNA表达量均显著增加(P<0.05),而BDNF mRNA表达量显著减少(P<0.05),经pearson相关分析,CREB与BDNF表达显著负相关(P<0.05)。结论 幼年期染毒Aroclor1254能引起大鼠学习记忆损伤,并且CREB和BNDF mRNA的表达受到影响,二者的表达具有一定的相关性。
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  T2.23 粉笔尘对大鼠肺泡巨噬细胞化学发光的影响

  张月霞;杨振华;耿红;董川

  2013, 27(S1): 38-38.

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  目的 研究粉笔尘对巨噬细胞化学发光的影响。方法 本文应用定量电子探针微区分析技术(也称低原子序数颗粒物电子探针微区分析技术(low-Z particle EPMA)和激光粒度仪分别测定了三个不同厂家的粉笔尘颗粒的组成成分以及各样品的粒度分布。并通过建立Wistar大鼠肺泡巨噬细胞体外感染模型,利用生物发光技术, 用BPCL微弱发光测量仪测定受不同粉笔尘颗粒染毒后大鼠肺泡巨噬细胞的生物发光强度,从而测定粉笔尘颗粒对AM的毒性大小。结果 (1)不同种类的粉笔在书写和擦除过程中产生的粉笔尘粒径大小不同。粉笔硬度越大,其产生的粉笔尘数量越少,粉笔尘颗粒的粒径越大。(2)三种不同厂家粉笔尘的主要成分均为CaSO₄,此外还含有少量Al和Mg等金属元素;(3)三种厂家的粉笔尘诱导AM产生的化学发光不同。粒径越小的粉笔尘,诱使细胞产生的化学发光越强。并且三种粉笔尘较标准硫酸钙粉尘引起的化学发光小。结论 粉笔尘对大鼠巨噬细胞有一定的毒性作用,且其毒性作用与粉笔尘的粒径关系密切。
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  T2.26 微囊藻毒素-LR对小鼠肝组织DNA甲基化的影响

  农清清;何灏逾;韦宏旷;陆继培;李春宏;范誉

  2013, 27(S1): 39-40.

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  目的 研究微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MCLR)短期重复暴露对小鼠肝组织DNA总体甲基化水平、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT) mRNA表达的影响。方法 80只健康昆明小鼠,随机分为2批,每批4组,每组10只,即对照组(含0.02%二甲基亚砜的生理盐水0.005 ml·g^-1)、MCLR低(5 μg·kg^-1)、中(10 μg·kg^-1)、高(20 μg·kg^-1)剂量组,每日经腹腔注射染毒,分别染毒10和20 d。提取并水解小鼠肝组织DNA,采用高效液相色谱法测定DNA总体甲基化水平;提取肝组织总RNA,逆转录成cDNA,用实时荧光定量PCR法测定DNMT1, DNMT3a, DNMT3b的mRNA表达水平。结果 染毒10 d后,各剂量组DNA总体甲基化水平未出现明显差异。染毒20 d中、高剂量组DNA总体甲基化水平为(2.26±0.60)%和(2.16±0.51)%,均低于对照组的(3.31±0.86)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。染毒10 d高剂量组DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的mRNA表达水平均下调(P<0.05),染毒20 d后,中、高剂量组中DNMT1, DNMT3a及DNMT3b的mRNA表达水平与对照组比较均下降(P<0.05),其中,中剂量组DNMT1, DNMT3a及DNMT3b的mRNA表达水平分别降至对照组的38.3%, 59.9%, 21.5%,差异均有统计学意义(P<0.05)。肝组织DNMT1, DNMT3a, DNMT3b mRNA表达水平与DNA总体甲基化水平呈正相关关系(r_DNMT1=0.47,P<0.01;r_DNMT3a=0.37,P<0.01;r_DNMT3b=0.36,P<0.05)。结论 MCLR短期重复暴露可抑制小鼠肝组织DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达,降低DNA总体甲基化水平。MCLR引起的基因组总体DNA甲基化水平降低可能与DNMT1, DNMT3a和DNMT3b的表达下调有关。
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  T2.29 补铁对慢性铅暴露导致的听力损伤及血迷路屏障破坏的保护作用

  刘新秦;郑刚;沈学锋;骆文静;陈景元

  2013, 27(S1): 41-42.

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  目的 研究铅暴露对听力的损伤作用,并从血-迷路屏障(BLB)损伤以及紧密连接蛋白表达水平改变等角度研究铅损伤听力的机制。同时研究补铁对铅暴露所致听力损伤的防护作用,为进一步明确补铁对铅暴露所引起耳毒性的防护作用提供理论依据。方法 以断乳SD大鼠,自由饮用含300 ppm Pb(AC)₂的去离子水8周,建立慢性铅中毒模型。采用原子吸收法检测大鼠血铅水平,听性脑干反应(ABR)检测确定听觉阈值。FITC-鬼笔环肽染色观察外毛细胞形态变化;透射电镜观察耳蜗血管纹微血管壁的通透性及其内皮细胞间紧密连接结构的变化。免疫荧光法检测耳蜗血管纹紧密连接蛋白ZO-1, Occludin, Claudin-5的表达水平。结果 慢性铅暴露引起大鼠血铅水平显著提高(P<0.05),达到铅中毒水平。铅暴露组大鼠ABR阈值与对照组相比提高约39%(P<0.05),提示听力损伤。鬼笔环肽染色结果显示铅暴露致大鼠耳蜗外毛细胞形态结构改变,表现为纤毛排列紊乱,出现倒伏或融合消失的情况;透射电镜结果显示:铅暴露导致大鼠耳蜗微血管壁对硝酸镧分子的通透性增加,而内皮细胞间紧密连接结构破坏;免疫荧光结果显示,铅暴露大鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白ZO-1, 闭合蛋白, 密封蛋白5的表达水平与对照组相比均显著下降(P<0.01)。铅暴露期间补铁(7 mg Fe²⁺/kg,2次/周)可以显著抑制铅引起的ABR阈值增高(P<0.05),并显著减少硝酸镧分子在BLB的通过量(P<0.01)。另外,免疫荧光结果表明补铁可以逆转铅暴露所致的紧密连接蛋白表达水平下降。结论 慢性铅暴露引起大鼠听觉系统损伤,表现为听阈增高、耳蜗外毛细胞形态改变。铅可能通过下调耳蜗微血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达水平,造成紧密连接结构破坏,从而引起大鼠耳蜗BLB通透性的增高。这种BLB结构和功能的损伤可能导致内耳微环境的紊乱,参与铅所引起耳毒性的病理过程。补铁可在一定程度上抑制铅所引起的听力损伤,并对BLB的结构和功能产生了较显著的保护作用,提示补铁对于铅中毒所致听力损伤的防治可能具有良好的应用前景。
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  T2.32 全氟辛酸铵的斑马鱼急性毒性

  崔媛;程艳;刘伟;谢文平;陈会明;李海山;宋乃宁;李蕾;艾文超;王琤

  2013, 27(S1): 43-43.

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  全氟辛酸铵(PFOA)是一类重要的新型持久性有机污染物,可被广泛应用于航空科技、运输、电子行业,以及厨具等民生用品。当PFOA 分解后会在环境或人体中释放出来。对环境和人体造成毒性危害,具有很高的生物蓄积性及生物毒性。本研究严格遵循良好实验室规范(GLP),进行了PFOA的斑马鱼(Brachydanio rerio)96 h急性毒性实验。受试斑马鱼的筛选采用K₂Cr₂O₄参比实验。根据LC-MS对PFOA在水中的稳定性进行检测分析,表明PFOA在水中很稳定,故急性毒性实验采用静态染毒法。根据预实验记录得到的致使实验鱼全部死亡的最低浓度和对实验鱼无影响的最高浓度,确定正式实验染毒浓度设定为0, 20, 40, 60, 80, 120和150 mg·L^-1,并设置空白对照,以96 h为实验周期,在24, 48, 72和96 h时记录鱼的死亡率,采用SPSS软件统计得到96 h时的50%实验鱼死亡时的受试物浓度(LC₅₀)和95%置信限,以及致使实验鱼全部死亡的受试物最低浓度和对实验鱼无影响的受试物最高浓度。PFOA对斑马鱼96 h LC₅₀为63.38 mg·L^-1, 95%置信限为60.0~71.0 mg·L^-1。PFOS对斑马鱼最高无作用浓度为20.0 mg·L^-1、最低全致死浓度为150.0 mg·L^-1。本实验结果,根据《全球化学品分类和标签协调手册》(GHS)对PFOA的急性水环境毒性进行分类定级,表明PFOA的急性水环境毒性分级类型为急性Ⅲ。
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  T2.35 全氟化合物去乙酰化酶抑制活性研究

  王玲;曹慧明;傅建捷;张爱茜

  2013, 27(S1): 44-44.

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  目的 开展全氟化合物(PFC)去乙酰化酶抑制性能的分子机制研究。方法 本研究以组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)抑制剂Trichostatin A(TSA),丁酸钠及丙戊酸钠作为阳性对照,人重组HDAC3酶为靶标展开暴露实验,并结合分子模拟方法,模拟PFC化合物分子与人HDAC3蛋白的结合模式。结果 全氟羧酸与全氟磺酸化合物对HDAC3抑制性能受其碳链长度控制。短碳链的全氟辛酸、全氟戊酸和全氟己酸在暴露浓度范围内对HDAC3酶的活性没有显著影响,然而随着碳链长度的增加,全氟庚酸、全氟辛酸、全氟辛基磺酸、全氟壬酸及全氟癸酸会在一定暴露水平对HDAC3酶显现出抑制效应,且与阳性对照丁酸钠丙戊酸钠相比,其抑制作用相当或更强。分子模拟结果显示,不同链长PFC的HDAC3抑制机制存在一定差异,短碳链的全氟化合物在HDAC3中的结合模式与丁酸钠及丙戊酸钠相似,但长碳链的全氟化合物则通过阻挡HDAC3配体作用的疏水通道而产生抑制效应。结论 PFC在一定浓度范围内的对HDAC3酶的活性有明显的抑制作用,表现出剂量效应关系,随着碳链增长,其起效浓度和IC₅₀越低。不同链长PFC的HDAC3抑制机制存在一定差异。因此,PFC很可能通过抑制生物体去乙酰化酶的活性,关闭下游脂代谢相关基因的表达,从而影响干扰生物体脂类代谢过程。
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  T2.38 应用T-REX模型评价阿维菌素对鸟类的生态风险

  程燕;谭丽超;田丰;韩志华;周军英;单正军

  2013, 27(S1): 46-46.

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  应用陆生评价模型-T-REX评价阿维菌素在水稻、棉花、蔬菜、果树等作物上使用后对鸟类的风险。阿维菌素是当前生物农药市场中最受欢迎的产品,在多个国家均有登记。在我国,阿维菌素登记产家达1000多家,产品有数百种。已有数据表明,阿维菌素对绿头野鸭的急性经口半致死剂量(LD₅₀)为84.6 mg·kg^-1,属中毒,对北美鹌鹑的急性经口LD₅₀ >2000 mg·kg^-1,属低毒。虽然阿维菌素对鸟类的急性毒性不高,但其使用后对鸟类的风险仍值得探究。T-REX(Terrestrial Residue EXposure model)模型是美国环保署(EPA)开发的陆生暴露评价模型,用于预测农药使用对鸟类和哺乳动物的风险。模型预测结果表明:阿维菌素以常用剂量5.4, 32.4, 10.8及12 g·ha^-1分别在水稻、棉花、蔬菜、果树上喷雾使用,对以草、阔叶植物、果实等为食的大(1000 g)、中(100 g)、小(20 g)型鸟均无急性风险。研究结果与国外研究报道极为吻合。研究一方面可为阿维菌素的合理使用提供科学参考,另一方面,可为完善我国农药陆生生态风险评价技术提供应用依据。
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  T2.40 生物降解实验中接种物标准化

  杨婧;陈晓倩;杨帆;杨和行;殷浩文

  2013, 27(S1): 47-47.

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  本文针对降解实验中接种物采集困难、活性差异大、实验可重复性及结果可比性差的问题展开接种物标准化研究。对多来源的接种物在实验室可控条件下进行驯养,将驯养后生长状态良好的活性污泥分别固定于2种微生物载体上,形成2种固定化接种物(分别简称为Bran及Ball)。对上述固定化接种物进行微生物活性、适应性、降解能力以及稳定性研究:通过2种固定化接种物与商业化接种物Polyseed的葡萄糖-谷氨酸(GGA)的五日生化需氧量(BOD₅)结果与活菌细胞数的关系,确认3种接种物在降解实验中的用量可控制在相同数量级;比较不同批次及保存时间的2种固定化接种物、相同批次不同保存实验的Polyseed以及污水处理厂曝气池污泥为接种物对苯胺及二甘醇的快速生物降解实验(OECD301F)结果,Ball及Bran对二甘醇的降解延滞期分别在4.0~7.0 d及4.5~5.8 d,的降解延滞期普遍短与Polyseed及新鲜采集的活性污泥,具良好的微生物适应性。Ball及Bran对二甘醇28 d的降解率分别为72.02%~81.08%及74.37%~89.14%,降解能力较Polyseed及单一来源活性污泥更佳。Ball及Bran对苯胺28d的降解率分别为90.44%~96.93%及89.36%~92.95%,降解能力及结果的重复性普遍均优于Polyseed;此外,2种固定化接种物的活菌细胞数尽管在固定化期间及固定后保存阶段有不同程度减少,但在固定后30~60 d的保存期内仍可维持在与固定后5d相同的数量级上,故在此期间始终固定接种物用量,不会对降解实验结果造成本质影响。2种固定化接种物微生物活性、适应性、降解能力良好,在较长的保存周期内活性相对稳定,初具成为标准化接种物的必要条件。
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  T2.43 PM_2.5对Beas-2B细胞的遗传毒性评价

  李利忠;苑晓燕;王以美;彭双清

  2013, 27(S1): 48-49.

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  目的 评价我国华中武汉地区PM_2.5的遗传毒性,为开展该地区PM_2.5的健康危害评估提供实验依据。方法 采集武汉市汉口和汉阳地区的PM_2.5样本,以超声水提法提取水溶性组分用于遗传毒性评价。实验设1个对照组和6个剂量PM_2.5处理组,剂量分别为6.25, 12.5, 25, 50, 100和200 mg·L^-1,染毒24 h,分别采用微核实验和单细胞凝胶电泳实验测定PM_2.5对Beas-2B细胞的染色体损伤和DNA损伤情况。结果 ① 与对照组相比,汉口和汉阳地区的PM_2.5可致Beas-2B细胞发生染色体损伤,PM_2.5剂量为50 mg·L^-1时,细胞微核率显著升高,并开始呈现剂量反应关系 (随着剂量升高,汉阳组微核率依次为7‰, 8‰, 9‰, 13‰, 22‰, 27‰和32‰;汉口组微核率依次为7‰, 8‰, 11‰, 14‰, 22‰, 26‰和26‰);② 与对照组相比,汉口和汉阳地区的PM_2.5可致Beas-2B细胞发生DNA损伤,主要表现为:PM_2.5剂量为25 mg·L^-1时,细胞核出现明显拖尾,形成彗星样,并呈现一定的剂量反应关系(随着剂量升高,汉阳组彗星尾长依次为14, 20, 27, 80, 101, 129和204 μm,彗星尾矩依次为1.48, 2.49, 3.93, 20.14, 30.79, 48.05和78.95 μm;随着剂量升高,汉口组彗星尾长依次为17, 21, 31, 46, 97, 131和189 μm,彗星尾矩依次为1.29, 3.78, 6.38, 19.85, 24.14, 34.2和52.76 μm)。结论 汉口和汉阳地区的PM_2.5均可引起Beas-2B细胞微核率升高和细胞DNA损伤,且呈一定的剂量-反应关系,表明这两个地区的PM_2.5在一定剂量水平下具有遗传毒性。
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  T2.46 欧盟化学工业和化学品相关的四部法规介绍

  张梦莎;霍立彬;刘晓建;聂晶磊

  2013, 27(S1): 50-50.

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  本文简要介绍了欧盟法规文本的种类,并从与化学工业和化学品相关的四部法规REACH(Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals)条例,即《化学品的注册、评估、授权和限制》条例;IPPC(Integrated Pollution Prevention and Control)指令,即《污染物释放转移登记指令》;PRTR条例(Pollutant Release and Transfer Register)和Seveso指令,即《综合污染预防与控制指令》入手,围绕化学品环境管理,说明这四部法规的演化过程,设计目的、管理范围和主要内容,并对比了中国在化学品法规方面的情况,提出了相关建议。
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  T2.49 双酚A对免疫系统的影响及其毒性机制的研究进展

  张岭;丁泽沅;王强

  2013, 27(S1): 51-52.

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  双酚A(BPA)是一种人工合成广泛存在于环境中具有拟雌激素功能的环境内分泌干扰物,可作为食品和饮料的聚碳酸酯包装材料、金属罐头的树脂内膜、牙齿固封剂、输液袋以及其他产品的添加剂而被大量使用。人群流行病学研究发现不同年龄、不同地区的人群体内尿液和血液中均可检测到BPA的存在。由于BPA产量高及普遍被人类接触,一直是人们研究的热点。国内外研究表明长期低剂量BPA暴露对生殖、发育、肿瘤发生、神经系统、免疫系统等功能产生影响。近年来研究发现BPA能够透过胎盘屏障并通过乳汁传递给子代, 减少子代抗菌、抗感染、抗肿瘤的能力, 降低机体免疫功能,表明围生期BPA暴露对子代免疫系统产生潜在的影响,并可能导致不同生命阶段的免疫性疾病,这种暴露状况与当前幼儿及青少年的免疫相关疾病如自闭症、系统性红斑狼疮、过敏性疾病、变应性疾病等发病率的升高具有一定的相关性。体内外实验进一步发现BPA对多种免疫细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞等)均有毒性作用。小鼠围生期暴露于BPA后,CD4⁺和CD25⁺的调节性T细胞数量明显减少。BPA可以影响T细胞的增殖、Th1或Th2细胞的分化,BPA导致Th2细胞分化可能与过敏反应和哮喘等疾病有关。BPA还可以诱导B细胞激活,以及通过降低巨噬细胞的吸附能力和抑制巨噬细胞产生NO和脂多糖(LPS)来影响巨噬细胞的功能。BPA影响免疫应答的机制可能与雌激素受体(ER)、芳香烃受体(AhR)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)有关。本文我们探讨了双酚A 对免疫系统的影响及其毒性机制,为BPA等环境内分泌干扰物毒性研究提供理论依据。
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  T2.51 三邻甲苯磷酸酯暴露对鸡脊髓基因表达谱的影响

  李双月;朴丰源

  2013, 27(S1): 52-53.

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  目的 从三邻甲苯磷酸酯(TOCP)暴露鸡的脊髓组织中筛选迟发性神经毒性(OPIDN)相关基因,为探讨OPIDN的发病机制提供靶基因信息谱。方法 利用苯甲基磺酰氟(PMSF)在有机磷化合物(OP)暴露之前给予能防止OPIDN发生,但对OP的急性毒性却无影响的这一作用特点,在OP暴露之前进行PMSF干预,通过OP和PMSF的联合应用,筛选OPIDN相关差异表达基因。成年母鸡12只,随机分为TOCP暴露组(1000 mg·kg^-1,一次灌胃给予)、先给PMSF后再暴露TOCP的PMSF干预组(皮下注射PMSF 40 mg·kg^-124 h后再一次性灌胃TOCP 1000 mg·kg^-1)和生理盐水对照组。染毒第5天处死鸡,低温下分离脊髓腰段制成匀浆,并依次进行总RNA提取、纯化、体外转录合成cRNA探针、生物素标记、Chicken Genome 430 2.0 array基因芯片杂交、扫描杂交信号、最后进行芯片数据处理和生物信息学分析。以差异倍数大于2或小于-2有统计学意义(P<0.05)。结果 基因芯片结果显示,与对照组相比,TOCP组有748个基因差异表达,根据PMSF的特点,在这些差异表达基因中选择与PMSF干预组比较无显著差异的基因520个,包括上调基因205个和下调基因315个;其中差异表达在3倍以上基因有36个,上调基因13个和下调基因23个;主要包括神经递质传递、细胞骨架、细胞凋亡等相关功能蛋白基因。结论 TOCP暴露鸡脊髓基因表达谱中有520个基因与OPIDN相关,其中有36个基因与OPIDN关系比较密切,值得进一步探讨其与OPIDN发病机制的关系。
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  T8.10 快速生物降解性试验活性污泥酶活测定方法的优化及应用

  梅承芳;;李斯颖;孙国萍;曾国驱;;许玫英;

  2013, 27(S1): 210-211.

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  目的 建立活性污泥酶活快速测定方法,并利用优化的方法对来源于广州市不同污水处理厂的活性污泥酶活进行测定和比较,为规范快速生物降解性试验中接种物的酶活性提供参考。方法 选取以处理生活污水为主的污水处理厂的活性污泥进行酶活测定方法的优化。根据文献选取了6种酶,分别为:L-亮氨酸氨基肽酶、棕榈酸脂酶、磷酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、磷酸酶和脱氢酶,其作用底物分别为:L-亮氨酸-4-硝基苯胺、4-硝基苯棕榈酸盐、双-(4-硝基苯)磷酸酯、4-硝基-α-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯磷酸二钠、碘硝基四睦紫。用分光光度计测其反应产物吸光度。从pH、反应温度、反应时间、反应终止方法和污泥浓度等5个方面对酶活测定方法进行探讨。利用优化后的酶活测定方法对来自4个不同污水处理厂的活性污泥酶活进行测定,其中2个为生活污水处理厂,1个为石化污水处理厂,1个为综合性污水处理厂,其生活污水与工业污水的比例为7/3(V/V)。结果 L-亮氨酸氨基肽酶最适反应pH为7.4,磷酸酯酶、磷酸酶和脱氢酶反应最适pH为7.9,棕榈酸脂酶和α-葡萄糖苷酶的最适pH为8.4。6种酶活的最适反应温度均为37℃。α-葡萄糖苷酶获得酶活最大反应速率的反应时间为90 min,其余酶活的最适反应时间为60 min。L-亮氨酸氨基肽酶、棕榈酸脂酶、磷酸酯酶和α-葡萄糖苷酶反应的终止方法为99℃水浴加热,磷酸酶反应的则为加入10 mol·L^-1 NaOH终止剂,脱氢酶反应的终止剂为乙醇:二甲基甲酰胺=1:1。6种酶活测定的最适污泥浓度分别为1000, 500, 1000, 3000, 500和500 mg·L^-1。利用优化的方法测定了来自上述4个污水处理厂活性污泥的6种酶活,发现4种污泥中脱氢酶活力皆最高,碳源较为单一的石化污水处理厂活性污泥的各种酶活普遍较低,综合性污水处理厂活性污泥的各种酶活普遍高于其他3种活性污泥。结论 采用本研究中优化后得到的酶活测定方法可在2 h内完成4种不同来源的活性污泥样品中6种酶活的测定。其中石化污水处理厂的6种酶活均为最低,这可能与其污水中所含碳源较为单一有关。综合性污水处理厂活性污泥的脱氢酶活显著高于2个生活污水处理厂的活性污泥,但其余5种酶的活力差异不大,原因可能与综合性污水处理厂所处理的污水来源复杂多样,其进水COD浓度为500~600 mg·L^-1,远高于生活污水处理厂200~300 mg·L^-1,为活性污泥中的微生物提供了充分的、复合性的有机营养,从而维持了较高的脱氢酶活性。
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  T8.12 氯甲基杂氮硅三环的慢性毒性

  黄建勋;阙冰玲;葛怡琛;宋向荣;蔡婷峰;陈晓燕;赖关朝

  2013, 27(S1): 211-212.

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  目的 了解氯甲基杂氮硅三环慢性毒性。方法 采用PF级SD大鼠进行2年(104周)经口饲喂慢性毒性试验。雌性动物各组染毒剂量分别为0, 0.44, 1.30和4.00 mg·kg^-1·d^-1,雄性动物各组染毒剂量分别为0, 0.37, 1.17和3.44 mg·kg^-1·d^-1。实验期间连续对动物进行体重、摄食量测定及临床症状观察;并于试验第6, 12, 18和24个月进行动物血液常规(17项)、血液生化(14项)、尿液常规(10项)等检测;对实验期间死亡或濒死而处死的动物及实验第12和24个月全部存活动物分别进行解剖和全面的系统的肉眼观察,并对解剖的器官组织(37个)和肿瘤进行病理组织学检查。结果 在本实验条件下,一定剂量的98%氯甲基杂氮硅三环对SD大鼠的小脑、淋巴结、胃、肺脏、脾脏等器官有一定程度的慢性毒性作用。结论 SD大鼠连续摄食98%硅丰环原药2年(104周),在雌性动物的最大无作用剂量为0.44 mg·kg^-1·d^-1,雄性的最大无作用剂量为0.37 mg·kg^-1·d^-1。若以100倍安全系数计,则其日容许摄入量(ADI)为0.0037 mg·kg^-1·d^-1。
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  T8.15 中美化学品实验室管理体系比对研究

  于丽娜;刘纯新;聂晶磊;付立杰;沈英娃;霍立彬

  2013, 27(S1): 213-213.

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  通过比对美国化学品GLP体系与我国化学品测试合格实验室管理体系的差异,指出我国化学品实验室在管理上需要进一步建设完善的体系,高效的检查流程,并加强重点检查项目和不符合项的监督管理。借鉴美国环保局的化学品实验室管理体系的丰富经验,为我国化学品实验室建设提供参照依据。通过比对我国与美国EPA化学品GLP管理体系的差别,为我国化学品实验室管理水平提高和技术能力加强提供参照依据。美国EPA实验室检查与我国不同,EPA检查是执法行为,不是实验室申请来检查。管理体系上,美国EPA GLP规范准则对管理体系框架做出规定,再通过advisories不断补充细节。我国实验室管理是通过制定规范标准,再修订标准完善内容。目前,我国已通过环保部检查的GLP实验室,只是授予生态毒理的测试项目GLP证书。美国GLP检查是测试项目一次性全部检查,不分别开展理化性质、环境生态和健康毒理各领域的检查,减化检查程序,减少对实验室日常测试的影响;美国EPA在实验室检查过程中,发现的不符合项,是GLP检查的重点内容,这些检查项为我国化学品合格实验室检查提供借鉴。
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  T9.2 尺寸对氧化石墨烯生物效应的影响

  王海芳;刘佳蕙;常艳丽;杨胜韬;曹傲能;刘元方;

  2013, 27(S1): 214-214.

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  氧化石墨烯(GO)是新兴纳米材料石墨烯的重要衍生物,由于性能优异、合成简单、成本低、易于修饰等优点,在多个领域有广泛的应用前景。GO在生物成像和药物载带方面性能良好;GO可以用来制备各种石墨烯复合材料,用于催化、电极和膜材料领域。为了更好和更安全的应用,需要了解氧化石墨烯的生物效应。这方面的工作已经有不少,但少有工作关注GO的尺寸效应。我们在细胞和动物水平上研究了GO片的尺寸对其生物效应的影响。我们研究了不同尺寸的GO对人肺癌上皮细胞A549的毒性影响及作用机制。GO的细胞毒性较小;但在高剂量下,小片GO比大片GO对细胞活力抑制更为明显。另外,我们发现与GO共培养后,细胞对某些重金属离子的敏感性有变化,如镉离子。在动物水平,我们利用放射性示踪技术和毒理学研究方法观察了尺寸对GO在小鼠体内生物分布和毒性的影响。静脉注射的GO均迅速从血液中清除,主要聚集在肝肾中。大片的GO主要聚集于肺中;小片GO主要聚集于肝中,但随着剂量增加,小片GO在肺中逐渐富集,肝摄入逐渐减小。GO生物分布的不同源于GO能够与血浆中的蛋白作用形成GO-蛋白质复合颗粒,大尺寸和高剂量都能促进GO形成更大的复合体,从而被肺截留。肺部滴注的GO主要聚集在小鼠肺中,大部分不能进入血液循环系统;而通过灌胃进入小鼠体内的GO几乎不被小鼠吸收。GO的毒性与其生物分布具有很好的相关性。滞留在肺中的GO引起肺纤维化和富含GO的细胞结节的形成。多次注射大片GO对小鼠的损伤最大,可以造成严重的肺纤维化和囊肿的形成;也观察到一定的肝肾损伤。我们的实验结果表明GO片的尺寸对其生物效应有非常显著的影响。
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  T9.9 纳米银对肝细胞毒性效应

  黄艳梅;巩凡;薛玉英;张婷;唐萌

  2013, 27(S1): 218-218.

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  目的 探讨纳米银对肝细胞的毒性效应,为纳米银毒性作用的深入研究提供依据。方法 纳米银粉体购自上海沪正纳米科技有限公司,HepG2细胞株和L02细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所。利用透射电镜和扫描电镜观测纳米银颗粒形态和粒径分布。纳米银溶液(0, 20, 40, 80和160 mg·L^-1)分别处理肝细胞24和48 h,采用荧光倒置显微镜观察细胞形态, MTT比色法、乳酸脱氢酶(LDH)活性检测细胞活性,流式细胞术检测染毒细胞凋亡率。结果 电镜下观察纳米银颗粒为类球形,分散均匀,无团聚现象,平均粒径为(21.8±4.8)nm。荧光倒置显微镜下观察,对照组L02细胞形态为不规则多边形,大小均一,贴壁生长;160 mg·L^-1纳米银染毒组L02细胞内黑色颗粒增多,细胞数量有所减少,细胞间距离变大,不再聚集生长。对照组HepG2细胞形态为梭形,轮廓清晰,贴壁生长;160 mg·L^-1纳米银染毒组贴壁细胞数量明显减少,细胞皱缩变圆,无明显的细胞形态。通过MTT法测定细胞活性,染毒24 h,较低剂量(20, 40和80 mg·L^-1)下纳米银对L02细胞无明显增殖抑制作用,而对HepG2细胞产生明显增值抑制作用;染毒48 h,纳米银对两种肝细胞的生长增殖均有一定抑制作用,且细胞活性随染毒剂量增大逐渐降低,表现出明显的剂量效应。染毒24 或48 h细胞活性比较结果表明,染毒48 h两种肝细胞的增殖能力明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。细胞上清液中LDH的释放率结果表明,随着纳米银染毒剂量的增加,两种肝细胞LDH释放率均明显升高,染毒48 h组LDH释放率明显高于染毒24 h组,差异具有统计学意义(P<0.05);且相同染毒剂量下HepG2细胞LDH的释放率明显高于L02细胞,差异具有统计学意义(P<0.05),与MTT结果相一致。流式细胞术结果表明,与对照组相比,纳米银对两种肝细胞早期凋亡率,以及HepG2细胞的ROS水平增高显著,具有时间和剂量依赖效应;且纳米银诱导HepG2细胞早期凋亡率明显高于L02细胞,差异具有统计学意义(P<0.05);然而纳米银染毒后L02细胞的ROS水平与对照组相比没有显著提高。结论 纳米银对肝细胞有一定的毒性作用,能抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,且HepG2细胞的凋亡可能与氧化应激有关。与正常人肝细胞株L02比较,纳米银对人肝癌细胞株HepG2具有更强的毒性作用。
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  T9.19 大鼠亚慢性染毒纳米碳酸钙的组织病理学改变

  郑金平;胡博骅;刘卫花;冯涓;钱怡;仇玉兰;吕懿;唐仕川

  2013, 27(S1): 223-223.

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  目的 探讨纳米碳酸钙的毒性和可能靶器官。方法 选取健康SD大鼠100只,随机分为空白组、微米碳酸钙组(200 mg·kg^-1)、纳米碳酸钙组(12.5, 50和200 mg·kg^-1)。滴鼻染毒,每周5次,连续12周。最后一次染毒24 h后,腹主动脉采血并处死动物,取心、肝、脾、肺、肾、脑组织,观察大体形态称重,计算各脏器脏器系数。4%中性甲醛固定脏器,乙醇脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,并采用微观病理数字成像技术采集病理数字图像。结果 空白组大鼠各器官均未见异常。微米碳酸钙组大鼠肺泡壁充血水肿,小血管周围及支气管黏膜下层及肌层出现炎性细胞侵润。纳米碳酸钙组大鼠肺泡壁充血水肿,炎性细胞浸润,局部肺不张,部分小血管出现玻璃样变;支气管黏膜萎缩、剥脱,大量炎性细胞浸润。低、中剂量纳米碳酸钙组大鼠肾小球充血肿大,囊间隙缩窄。高剂量组可以观察到肾间质灶状淋巴细胞侵润,部分肾小球囊间隙消失。纳米碳酸钙染毒各组均可见汇管区周围有单核淋巴细胞侵润,汇管区周围肝细胞可见脂肪变性。损伤程度存在剂量依赖性。结论 亚慢性染毒纳米碳酸钙可导致大鼠肺、肝、肾组织病理学损伤。
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  T9.21 纳米氧化铝颗粒滴鼻染毒后在小鼠体内的器官蓄积

  李欢;丁勇;常丽俊;郭卫伟;张勤丽

  2013, 27(S1): 224-224.

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  目的 通过采用鼻腔滴注法对ICR小鼠进行染毒后,检测纳米氧化铝在小鼠体内主要器官的蓄积情况。方法 将健康3月龄雄性ICR小鼠80只分为8组:空白对照组、溶剂对照组、13 nm粒径氧化铝低剂量组、13 nm粒径氧化铝中剂量组、13 nm粒径氧化铝高剂量组、50 nm粒径氧化铝组、微米粒径氧化铝组、铝离子组。连续30 d,3~5次/天鼻腔滴注。用电感耦合等离子体发射光谱仪检测心脏、肝、脾、肺、肾中铝元素的含量。结果 ① 通过对同一粒径纳米氧化铝染毒组中不同器官铝含量的比较,13 nm Al₂O₃组(低、中、高剂量)中脾脏铝元素含量显著高于其他各器官,且差异有统计学意义(P<0.05);50 nm Al₂O₃、微米Al₂O₃组中肝脏铝元素含量均显著高于其他各器官,且差异有统计学意义(P<0.05);铝离子组中肺组织铝元素含量高于其他各器官,且差异有统计学意义(P<0.05)。② 通过对同一器官不同粒径纳米氧化铝蓄积程度的比较,心脏组织中微米Al₂O₃蓄积量最大,其次是13 nm Al₂O₃,且差异有统计学意义(P<0.05);肝组织中50 nm Al₂O₃蓄积量最大,且差异有统计学意义(P<0.05);脾组织、肾组织中13 nm Al₂O₃蓄积量最大,且差异有统计学意义(P<0.05);肺组织中铝离子蓄积量最大,其次是微米Al₂O₃,且差异有统计学意义(P<0.05)。③ 通过对不同剂量13 nm粒径氧化铝在同一器官中不同染毒剂量之间的比较,在肝、肾中,13 nm粒径氧化铝含量随其剂量的增加而增加,差别有统计学意义(P<0.05),其他器官均存在不同程度的剂量效应。结论 纳米氧化铝组较溶剂对照组在各个器官的铝元素含量均高,且差别有统计学意义。脾和肝为其主要蓄积器官,其中13 nm Al₂O₃主要蓄积在脾中,50 nm Al₂O₃主要在肝中蓄积。
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  T9.29 碲化镉量子点致小鼠肝、肾损伤的毒性机制

  孙湖泊;王萌萌;王晖;田蜜;赵淑锐;孙志伟;黄沛力

  2013, 27(S1): 228-228.

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  目的 分析碲化镉量子点(CdTe QD)在体内降解所释放的Cd²⁺及诱发ROS的种类和数量与其所致肝和肾损害之间的关系,进一步探讨CdTe QD的毒性机制。方法 将32只雄性ICR小鼠随机分为4组,每组8只,采用尾静脉注射方式染毒。染毒浓度分别为0(对照组)、50、500和5000 μmol·L^-1 CdTe QD溶液,每只小鼠注射0.1 ml,对照组注射等体积的生理盐水,染毒24 h后小鼠脱臼处死。测定小鼠血清生化和血液常规指标,并对肝和肾进行病理组织学检查。利用Elisa和免疫组织化学检测肝肾组织中的金属硫蛋白(MT)水平,利用电子自旋共振技术(ESR)分别测定各染毒组和对照组小鼠肝、肾中活性氧(ROS)的种类和强度。结果 各染毒组的小鼠血小板(PLT)、肌酐(CRE)均低于对照组。各染毒组小鼠的肝细胞可见不同程度的水样变、肝细胞肿胀、肝细胞点状坏死,伴淋巴细胞浸润;肾小管浊肿、肾小动脉扩张充血及间质部分区域小血管充血。与对照组相比,暴露组的小鼠有显著诱导表达的金属硫蛋白和ROS, 其中ROS主要为羟基自由基。结论 CdTe QD在小鼠体内分解产生Cd²⁺并诱导和促进羟基自由基的产生,从而对小鼠肝、肾产生毒性作用。
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  T9.33 基于量子点在小鼠体内的药代动力学和组织分布探讨其在生物体内的化学稳定性

  孙湖泊;王萌萌;刘娜;孙志伟;黄沛力

  2013, 27(S1): 230-230.

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  目的 探讨量子点(QD)体内化学稳定性的研究方法,并对其在生物体内的化学稳定性进行了初步研究。方法 雄性ICR小鼠,每只单次尾静脉注射50 nmol水相合成的CdTe aqQD(Cd和Te摩尔比为2:1,粒径约为4 nm,最大发射波长630 nm)或5 nmol水相合成的CdTe/ZnS aqQD(Cd和Te摩尔比=3:1,粒径约为6 nm,最大发射波长652 nm)。注射QD后的1, 15, 30 min, 1, 6, 12, 24和72 h时,摘除小鼠眼球收集血液,使用ICP-MS检测血浆中Cd和Te的含量,计算Cd和Te摩尔比;注射QD 15 min, 1, 6, 24, 72, 168 h, 2和4周时,剖取小鼠的主要脏器(心脏、肝、脾、肺、肾、脑),消化后使用ICP-MS检测其中的Cd和Te含量,计算Cd和Te摩尔比。结果 给予QD后小鼠体内Cd 和Te的血浆药代动力学参数(Vd, AUC, CL, t_1/2)和组织分布形式显著不同。给予CdTe aqQD 1和15 min 时,血浆中Cd 和Te的摩尔比分别为1.95:1和1.90:1,接近于CdTe aqQD中Cd和Te的摩尔比(2 :1),随着时间的延长Cd 和Te的摩尔比逐渐降低;Cd 主要蓄积在肝和肾,Te主要蓄积在脾。给予CdTe/ZnS aqQD后1h内血浆中Cd和Te的摩尔比与CdTe/ZnS aqQD中Cd和Te的摩尔比相比没有显著变化,接近于3:1,随着时间的延长Cd 和Te的摩尔比逐渐降低;Cd 主要蓄积在肝,肾和脾,Te主要蓄积在肾。结论 QD在体内可以降解,其体内和体外化学稳定性明显不同,通过体内实验中QD不同组成元素的药代动力学参数的变化或许可以了解QD在生物体内的化学稳定性信息。
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  T10.2 黄芪对脱氧雪腐镰刀菌烯醇致 BALB/c小鼠免疫抑制的解毒作用

  杨俊花;赵志辉

  2013, 27(S1): 234-234.

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  目的 研究黄芪对真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)免疫抑制的解毒作用。方法 48只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、黄芪对照组、DON组和黄芪+DON组。黄芪对照组和黄芪+DON组提前1周开始在饮水中添加黄芪颗粒(0.02 g·ml^-1);试验开始后,DON组和黄芪+DON组灌喂DON 2.4 mg·kg^-1,空白对照组和黄芪对照组每日灌胃等体积生理盐水,持续28 d。观察临床症状,记录体质量、采食量,试验结束后采集血液,解剖分离各组织,计算脏器系数,并进行病理组织、血细胞等观察,测定血清中细胞因子 IL-1β, IL-2, IFN-γ, TNF-α和TGF-β的含量变化,实时PCR检测脾中这些细胞因子基因表达的变化,流式细胞术分析脾CD4⁺, CD8⁺, CD3⁺和CD19⁺含量。结果 DON组小鼠死亡率为33%,黄芪+DON组小鼠死亡率17%,其他组小鼠未见死亡。同时 DON组和黄芪+DON组小鼠体重显著低于黄芪对照组和空白对照组(P<0.05)。此外, DON组小鼠采食量也显著降低(P<0.05)。剖检发现,DON 组小鼠肾肿大,肝表面有白色坏死灶,且脾、肝以及肾系数均显著高于其他各组(P<0.05),而黄芪+DON 组只有肝系数提高(P<0.05)。病理组织学观察,DON组肝细胞间隙充满大量红细胞;肝细胞肿胀,肾小管管腔增大、细胞结构破坏,肾小球萎缩,黄芪+DON组组织病变减轻,其他各组未见病变发生。血细胞检验结果显示,黄芪+DON组、DON 组单核细胞总数(MO)显著高于空白对照组和黄芪对照组(P<0.05),淋巴细胞百分比(LY%)则显著低于对照组(P<0.05),血小板总数(PLT)、血小板压积(PCT)显著升高。此外,DON 组血液CD4⁺, CD8⁺, CD4⁺/CD8⁺和CD19⁺等指标及细胞因子均显著低于其他各组(P<0.05),但黄芪+DON 组高于DON组(P<0.05),同时脾中IL-2, IFN-γ, TGF-β基因 mRNA 的表达量也显著高于DON 组(P<0.05)。结论 2.4 mg·kg^-1 DON能显著抑制小鼠的免疫作用对机体造成损失,而黄芪可以明显拮抗DON对小鼠的免疫抑制作用,减轻DON致肝、肾损伤,提升机体免疫水平,减少小鼠死亡。
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  T11.4 三聚氰胺-三聚氰酸联合经口染毒对小鼠肾氧化应激及缺氧的初步研究

  陈耿;吕英军

  2013, 27(S1): 236-236.

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  目的 探讨三聚氰胺和三聚氰酸对肾的联合毒性。方法 将三聚氰胺-三聚氰酸的混合物(W/W=1:1)分别以1, 5和25 mg·kg^-1·d^-1经口灌胃染毒小鼠作为试验组,对照组小鼠经口灌胃玉米油,染毒13周后检测肾的组织病理学改变、氧化应激、能量代谢酶、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)等指标。结果 中、高剂量试验组小鼠肾的远曲小管出现金棕色结晶、蛋白管型并且管腔代偿性扩张等病变,表明三聚氰胺-三聚氰酸混合物对小鼠肾的毒性。并且在暴露于该混合物后,小鼠肾中总抗氧化物、超氧化物歧化酶的活性以及谷胱甘肽的浓度均出现降低,而脂质过氧化物和蛋白质羰基的浓度增加,表明该混合物能导致小鼠肾内抗氧化物和活性氧的失衡,并且过量的活性氧能导致肾中脂质和蛋白质的氧化损伤。苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性降低,同时乳酸脱氢酶的活性和HIF-1α的浓度增加,提示三聚氰胺-三聚氰酸混合物能导致肾能量代谢酶活性失衡并使其处于缺氧状态,而氧化应激和缺氧均可能引起肾的损伤。结论 三聚氰胺-三聚氰酸混合物可能通过形成结晶引起肾小管堵塞继发性地导致实质性肾损伤所致。
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  T12.2 燃煤氟污染与砷对暴露人群肝功能及氧化损伤交互作用

  杨鋆;洪峰;张爱华

  2013, 27(S1): 237-238.

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  目的 探讨燃煤氟污染与砷对暴露人群肝功能及氧化损伤的交互作用,分析剂量-效应关系;筛选氟砷污染致暴露人群肝损伤及氧化损伤的生物学标志。方法 以燃煤污染型氟中毒病区贵州省清镇市流长乡216名村民为调查对象,进行环境及临床流行病学调查,采用Dean法分度对调查对象进行氟斑牙分级评价;采集环境样本、调查对象尿样和血样,分别检测环境样本氟、砷含量,尿氟(UF)、尿砷(UA)、尿肌酐(Cr)含量。根据氟斑牙分度、尿氟含量及临床特征分内对照组(33例)与病例组(183例);根据UF和UA含量,分别从三个水平进行析因设计分析其交互作用。即UF分为Cr 0~, 1.2~和2.4~ mg·g^-1组,UA分为Cr 0~, 20~和40~ μg·g^-1组,其中无同时满足UF 2.4~ mg·g^-1 Cr与UA 40~ μg·g^-1 Cr的研究对象。检测肝功能指标: 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、总胆汁酸(TBA)、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C);氧化损伤指标:超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总巯基(T-SH)。另外根据骨强度指数结果筛选46名调查对象进行右侧腕关节及踝关节X线检查。结果 (1)环境介质及粮食中氟、砷含量均有不同程度超标;该地区氟污染的主要氟源为燃煤和粘土,砷污染主要砷源为菜土。(2)检出可疑、极轻度、轻度、中度和重度氟斑牙患者177人(82.4%),39人(17.6%)未发现氟斑牙;X线检出骨质疏松9人(19.6%)、骨质软化4人(8.7%)、骨质硬化33人(71.7%),骨质硬化、骨质软化组尿砷低于骨质疏松组。(3)氟、砷暴露与肝功能损害关系分析:不同尿氟水平AST值有差异(P<0.05),其余各指标均没有差异(P >0.05);低砷环境下,砷对肝的影响不明显(P >0.05);高氟、低砷环境下氟、砷对肝的影响作用不明显(P >0.05),但随着尿氟、尿砷水平的增加各指标水平呈升高趋势(χ²=13.939,P=0.000),表明高氟、低砷环境下,氟、砷与肝功能指标存在一定剂量效应关系。氟存在的情况下,尿砷与AST, ALT和γ-GT间呈正相关关系(P<0.01)。氟单独作用对ALT和AST水平的影响比较明显(P<0.05);氟、砷同时作用对ALT水平影响比较明显(P<0.05)。(4)氟、砷暴露与氧化损伤关系分析:GSH-Px水平随着尿氟含量的增加,呈现出先降低,后升高的情况(P<0.05);在单独氟、砷及氟、砷水平均较高时T-SH水平均随氟、砷剂量增加而降低(P<0.05);在砷存在的情况下,尿氟与T-SH间呈负相关关系(P<0.05)。结论 (1)调查点氟污染情况依然存在,同时存在低砷污染情况;氟暴露氟源为粘土及燃煤,砷暴露砷源为菜土。(2)本研究地区氟砷暴露对人群肝功能ALT水平存在交互协同作用,对其他肝功能及氧化损伤指标主要为氟、砷的单独作用。(3)ALT和T-SH可作为氟砷暴露情况下肝功能及氧化损伤的生物学标志。
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  T12.4 毒死蜱和氯化镉联合染毒对大鼠的肝毒性

  许明圆;孙英健;许海洋;陈丽萍;董晶晶;朱丽;伍一军

  2013, 27(S1): 239-239.

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  目的 了解有机磷农药毒死蜱与重金属镉的联合肝毒性作用及作用机制。方法 以成年SD大鼠为实验动物,以毒死蜱和氯化镉2种化学物,分别以低中高3种剂量单独和联合染毒90 d(采用4×4全析因设计方案)后,通过分光光度法等生化方法检测大鼠肝组织的SOD, CAT, MDA和PCO等酶活性的变化,结合显微镜检查组织病理学改变、色谱法检测复合物是否形成和代谢物残留量多少以及基于GC-MS的肝组织代谢组学分析等方法研究毒死蜱和氯化镉这2种化学物联合染毒对大鼠肝组织的毒性作用。结果 毒死蜱和氯化镉单独和联合染毒后都能引起大鼠肝组织的氧化损伤,在对SOD和CAT活性以及脂质过氧化测定指标上表现出拮抗作用,但毒死蜱比镉的毒性作用更强。肝组织病理学检查结果显示两种化学物呈现出拮抗作用趋势。毒死蜱染毒后大鼠肝代谢谱变化要比镉染毒大鼠的变化大。未发现毒死蜱和镉在肝组织中形成复合物,但发现镉在某种程度上促进毒死蜱的代谢。结论 毒死蜱和氯化镉亚慢性联合染毒对大鼠肝毒性表现出拮抗作用趋势,这种拮抗作用可能是由于镉促进了毒死蜱在肝组织中的代谢而非这两种化学物在肝中形成复合物所致。
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  T12.6 铅中毒抑制Ⅳ型超敏反应的机制

  赵芳;方亮;曹子鹏;康蓓佩;金伯泉;陈景元;骆文静

  2013, 27(S1): 240-240.

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  目的 研究铅暴露对大鼠T细胞发育的影响以及抑制大鼠体内IV型超敏反应的机制。方法 将健康雄性,21 d断乳的SD大鼠随机分为对照组和染铅组,采用饮水染铅建立铅中毒的动物模型,原子吸收光谱法测定血铅含量,流式细胞术检测大鼠胸腺、脾和外周淋巴结T细胞亚群和调节性T细胞数目。利用DNFB涂抹大鼠耳部,建立迟发型超敏反应模型,利用免疫组化和Treg过继回输实验,检测Treg对铅中毒引起的迟发型超敏反应降低的影响。结果 SD大鼠自由饮用含300 ppm醋酸铅的水6周后,血铅水平与对照组相比升高了4.2倍。铅暴露还使大鼠胸腺CD4⁺CD8^-细胞和外周CD4⁺T细胞显著减少,但CD8⁺T细胞变化不明显。与一般CD4⁺T细胞不同,FoxP3⁺的Treg在铅暴露大鼠胸腺和外周淋巴器官中数目反而增加。与此相一致的是,铅暴露会明显抑制大鼠体内Ⅳ型超敏反应的发生。在T细胞传输试验中,如果清除掉其中的Treg,铅中毒导致的Ⅳ型超敏反应抑制现象将消失,这说明Treg在铅中毒抑制Ⅳ型超敏反应中发挥了重要作用。结论 铅暴露可以通过上调Treg引起免疫功能抑制。
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  T12.8 三氯乙烯的雄性SD大鼠肾组织损伤作用

  吴德生;杨淋清;刘建军;徐新云;黄海燕;杨细飞;周丽;黄新凤;洪文旭;袁建辉;庄志雄

  2013, 27(S1): 241-241.

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  目的 探讨三氯乙烯对雄性SD大鼠肾的损害及其毒性作用机制。方法 健康成年雄性SD大鼠随机分组,以腹腔注射暴露于混入玉米油的0, 3, 6和10 mmol·L^-1三氯乙烯,1周后处死动物,取肾,常规包埋、切片、脱水、HE染色,光镜下检测肾组织病理改变。切取部分肾组织提取mRNA,用于荧光定量PCR分析氧化还原和细胞凋亡相关基因的表达情况。肾组织蛋白采用Western blot进行检测,检测与三氯乙烯暴露相关的蛋白表达差异。结果 病理组织检查发现,大鼠肾组织在10 mmol·L^-1剂量组,可见充血较其他剂量组明显,其他剂量组各组织镜检未见明显异常。mRNA进行荧光定量PCR分析,发现细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)、凋亡基因胱天蛋白酶3的表达量有增加趋势,但没有显著性差异。肾提取蛋白进行Western blot分析,CYP2E1、MGMT、OGG1和胱天蛋白酶3蛋白的表达未见统计学差异。结论 雄性大鼠短期内(7 d)经腹腔注射暴露于三氯乙烯后,仅对肾造成炎性刺激,未见明显病理改变,未能引起大鼠肾组织中氧化还原相关基因CYP2E1, MGMT和OGG1,以及凋亡基因胱天蛋白酶3的mRNA和蛋白的表达水平变化。
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  T3.31 豚鼠呼吸道吸入过敏模型的建立

  李华;胡天羽;周国民;马璟

  2013, 27(S1): 83-84.

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  目的 建立豚鼠呼吸道吸入过敏模型。方法 Hartley豚鼠腹腔注射生理盐水或3 g·L^-1卵白蛋白(OVA)生理盐水溶液致敏,给药体积为3 ml·kg^-1,隔日注射1次,给药时间为D1, D3和D5天,共给药3次,3只/性别/组。末次致敏后14 d(D19),单次雾化给药激发:将动物置入动物试管,雾化吸入生理盐水或5 g·L^-1 OVA生理盐水溶液进行攻击,喷雾时间20 min,流速为2.5 L·min^-1。致敏期间每日观察2次,激发后即刻起至少观察30 min,并于试验D5(致敏给药结束)、D12、D19(激发阶段)分别对各组动物眼球取血分离血清,检测各组血清IgG水平。结果 致敏期间所有动物均未见异常。豚鼠吸入给予生理盐水激发后,未见异常征状,而吸入给予OVA后,全部动物均出现竖毛和颤抖现象,3只动物出现步态不稳或痉挛,并有1只动物在5 min后呼吸衰竭死亡。D5时各组血清中IgG均低于检测限,D12和D19时,OVA组血清中IgG均较生理盐水组显著明显升高(P<0.05)。结论 通过吸入给药可建立豚鼠呼吸道过敏模型。
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  T3.34 浅谈测试机构如何开展供应商资格审查

  张华春;罗红晔;李梦茹;于保青;白喜耕

  2013, 27(S1): 85-85.

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  测试机构在开展GLP试验中常常使用各种供应商提供的产品。供应商也一直都在设法满足用户的要求。然而由于监管部门的检查并不针对供应商,且大多数供应商(尤其是试验体系供应商)不会参与任何审查程序,因此,建立供应商资格审查程序对于确保试验中所使用的产品满足GLP要求是必不可少的。笔者根据中心近年开展供应商资格审查的工作经验,结合查阅相关文献,对如何有效地开展供应商资格审查作简要论述,希望能够起到抛砖引玉的作用。1. 选择供应商: ① 明确试验所需产品的具体要求。② 通过尽可能多的信息收集,确定最有可能满足需求的个人、机构或企业。可参照以下资源确定潜在的供应商:与供应商合作的以往经验;预先批准/优先选择的清单;销售电话;网站搜索;其他用户的推荐。需要注意的是,对多个供应商进行评估会提高物美价廉产品的可能性。2. 审查流程: 通常由测试机构的QAU实施审查,必要时项目负责人或相关人员应共同参与。可通过下述任一或联合方式进行供应商资格审查:审核供应商网站公布的市售材料和信息;审核供应商的各种资质,包括其质量体系;审核关键人员或顾问的简历;要求供应商反馈质量调查问卷;实施现场审查。当测试机构认为供应商提供的产品存在风险时,有必要实施现场审查。审查人员应根据供应商的性质制定具体的审查计划。审查计划应包括执行标准(GLP、ISO9001-2000、测试机构内部程序、客户要求等)、日程安排、审查内容等信息。现场审查时,审查人员要告知供应商审查计划,并按照审查计划进行客观、公正地审查,详细记录审查活动及发现的问题。下面列出的是现场审查的要点,这些要点覆盖了生产流程、培训和记录,形成了现场审查的核心部分。组织机构;员工培训;SOPs/PROs;设施;设备;质量保证/质量控制;记录、报告;归档。现场审查结束后,审查人员要向供应商出具一份审查报告,报告中应描述在其机构内的检查发现及改进的建议。供应商应对检查发现进行积极反馈,采取有效的纠正和预防措施。测试机构应跟踪反馈,任何没有闭环行为都应在其后的审查中重新评价。
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  T3.37 BRAF抑制剂SCR-A的探索性大鼠毒性评价

  朱琳;胡扬;连国宁

  2013, 27(S1): 87-87.

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  目的 研究BRAF抑制剂SCR-A的大鼠毒性反应,并与阳性药PLX-4032初步通过暴露量来比较毒性强弱。方法 选用SD大鼠60只,随机分成5组,包括空白对照组(灌胃给予蒸馏水)、溶剂对照组(5%DMA和20%Solutol)、SCR-A的10和50 mg·kg^-1组和阳性药PLX-4032的50 mg·kg^-1组,每组12只,包含TK卫星组6只,雌雄各半。连续给药22 d,于d 23主实验组进行麻醉后(7%的水合氯醛),腹主动脉采血用于血液学和血生化指标的检测,并解剖取相关脏器进行称重和病理学考察;TK卫星组在d 1和d 22采用眼眶取血进行血药浓度测定,并在Day18增加给药前0 h血液采集。结果 实验期间各组都未出现死亡,除在d 20发现PLX-4032组和SCR-A组少数动物出现流涎,其他动物给药期间临床症状均未见异常。与空白对照组相比,各组在体重、摄食量、血液学指标方面无明显差异。PLX-4032雄性组的ALP有少量降低,CHOL与溶剂组相比各组都有一定的升高。雌雄动物各组都出现肝肾体积增大,PLX-4032组胸腺缩小。组织病理学检查可见SCR-A的高剂量组和PLX-4032组对动物肝有很轻微影响,但未引起实质性改变,且对动物胸腺有一定影响,可引起淋巴细胞轻微减少。TK结果表明,SCR-A的暴露量随剂量升高而增加。SCR-A给药22 d后在大鼠体内没有蓄积,在等剂量50 mg·kg^-1下,SCR-A和阳性药PLX-4032的暴露量相近,接近阳性药NDA申报资料中高剂量达到的血药浓度。结论 SCR-A与阳性药在相同剂量下的毒性反应一致,暴露量也相近,可作为候选药物继续深入研究。
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  T3.40 三聚氰胺多终点的遗传毒性

  涂宏刚;张铭;周长慧;王征;黄鹏程;常艳

  2013, 27(S1): 88-88.

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  目的 评价三聚氰胺的遗传毒性。方法 1)Ames试验:采用标准平皿掺入法,以生物学特性鉴定合格的TA97a, TA98, TA100, TA102和TA1535为试验菌株,在有或无S9代谢活化系统的条件下进行。三聚氰胺的浓度设计为62.5 μg/皿至1000.0 μg/皿,同时设置阴性对照组(DMSO)和阳性对照组,均平行培养3皿。培养48~72 h后,观察沉淀析出及背景菌斑生长情况,并计数每皿回复突变菌落数。2)体外双核微核试验:采用细胞胞质分裂阻滞法,所用细胞为CHO-K1细胞,在有或无S9代谢活化系统的条件下进行。根据三聚氰胺的溶解度,本试验浓度设计为75.0, 150.0和300.0 mg·L^-1,同时设阴性对照组(无菌去离子水)和阳性对照组,每个处理2个重复。在有S9或无S9条件下,处理CHO-K1细胞3 h后,加于含有细胞松弛素B(Cyto B)的培养基继续培养约21 h;在无S9条件下,供试品/对照品在含有Cyto B的条件下处理细胞约24小时。细胞经低渗、固定、染色后,显微镜下观察计数。3)Pig-a基因突变试验和体内微核试验:将25只雄性SD大鼠按体重随机分成5组,每组5只,连续3天经口灌胃给予阴性对照(芝麻油),500.0, 1000.0及2000.0 mg·kg^-1的三聚氰胺和20.0 mg·kg^-1的阳性对照(N-乙基-N-亚硝基脲,ENU),于给药前1天、首次给药后第15天、第29天和第60天颈静脉取血,检测Pig-a基因突变率;同时在末次给药后约24 h颈静脉取血,以流式细胞术检测外周血的微核率。结果 1)在有或无S9代谢活化系统(+S9或-S9)的条件下,5种试验菌株的阴性对照组回复突变菌落数均在各自历史对照范围内,阳性对照组回变菌落数均在各自平行阴性对照组的2倍以上。三聚氰胺各浓度组的回复突变菌落数较各自的阴性对照组均未发现显著增加。2)在有或无代谢活化系统(+S9或-S9)的条件下,所有试验浓度在培养基中均无沉淀析出。与阴性(溶剂)对照相比,三聚氰胺各浓度组均未引起CHO-K1细胞的微核率显著增加,且无剂量效应关系。3)与阴性对照组相比,三聚氰胺所有剂量组大鼠RETs Pig-a基因突变率和%MN-RET均无显著性差异,而ENU组大鼠RETs Pig-a基因突变率和%MN-RET均显著高于阴性对照组。结论 在本实验条件下,三聚氰胺无遗传毒性。
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  T3.43 关于新版The Guide of Animal Care and Use中实验用犬的“social housing”问题的探讨

  郭秋平;杨威;肖百全;周泉;雷夏凌;梁惠婵

  2013, 27(S1): 90-90.

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  犬作为常用实验动物,适用于生物医药各个学科的研究,广泛应用于人类疾病模型、药代学、药效学、毒理学、肿瘤学、免疫学等诸多领域。改善动物的生活环境,提高动物的福利,保持动物身体和心理的健康,对开展高质量的试验研究,获得真实可靠的实验数据具有重要意义。本文结合中心实际情况,对促进犬的社会化的方法作一简述,为从事犬实验的有关人员及犬的社会化研究提供参考。
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  T3.46 地塞米松和复方阿魏酸钠苦参素小鼠腹腔注射3周长期毒性

  孙松梅;徐萌欣;王伟;裴晓坤;孙善月;孙舒亚;刘志峰

  2013, 27(S1): 91-92.

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  目的 比较地塞米松和复方阿魏酸钠苦参素的毒性反应。方法 昆明小鼠随机分为空白对照组、地塞米高、中、低剂量组和复方阿魏酸钠苦参素高、中、低剂量组。2种药物的剂量分别为100, 50和25 mg·kg^-1。每日腹腔注射相应药物,连续给药3周。结果 (1)地塞米松高剂量组小鼠给药期间可见皮毛蓬松,活动量少,地塞米松各剂量组体重及体重增长率比对照组明显降低,复方阿魏酸钠苦参素各剂量组未见明显改变。(2)给药3个周,复方阿魏酸钠苦参素各组血液学和血液生化学指标与对照组比较未见明显差异;地塞米松各剂量组与对照组比较血液学指标未见明显改变,血液生化指标有明显的改变,主要表现在ALP(碱性磷酸酶)明显降低 (高、中、低剂量组分别为81±12,164±66,(80±41)U·L^-1,对照组(169±28)U·L^-1,P<0.05),TP(血清总蛋白)明显升高(高、中、低剂量组分别为84±17,81±16,(79±16)g·L^-1,对照组(66±4)g·L^-1,P<0.05),CK(肌酶激酶)明显升高(高、中剂量组分别为323±54,(315±50)U·L^-1,对照组(166±42)U·L^-1,P<0.05),CH(血清总胆固醇)明显升高(高、中、低剂量组分别为7.03±1.02, 6.40±1.00, (7.77±2.32)mmol·L^-1,对照组(3.26±1.91)mmol·L^-1,P<0.01)。(3)阿魏酸钠和苦参素联合给药组各器官脏器系数与对照组比较未见显著差异。地塞米松各剂量组与对照组比较,肝指数明显增大,脾指数明显减小。结论 腹腔注射地塞米松显示一定的毒性作用,主要表现肝指数增大、脾减小、高胆固醇血症等血液生化指标紊乱。阿魏酸钠和苦参素联合给药在100 mg·kg^-1及以下剂量对小鼠连续腹腔注射给药3个周,未见有明显的毒性作用。
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  T3.49 亚硫酸氢钠穿心莲内酯对人肾小管上皮细胞的毒性作用

  王全军;胡中慧;吴纯启;廖明阳

  2013, 27(S1): 93-93.

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  目的 探讨亚硫酸氢钠穿心莲内酯(ASB)对人肾小管上皮细胞(HK-2)的细胞毒性作用。方法 通过倒置显微镜观察ASB诱发HK-2细胞的形态改变,应用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术法检测其对HK-2细胞生长、细胞周期、细胞凋亡、线粒体膜电位(MMP)和活性氧(ROS)产生的影响,并用Western印迹法检测其对凋亡相关蛋白细胞色素C(CytC)、胱天蛋白酶3、Bcl-2、Bax的影响,探讨ASB对HK-2细胞体外毒性作用的特征和机制。结果 ASB呈剂量依赖性抑制HK-2细胞增殖,作用24和48 h后IC₅₀值分别为(19.12±3.55)和(11.56±3.88)g·L^-1。乳酸脱氢酶(LDH)漏出率显著增加,MMP下降,阻滞HK-2细胞周期于G₂/M期,细胞内的ROS 和上清液中的丙二醛(MDA)水平明显增加,谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和总ATP 酶活性降低;同时ASB使HK-2 细胞内CytC、胱天蛋白酶3、Bcl-2和Bax 蛋白水平均升高,并且呈现明显的剂量和时间效应关系。结论 ASB对HK-2细胞的毒性作用通过干扰HK-2细胞线粒体能量代谢,改变细胞内氧化还原状态,耗竭细胞内GSH, SOD,导致细胞内ROS大量堆积,引发脂质过氧化作用,破坏细胞膜的通透性,导致CytC等凋亡因子从线粒体释放,进而引发细胞凋亡或坏死。
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  T3.51 非临床幼龄动物毒理学试验的原理与案例

  吴纯启

  2013, 27(S1): 94-94.

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  婴幼儿和儿童正处于生长发育的特殊时期,器官的生理功能尚未发育成熟,药物代谢酶分泌不足或缺失,对药物的耐受性差,敏感性较高,极易产生药物不良反应,甚至导致死亡。由此可见,儿童并非仅仅是小型成年人,两者在机体成分、心肺功能、神经功能、肾功能、肝功能、胃肠道功能以及免疫功能,药物处置系统,药物毒作用易感性等多个方面存在较大的差异。幼龄动物的临床前研究旨在确定药物动物体内吸收、分布、代谢和排泄和毒代动力学的特征,还需鉴别潜在的毒性靶器官。此外,需要了解已鉴别靶标的可逆性以及人类相关暴露量的安全范围。幼龄动物试验旨在评估受试物对幼龄动物出生后生长和发育的影响,一些幼龄动物(如啮齿类动物,家兔,犬等)的发育特征大体与儿童相似,是评估药物对儿童人群影响的理想模型。大鼠和犬是传统上选用的啮齿类和非啮齿类动物。了确定幼龄动物毒性试验的相关性,研究过程中必须考虑诸多因素,包括(但不限于)每种动物的特定器官系统相对于人而言的发育时间。另外,代谢酶和转运体蛋白的系统发生及其相应的人类发育阶段,在设计和解释幼龄动物毒性研究结果时尤为重要。目前,美国FDA和欧洲药品评价局(EMEA)均已发布有关儿科药物非临床安全评价的指导原则,其中明确提出有些药物对儿童特殊发育时期的影响难以在临床试验中发现,因此有必要开展幼龄动物的非临床安全评价。运脾止泻颗粒复方为北京首医科技有限公司开发的新型药物,用于治疗小儿腹泻。我们的实验结果表明,幼龄大鼠灌胃运脾止泻颗粒复方,其毒性表现为高剂量下动物在哺乳期及断乳后前2周出现体重增长变缓,拉黄色稀便、局限性脱毛等临床体征,母鼠及仔鼠哺乳期摄食量下降以及仔鼠睁眼发育延缓等。运脾止泻颗粒复方染毒对幼龄大鼠的自发活动、其它的生长及反射指标、动物的交配能力以及骨密度及临床病理学分析等则均未见明显的影响。通过运脾止泻颗粒复方的幼龄大鼠毒理学实验,本中心已基本具备开展幼龄大鼠毒理学实验的经验、设备和条件。
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  T3.56 AMD领域药物药效及临床前安全性评价

  扈正桃;许可;刘斌;岑小波

  2013, 27(S1): 97-97.

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  老年黄斑变性是全世界范围内失明的主要原因之一,尤其是在发达国家中,据估计,6.5%的40岁以上的美国人都患AMD。随着LED大量应用于手机、电脑、照明器材等电器,造成视网膜光敏细胞死亡,导致黄斑变性,使得黄斑变性的发病率有上升趋势。目前,全世界许多公司都致力于AMD相关领域治疗新药的开发。我们通过长期的探索和研究,成功建立了非人灵长类CNV模型,并且建立了该类药物临床前安全性评价的全套技术标准。非人灵长类AMD模型的建立:选用恒河猴,动物麻醉并散瞳后,采用激光光凝黄斑区,见到有气泡产生提示Bruch膜被击破。经荧光素眼底血管造影(FFA)检查证明,在造影早期光斑呈高荧光,晚期显著荧光素渗漏,渗漏超过光斑边缘,造模后48天,仍能观察到荧光素渗漏。光学相干断层扫描(OCT)检测表明,非人灵长类实验性CNV的OCT扫描呈现局部视网膜下高反光团,并伴有局部视网膜水肿,黄斑形态的消失,类似临床CNV改变。HE染色结果表明局部视网膜水肿,结构紊乱并形成具有内皮细胞相关的增生纤维新生血管。以上结果均表明激光诱导的恒河猴CNV具有临床CNV的改变特征。该类药物的临床前安全性评价:(1)一般选用猴作为实验动物,首先对动物进行眼科检查,有眼疾的动物不能纳入试验;(2)给药途径大都为玻璃体内注射,应特别注意注射操作可能引起的机械刺激及眼部感染;(3)重点关注眼科相关指标检查:常规眼科检查、眼压、FFA、OCT、眼电生理检查及眼球、视神经组织病理检查。(4)其他检查:包括眼刺激性、体重、体温、摄食、心电、血压、血液学、血生化、各脏器组织病理学检查等常规毒理学检查指标,对全身系统毒性进行综合评价。此外,生物制剂或抗体药物还应进行免疫原性/免疫毒性检测。(4)于不同时间点采血进行毒代动力学研究,考察药物全身暴露情况。同时,还应该进行包括角膜、房水、虹膜、晶体、玻璃体、视网膜、脉络膜在内的眼球组织分布试验,考察药物在上述各眼球组织中的分布代谢情况。综上所述,通过建立非人灵长类动物AMD模型,以及该类药物的临床前安全性评价技术体系,我们成功进行了包括生物制剂及化药在内的多个新药的药效及安全性评价。
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  T3.59 伊文力莫Beagle犬38周经口重复给药毒性

  张海艇;谢克勤;齐霞

  2013, 27(S1): 99-100.

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  目的 旨在观察重复给予伊文力莫对Beagle犬所产生的毒性反应。方法 取健康Beagle犬36只,♀♂各半。按体重随机分为空白对照组(Veh、灭菌蒸馏水)、溶媒对照组、低、、中和高剂量5组,采用经口给药,每日给药1次,每周给药6 d,连续给药38周,停药观察4周;每日进行一般状态观察,每周测定1次体重,并于药前、给药26和38周及停药观察期结束,分别对眼科、体温、尿常规、心电图检测、血液学及血清生化学进行检查;给药38周时各组随机抽取4只动物进行系统尸解及病理组织学检查。停药观察结束,取各组剩余2只动物进行系统尸解及病理组织学检查。结果 (1)伊文力莫 Veh, CMC-Na, L和M组动物活动、饮食、饮水正常,行为活泼,未见明显异常。H组动物给药后普遍出现自主活动降低, 2/4只雄性犬出现牙龈增生,最早于给药12周出现(M018),另一只动物于给药28(M015)周出现,恢复期观察结束,牙龈可恢复正常;1/4只雄性犬(M015)在给药27周出现右前肢体肿大,表面灰黄灰白色,质地略韧。(2)体重:伊文力莫 给药期间,雌性犬L组体重增长幅度与Veh和CMC-Na组相似;M和H组犬给药22周内体重增长趋势与Veh组一致,自给药23周起体重增长幅度略低于Veh组。雄性犬L组体重增长幅度与Veh和CMC-Na组相似;M和H组犬给药21周体重增长趋势与Veh组一致;M组自给药22周起体重增长幅度略低于Veh组,H组犬自给药22周起体重增长幅度明显低于Veh组。恢复期,伊文力莫各组犬的体重略有增长。(3)眼科检查:各试验组动物药前、给药13, 26和38周和恢复期观察结束眼科检查均未见明显异常。(4)体温检查:CMC-Na, L, M和H组药前、试验各阶段体温测定与Veh组比较无统计学差异(P>0.05)。(5)尿常规检查:伊文力莫 CMC-Na, L, M和H组药前、用药期和恢复期观察结束测定的尿液比重、pH、白细胞、红细胞、硝酸盐、酮体、胆红素、尿胆元、蛋白质、葡萄糖十项指标与Veh组比较无明显差别。(6)心电图检查:伊文力莫CMC-Na, L, M和H组药前、给药13, 26和38周和恢复期观察结束测定的标准Ⅱ导联心电图HR、P波、R波、T波、PR间期、QT间期与Veh组相比无明显变化(P>0.05)。(7)血液学检查:伊文力莫给药13周,各项指标未见显著性差异(P>0.05)。给药26周M和H组WBC降低,与Veh组比较有统计学差异(P <0.05); 给药38周H组WBC降低,与Veh组比较有显著性差异(P<0.05)。(8)血清生化学检查:伊文力莫给药13, 26和38周和恢复期结束血清生化学各项指标未见显著性差异(P>0.05)。(9)病理学检查:① 大体尸检,给药13周,肉眼检查除发现H 组一只雄性犬牙龈轻度增生外,其余未见明显异常。给药38周,肉眼检查可见H组1只雄性犬牙龈增生,色泽红润,质地略韧,有臭气味;H组一只雄性犬(M017)有右前肢体肿大。尸体剖检发现,M组1/4只犬(M012)肠内充气,体温略高,肠系膜淋巴结略肿大,颜色暗灰色;M组3/4只犬(M014, F012和F013)胸腺体积小。H组:4/4只犬(F017, F018, M017和M017)脾和胸腺体积小。② 脏器湿重,伊文力莫 给药13周各脏器湿重均在正常范围内,未见明显增大或减小。给药38周H组(M017)脾减小与Veh组比较有差异(P<0.05),其它各脏器湿重均在正常范围内,未见明显增大或减小。③ 脏器系数,给药13周各脏器系数均在正常范围内,未见明显增大或减小。给药38周H组M016和 M017脾器系数减小与Veh组比较有差异(P<0.05)。恢复期脏器系数均在正常范围内,未见明显增大或减小。④ 光学显微镜检显示:给药13周和恢复期各组脏器在显微镜观察下均未见明显变化;给药38周H组1只动物肾有浆细胞浸润。H组2/2只,L和M各有1只雄性犬,出现附睾血管周围炎。H组有2只动物脾动脉周围淋巴鞘细胞密度降低,体积减少,其中1只可见巨核细胞增生。H组4/4肠系膜淋巴结和颌下淋巴结均不同程度的病变,分别或同时出现淋巴窦扩张,伴有或不伴有充血、出血,副皮质区细胞疏松,体积减小,髓质浆细胞减少,淋巴滤泡细胞疏松。H组M017肿大的前肢显微镜下鳞状上皮增生,有慢性炎细胞浸润。H组牙龈增生动物龈上皮增生变厚,上皮钉突纤细并延长,表面角化不全,上皮下纤维组织广泛增生,含有较多胶原纤维,细胞成分较少,血管较少,纤维细胞分化成熟,无明显界限,无炎症细胞浸润。M组1只犬肺脏出现炎症细胞结节。M组有1只动物出现脑室旁有脑室旁炎症,神经组织坏死。M组1/4、H组3/4胸腺小叶萎缩,皮、髓质比例增加,髓质轻微减少,可见满天星现象;M组1只动物胸腺充血、出血明显,髓质出血较重。结论 本试验条件下伊文力莫安全用药剂量为0.3 mg·kg^-1·d^-1,是临床日用药最高剂量的6倍;中毒剂量为30 mg·kg^-1·d^-1,是临床日用药最高剂量的600倍,毒性靶器官为牙龈和脾、胸腺和淋巴结,这些组织器官的损伤是可逆性的,经过4周的恢复期病变基本恢复正常。提示毒性反应有一定的性别差异。
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  T3.63 单缬螺复方降压药物对Beagle犬的长期毒性

  李欣;姚景春;杨鉴;赵涛;高雷;牟丽丽

  2013, 27(S1): 101-101.

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  目的 观察Beagle犬连续6个月口服单缬螺复方降压药物所产生的毒性反应,比较单硝酸异山梨酯、缬沙坦、螺内酯三种成分联合应用后,是否有毒性增加或产生新的毒性。方法 健康Beagle犬40只,♀♂各半,设空白对照组、单缬螺复方15, 50和150 mg·kg^-1及缬沙坦对照组120 mg·kg^-1,每组8只动物。每日灌胃给药1次,每周给药6 d,给药体积为5 ml·kg^-1,连续给药26周,停药观察4周。实验期间,每日进行一般状态观察,每周测定1次体重及摄食量,并于给药前、给药第13周、26周及停药恢复期第4周,分别对眼科、体温、尿常规、心电图、血液学及血液生化学进行检查,在给药期结束前及恢复期结束前测量动物血压,末次给药后及恢复期结束后分两批(每组1/2存活动物)对动物剖检并进行病理组织学检查,并采用放免法进行睾酮及雌二醇水平检测。结果 ① 各组动物行为活动、饮食、饮水正常。② 动物体重、摄食量无组间差异。③ 试验进行过程中进行的眼科、体温、尿常规、心电图、血液学及血液生化学等指标的检查,未见组间差异。④ 各给药组动物血压同空白对照组比较明显降低,且单缬螺复方组150 mg·kg^-1比缬沙坦组120 mg·kg^-1降压效果更为明显,停药后均恢复正常。⑤ 在给药期及恢复期结束时,对雌二醇的影响不明显,但单缬螺复方15, 50和150 mg·kg^-1睾酮水平均表现为降低的趋势,但同空白对照组比较未见统计学差异。⑥ 各组动物组织病理学检查,未见明显药物毒性引起的病理器官改变。结论 本试验条件下,单缬螺复方降压药物未出现药物的蓄积现象,同各成分单独使用相比,未见毒性增加或产生新的毒性。
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  T3.65 雷公藤甲素Beagle犬的急性毒性

  兰天龙;梁金强;付新录;扆雪涛;张志妮;黄芝瑛

  2013, 27(S1): 102-102.

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  目的 观察Beagle犬单次灌胃给予雷公藤甲素后的急性毒性反应,确定最小致死剂量范围,并初步判断其毒性靶器官,为后续试验的剂量设计和检测指标提供参考。方法 采用最小致死剂量法。Beagle犬(雌雄各半),设计剂量序列为:0.05, 0.075, 0.113, 0.169, 0.253, 0.380, 0.570和0.855 mg·kg^-1(50%递增法),以0.253 mg·kg^-1作为起始剂量,每个剂量随机分配一只动物;给药后观察动物的急性毒性反应及体重、心电图的变化,检测血液学、血液生化指标,并进行病理学检查。结果 给予Beagle犬(♂)0.253 mg·kg^-1后,动物未死亡,再以0.570 mg·kg^-1给药 (♀),第2天动物死亡,然后以0.380 mg·kg^-1给药 (♂),第2天动物死亡;0.253 mg·kg^-1剂量动物药后持续观察14 d后处死。0.253 mg·kg^-1剂量动物药后5 h心率明显加快,第2天见呕吐,第3天出现水样便,至观察期结束动物未见明显异常;药后5 h血红蛋白(HGB)和红细胞压积(HCT)明显增加,第2天白细胞数(WBC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)明显升高,总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)明显降低,药后一周逐渐恢复;动物处死后,剖检见肝脏边缘有暗红色斑块,镜下可见重度肝细胞水肿,睾丸精子生发层排列紊乱、较多精原细胞空泡变性、部分坏死、可见多核巨细胞。0.380 mg·kg^-1剂量动物药后5 h心率明显加快,药后5 h HGB, HCT和AST明显升高;给药当天未见其它异常,药后次日死亡,可见淡黄色呕吐物、牙龈苍白;剖检见肺气管周和胃肠道有凝胶状流体,镜下可见胃黏膜固有层局部出血,精子生发层变薄、局部仅余支持细胞、精子减少。0.570 mg·kg^-1剂量动物药后5 h心率明显加快,可见流涎、牙龈稍显苍白,药后5 h HGB, HCT, ALT和AST明显升高;药后次日死亡,有淡黄色呕吐物、水样便;剖检见肺气管周、空肠、回肠内有凝胶状流体,胸腔有淡黄色积液,镜下可见直肠局部黏膜固有层出血灶。结论 雷公藤甲素毒性靶器官为胃肠道、肝脏和睾丸;雷公藤甲素单次灌胃给予Beagle犬的最小致死剂量范围为0.253~0.380 mg·kg^-1。
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  T3.68 参附配伍对附子毒性减低作用

  马增春;肖勇;王宇光;谭洪玲;肖成荣;梁乾德;汤响林;高月

  2013, 27(S1): 103-104.

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  目的 参附汤由人参、附子两味组成,补后天之气无如人参,补先天之气无如附子。本文观察人参对附子毒性的降低作用及其机制。方法 在复方、药材、成分三个层次,动物、组织、细胞三个水平,初步评价了参附配伍的减毒作用。结果 小鼠均匀设计急性毒性实验的研究结果表明,随着附子给药剂量的增大,小鼠的死亡率呈上升趋势,且随着人参对附子的比例增大减毒作用呈现增强趋势。固定附子LD₅₀剂量与人参不同配比的减毒作用研究结果表明:人参与附子配伍的减毒作用在一定范围内随着人参剂量的增加而增加,尤其在人参:附子为1:1及大于1:1时更明显。人参附子配比1:1为参附配伍减毒作用的分界点,可作为临床用药的参考依据。采用静注乌头碱20 μg·kg^-1诱发大鼠心率失常,观察参附及其配伍对心率失常的影响。人参配伍附子能明显减轻其主要毒性成分乌头碱引起的实验性心律失常。通过观察人参、附片、参附注射液对心肌细胞的影响,从细胞水平研究参附配伍的减毒作用,结果表明参附配伍心脏保护作用可能通过CYP2J3介导。结论 围绕"人参如何减附子之毒",从动物、组织、细胞三个水平初步阐明了人参对附子减毒的现象、规律、机制。
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  T5.13 γ射线和苯并芘对HPRT基因突变的影响

  刘建功;段志凯;左雅慧;党旭红;刘红艳;张忠新

  2013, 27(S1): 149-150.

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  目的 了解γ射线和苯并芘对细胞次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移(HPRT)基因位点的影响,探索一种用于鉴别诊断γ射线和苯并芘引起的细胞损伤的早期检测敏感指标。方法 选择年龄在24~29岁之间、近期无放射性物质接触史的3名健康男性为供血者,无菌条件下静脉取血每人16 ml,分装到16个EDTA抗凝管中,其中10个样品管进行⁶⁰Coγ射线照射。中国辐射防护研究院附属医院Co-60治疗机进行γ射线照射,照射剂量率为1.313 Gy·min^-1,照射剂量分别为0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0 Gy,误差范围为±0.3%, 然后37℃静置培养24 h。另外6个样品管进行苯并芘染毒,浓度分组为0,0.5,1,3,5和10 mg·L^-1,作用时间为24 h,然后提取基因组DNA,使用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法分析γ射线和苯并芘对细胞HPRT基因突变位点频率的变化情况,通过统计软件分析HPRT外显子突变量效关系,从而筛选γ射线和苯并芘对细胞损伤的HPRT差异突变位点。结果 0~5 Gy剂量范围内,HPRT的外显子5突变频率随照射剂量增加而上调,通过拟合建立了突变频率与照射剂量间的剂量-效应直线方程(y=0.4298+0.0823x,P<0.01,R²=0.93)而0~10 mg·L^-1苯并芘染毒后,HPRT的外显子5突变频率随照射剂量增加没有发生明显改变,通过拟合建立了突变频率与照射剂量间的剂量-效应直线方(y=0.4200+0.0019x,P>0.05,R²=0.45)。结论 γ射线对细胞HPRT基因外显子5突变频率的变化具有明显影响,而苯并芘对细胞HPRT基因外显子5突变频率的变化没有具有明显影响,HPRT基因外显子5有望成为γ射线和苯并芘的鉴别点。
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  T5.15 采用TALEN技术敲除内源性Tip60基因

  张赫;张士猛;周平坤

  2013, 27(S1): 150-150.

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  目的 建立稳定敲除Tip60基因的细胞系。方法 拼接特异识别特定序列的TALEN质粒由北京大学张博教授赠送。首先根据Tip60基因序列并结合生物信息学设计TALEN质粒对;根据设计的序列拼接相应的TALEN质粒识别序列;然后将上下游识别序列分别插入TALEN质粒使得识别序列与内切酶Fok I融合表达。TALEN质粒对构建成功并测序验证后,提取质粒。采用上述质粒对共转染293细胞,共转染48h之后提取细胞基因组DNA。采用相应的引物PCR扩增含有切割位点的基因序列并克隆到T载体,继而采用两步PCR方法检测Talen质粒对的切割效率。选择具有较高切割效率的TALEN质粒对转染293细胞,48 h后将细胞系稀释至96孔板培养,使每孔理论上只有一个细胞。培养3~4周传至12孔板扩增培养数天,提取单克隆细胞基因组,采用PCR技术扩增靶片段并进行酶切鉴定,从而筛选出稳定敲除Tip60基因的细胞系。结果与结论 已经筛选出可以对靶位点进行高效切割的TALEN质粒对,并利用该质粒对转染293细胞,成功筛选出单位点稳定敲除Tip60基因的293细胞系。
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  T5.19 高LET α粒子照射诱发人外周血淋巴细胞DNA双链断裂的修复

  张亚平;王晶;张旭霞;暴一众;殷丽娜;陈红红

  2013, 27(S1): 152-153.

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  目的 探索高LET的α粒子照射诱发人外周血G₀期淋巴细胞双链断裂(DSB)-集簇性损伤的修复动力学特点,与低LET γ射线诱发DSB的修复相比较。方法 取3名健康成人外周血进行淋巴细胞分离,将细胞悬液置自制的以Mylar膜为底的培养皿中培养4~5 h,使淋巴细胞单层贴附于Mylar膜上,分别给予0和0.5 Gy α粒子和γ射线照射,于照射后10, 30 min, 2, 6, 24和48 h,采用免疫荧光技术检测DSB的分子标志物53BP1和γH2AX foci、同源重组修复蛋白Rad51 foci的形成及其消除动力学,以及它们在胞核中的空间分布与染色质结构的关系。结果 G₀期人淋巴细胞经0.5 Gy α粒子照射后10~30 min,可见53BP1/γH2AX foci径迹形成,径迹数快速升高达到峰值,照后6 h径迹则完全消失;而53BP1/γH2AX单个 foci数在α粒子照射后2~6 h达到峰值坪台,之后逐渐下降;至照射后24~48 h残留53BP1/γH2AX foci维持在一定水平。与之相比较,0.5 Gy γ射线照射后10~30 min,未见53BP1/γH2AX foci径迹的形成,单个的53BP1/γH2AX foci数照射后早期快速升高达到峰值,之后快速下降,至照射后24~48 h残留53BP1/γH2AX foci数量明显低于α粒子照射诱导的foci形成。53BP1/γH2AX foci在不同染色质结构的空间分布结果表明,α粒子照射后10~30 min,在DAPI亮染的异染色质中可见53BP1/γH2AX foci形成,其数量明显高于γ射线照射后诱导的量;照射后2 h则均移位至DAPI淡染的常染色质区域,α粒子照射诱发的53BP1/γH2AX foci径迹则在异染色质旁形成弯曲的形态;照射后6 h 53BP1/γH2AX foci均位于常染色质区域,提示α粒子和γ射线照射均能诱导异染色质DNA的DSB,而对其的修复可能需要移位至常染色质区域才能进行。修复蛋白Rad51 foci在α粒子和γ射线照射后30 min~6 h有所升高,但与本底值无明显差异。结论 α粒子照射能诱发人外周血淋巴细胞异染色质53BP1/γH2AX foci形成,照射后24 h持续存在的53BP1/γH2AX foci为其作为生物剂量估算指标提供了可能,53BP1/γH2AX foci径迹可作为判断是否存在α粒子内照射的生物指标,同源重组在G₀期淋巴细胞DSB修复中并未起到关键的作用。
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  T5.26 PIG3和XPC基因表达定量分析作为放射损伤生物标志物研究

  刘晓丹;周平坤

  2013, 27(S1): 156-156.

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  目的 探讨PIG3和XPC基因在正常人群中的的差异性,以及福岛核事故以来长期旅居日本人员中PIG3和XPC基因的表达状况。方法 以40 名国内(北京)居民和84名旅日人员的外周血为研究对象,采用进行实时定量PCR技术对PIG3和XPC基因表达进行检测,观察两人群的差异、并观察性别、年龄及在福岛核事故之后是否到过福岛等影响因素是否对PIG3和XPC基因的表达的产生影响。结果 在国内人员的检测结果表明,PIG3和XPC基因的表达水平与年龄、性别无明显的相关性。在驻日人员中发现PIG3和XPC基因的表达与年龄呈正相关,其中PIG3基因在20~30岁、30~40岁、及50~60岁之间均有显著性差别。旅日人员中PIG3和XPC基因的表达与性别不相关。两个人群的PIG3基因表达经统计学分析无差别,而XPC基因的表达差异有显著性,旅日人员高于国内居住人员,经性别分析发现驻日人员中的男性的XPC基因的表达显著高于国内居住人员。在旅日人员中比较去过福岛与否发现,两者PIG3和XPC基因的表达无差别。结论 PIG3和XPC基因在国内居住人群中表达具有个体差异小、不受年龄和性别影响的特点,且实时定量PCR的方法具有快速、灵敏度高的、特异性强的特点,是理想的辐射生物剂量计模型。在福岛核事故1年之后,在旅日人员中发现XPC基因的表达高于居住国内人员,PIG3基因的表达无差异。
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  T6.8 PM_2.5对人原代支气管上皮细胞内炎症因子和活性氧的诱导

  吴磊;江高峰;陈丹;宋世震

  2013, 27(S1): 161-162.

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  目的 观察PM_2.5及其主要可溶性金属成分对人支气管上皮细胞主要炎症因子IL-1, IL-6和IL-8产生和ROS的诱导作用及其机制。方法 人原代支气管上皮细胞初始接种于支气管上皮细胞基础培养基的组织培养瓶中(0.5 μg·L^-1的人表皮生长因子,0.5 mg·L^-1的氢化可的松,5 mg·L^-1的胰岛素,10 mg·L^-1转铁蛋白, 0.5 mg·L^-1的肾上腺素, 6.5 μg·L^-1的三碘甲腺原氨酸,50 mg·L^-1庆大霉素,50 μg·L^-1两性霉素-B,52 mg·L^-1牛垂体提取物和0.1 μg·L^-1视黄酸);将采购的PM_2.5颗粒物悬浮于超纯水中,用前超声混匀制成25, 50和100 mg·L^-1低中高三个剂量备用,对照组PM_2.5浓度为0 mg·L^-1。将培养的人原代支气管上皮细胞暴露与PM_2.5悬液共培养24 h,收集培养液并离心,使用人ELISA试剂盒测定IL-8、IL-6、肿瘤坏死因子和IL-1β在上清液中的水平;使用流式细胞仪(氩离子激光器,波长488 nm)并利用荧光探针检测人原代支气管上皮细胞内活性氧的发生。结果 与对照组相比,PM_2.5 25, 50和100 mg·L^-1处理组,IL-1含量存在显著差异(P<0.05),但不同浓度组间IL-1含量无明显差异。IL-8在低剂量和高剂量组与对照组比较有显著性差异,不同剂量组间无显著性差异。TNF-α对照组与各处理组见均有显著性差异(F=10.819,P<0.05),处理组间低、中剂量组与高剂量组间差异有显著性(P<0.05)。IL-6含量对照组与100 mg·L^-1组有显著差异(F=17.010,P<0.05),而与低、中浓度组比较无明显差异,且此两组间也无明显差异。ROS平均荧光强度有显著性差异(F=84.814, P<0.01),且不同浓度处理组间差异也具有显著性。结论 人支气管上皮细胞暴露于PM_2.5环境下能促使细内炎性因子的产生;不同浓度梯度下对细内ROS具有明显的诱导作用且呈剂量反应关系。
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  T6.11 骨形态发生蛋白7拮抗石英致肺上皮-间质转化中 Smad通路的作用机制

  杨耿侠;朱钟慧;王炎;高艾;牛丕业;田琳

  2013, 27(S1): 163-163.

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  目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)是否能抑制石英诱导的上皮-间质转化(EMT),达到延缓矽肺纤维化作用,并初步探讨Smad信号通路发挥的作用。方法 60只雄性Wistar大鼠随机分成对照组(n=20)、矽肺组(n=20)和BMP-7治疗组(n=20),采用非暴露式气管内注入法染尘,矽肺组和BMP-7治疗组气管内注入1 ml石英粉尘悬液(50 g·L^-1);染毒后第8天开始BMP-7治疗组隔日腹腔注射rhBMP-7(300 μg·kg^-1)分别于染毒后第15和30天处死大鼠,留取肺组织标本。行HE染色观察肺组织病理变化;行Masson胶原特异染色,观察肺组织纤维化程度变化;碱水解法检测肺组织羟脯氨酸含量变化。用免疫组化法检测上皮细胞标志物E-Cad和间质细胞标志物Vimentin蛋白表达的变化。用Western blot方法检测Smad信号通路相关的蛋白的变化。采用A549细胞进一步验证BMP-7对石英诱导EMT的作用。结果 矽肺组大鼠肺组织中见炎性渗出、肺间隔增厚和细胞结节,BMP-7治疗组与相应矽肺组病变有不同程度减轻。而且,BMP-7治疗组与矽肺组相比,肺组织胶原纤维的含量有明显降低(P<0.05),羟脯氨酸含量的变化与之相似。矽肺组大鼠间质细胞标志物波形蛋白表达的上调,而上皮细胞标志物E-Cad表达下调(P<0.05),BMP-7治疗抑制了波形蛋白表达的上调促进了E-Cad表达的下调(P<0.05),在体外细胞实验中也得到了相似的结果。BMP-7治疗组中,TGF-β/Smad通路的特异性Smad2/3蛋白的表达与矽肺组相比有明显降低(P<0.05),而BMP/Smad通路的特异性Smad1/5/8的表达上升。结论 EMT在矽肺纤维化过程中发挥重要作用。BMP-7具有抑制EMT的作用,可能是其发挥抗纤维化作用的途径之一。更重要的是,BMP-7抑制EMT作用与TGF-β/Smad通路的抑制及BMP/Smad通路的激活有关。
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  T6.14 代谢酶基因多态与苯作业工人微核率的关系

  王金玮;张光辉;徐晓文;叶玲丽;夏昭林

  2013, 27(S1): 164-165.

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  目的 探讨代谢酶基因多态对苯作业工人外周血淋巴细胞微核率的影响,为苯作业工人的职业健康危害防控提供科学依据。方法 选取385例接苯工龄超过1年的工人为接触组,以102例不接触苯及其他毒物的健康工人为对照组。采用外周血淋巴细胞胞质阻滞微核试验(CBMN)评价个体染色体损伤水平, 采用饱和酚-氯仿抽提法提取外周血DNA,用聚合酶链反应-限制性内切酶长度片段多态性方法(PCR-RFLP)分析GSTM1, GSTT1, GSTP1 exon 5, CYP2E1-1293, CYP2E1-1019, CYP2E1 intron 6, mEH exon 3, mEH exon 4基因多态性。结果 与对照组(1.82±1.17)‰相比,苯作业工人微核率(3.35±1.91)‰明显增高(P<0.01)。据累积接触剂量的中位数及四分位数将接触组分为四组,分别与对照组比较,结果显示在调整年龄、性别、吸烟及饮酒情况后,苯作业工人微核率随苯累积接触剂量升高而增加(P<0.01)。与低龄组(≤30岁)相比,苯接触工人年长组(>30岁)表现为显著的染色体损伤 (FR=1.13, 95%CI: 1.02~1.25; P<0.05)。多因素Poisson回归分析也显示苯作业工人微核率比对照组显著增高,差异有统计学意义(FR=1.85, 95% CI: 1.59~2.17; P<0.01)。与野生纯合型(GG)相比,苯作业工人CYP2E1-1293突变基因型(CC+GC)的微核率轻微升高(FR=1.12, 95%CI:0.99~1.25; P=0.059)。接触组CYP2E1-1019突变型(TA+AA)微核率比野生纯合型(TT)明显升高(FR=1.21, 95% CI: 1.09~1.35, P=0.001)。本次研究未发现其他代谢酶基因位点多态与苯作业工人染色体损伤易感性之间存在关联。结论 在苯作业人群中,苯累积接触剂量与外周血淋巴细胞微核率之间存在剂量-反应关系,外周血淋巴细胞微核率可以作为评价苯作业工人染色体损伤的效应指标。CYP2E1-1019基因多态可能与苯作业工人微核率有一定相关性。
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  T6.16 三甲基氯化锡在SD大鼠体内的吸收、分布和排泄

  武昕;谢玉璇;李颖超;睢罡;戎伟丰;赖关朝;唐小江

  2013, 27(S1): 165-166.

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  目的 探讨三甲基氯化锡(TMT)的吸收、分布、排泄规律。方法 取雌性、雄性SD大鼠各54只,分别随机分为18个组,每组3只。1组为空白对照组,腹腔注射生理盐水后立即经眼眶采血,另17组灌胃给予TMT 10 mg·kg^-1,分别在给药后10, 20和30 min;1, 2, 3, 4, 6, 8, 12和24 h;3, 6, 9, 12, 28和90 d共17个时间点经眼眶采血并采集主要脏器。另取雌性、雄性SD大鼠各5只,分别灌胃给予TMT 10 mg·kg^-1,收集染毒前连续12 h、染毒后第1, 2, 3, 6, 9, 12, 18, 28, 40, 55, 70和90 d共13个时间段连续24 h的尿液。用GC-MS测定血液、组织、尿液中TMT的含量水平,用3P87软件计算毒代参数。结果 大鼠灌胃TMT后,全血和血浆半吸收期分别为0.16和0.21 h;清除率分别为1.77×10^-4和0.03 L·kg^-1·h^-1;消除半减期分别为15和10 d。全血曲线下面积约为血浆的167倍。灌胃后10 min心、肝、脾、肺、肾、脑等各脏器即可检测到TMT,30 min浓度接近峰值,6 h达到最高;红细胞中TMT浓度远大于各主要脏器,且红细胞>脾>肝>肾>心。TMT在组织中消除半减期为10 d左右,但在RBC达16.53 d。TMT经尿液排泄较缓慢且排泄量恒定:肌酐校正的尿TMT含量第6天最高,第90天仍可检测到TMT。结论 大鼠灌胃给予TMT染毒后,TMT可被快速吸收,迅速分布在红细胞内,可通过血脑屏障进入脑,缓慢经尿排出。
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  T6.20 职业性低浓度苯暴露人群生物标志物

  沙焱;周伟;杨震宇;朱晓玲

  2013, 27(S1): 168-168.

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  目的 探索职业性低浓度苯暴露人群尿液中苯巯基尿酸水平及外周血聚ADP-核糖化相关基因表达变化规律,以及作为生物标志物的意义。方法 收集研究对象社会人口学信息,作业场所空气中苯浓度检测:呼吸带个体采样,检测空气中苯浓度,共计3次。另采集班后尿,利用液质联用方法检测尿中苯巯基尿酸水平。采集人群外周血,提取总RNA,利用荧光定量PCR检测PARP1,PARG,DNMT1表达情况,外周血分离白细胞,提取总蛋白,免疫印迹检测各组目的基因对应蛋白质表达水平。对于实验结果中计数资料的比较采用person卡方检验,正态分布连续变量采用两个样本t检验分析,非正态分布的连续变量采用Wilcoxon's秩和检验进行分析。采用多元回归调整可能影响结果的混杂因素,比如年龄,性别,吸烟,二手烟暴露,受教育程度等。统计分析采用SPSS16.0软件完成。结果 苯暴露组157名,对照正常人群98名。研究对象多为男性,暴露组与对照组的社会人口信息大部分类似。其中受教育程度在暴露与对照人群中差异显著(P<0.01)苯暴露组研究对象的环境烟草暴露明显高于对照组(P<0.01),在回归分析时对这两项进行了调整。结果:各组平均年龄按工龄分组,10到15年组 49人,5到10年组48人,5年以下组60人。暴露组苯浓度(0.22±0.08)mg·m^-3,各工龄组间苯暴露浓度无显著性差异,对照组苯浓度低于检出限值0.03 mg·m^-3。暴露组SPMA (8.5±0.23)μg·L^-1, 对照组SPMA (1.27±0.18)μg·L^-1(P<0.01)。10年以上组PARP1,PARG,DNMT1表达下降,相对表达分别为0.745±0.021,0.554±0.034, 0.427±0.013,5到10年组分别为0.473±0.09, 0.324±0.032, 0.362±0.043,5年以下组分别为0.336±0.03, 0.302±0.09, 0.291±0.08。暴露组各基因表达与对照相比均具有显著性(P<0.01),其中10年以上组与5年以下组相比具有显著性差别,(P<0.01)。各基因对应蛋白质水平也表现出类似的下降。结论 在低浓度苯暴露条件下,PARP1,PARG,DNMT1基因表达表达下降,尤其在低浓度苯暴露的早期下降更加明显,基因表达的下降趋势随着苯暴露时间增加而恢复,但在10年以上组与对照组相比仍然表现为下降。尿液中苯巯基尿酸可以作为苯暴露内剂量,PARP1,PARG 及DNMT1基因表达下降与尿中苯巯基尿酸水平具有负相关。
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  T6.30 茶树油皮肤消毒液的毒理学安全性评价

  董活波;杨美玲;胡帅尔;黄俊明;陈壁锋;张紫虹;李文立;陈美芬

  2013, 27(S1): 173-174.

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  目的 研究茶树油皮肤消毒液反复使用对哺乳动物的毒性作用及其靶器官,并确定其最大未观察到有害作用剂量和最小观察到有害作用剂量,为茶树油消毒剂的进一步开发利用提供理论依据。方法 按照《消毒技术规范》(2002年版),采用大、小鼠急性经口毒性试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、皮肤刺激性毒性试验和亚急性毒性试验,观察茶树油皮肤消毒液对实验动物的毒性作用。结果 大、小鼠急性经口毒性试验结果显示,茶树油皮肤消毒液的LD₅₀均大于5000 mg·kg^-1,属实际无毒级;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果表明,样品各剂量组(0.5, 2和5 g·kg^-1)与阴性对照组比较差异无显著性意义(P>0.05), 阳性对照组与阴性对照组比较差异有非常显著性意义(P<0.01),故试验结果为阴性,未发现该受试样品对体细胞有致突变作用;在多次完整皮肤刺激试验中,对新西兰家兔的皮肤受试区连续涂抹茶树油消毒剂原液14 d后,计算每天每只动物平均积分,每只动物的积分都小于0.5,属无刺激性;亚急性毒性试验,根据急性经口毒性LD₅₀值,设0.1, 0.3和1 g·kg^-1 3个剂量组和1个阴性对照组,各剂量组与阴性对照组比较,大鼠一般生理体征、行为、大小便、皮毛等均无异常;体重增长、脏器重量和脏体系数指标正常;血常规指标正常;血清生化指标正常;肝、肾、胃及小肠等器官的大体解剖和组织病理学检查未发现异常;茶树油皮肤消毒液的最小观察到有害作用剂量未检出,最大未观察到有害作用剂量大于1 g·kg^-1,未发现茶树油皮肤消毒液对大鼠亚急性经口毒性的主要靶器官。结论 在本实验条件下,茶树油皮肤消毒液属实际无毒级;在5 g·kg^-1范围内,对体细胞无致突变性;无皮肤刺激性;亚急性毒性试验最大未观察到的有害作用剂量大于1 g·kg^-1,因此茶树油皮肤消毒液毒性较低,对皮肤刺激性小。
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  T19.12 毒理学在食品接触材料安全评估中的应用

  曾娟;张霞;朱斌;李晶

  2013, 27(S1): 348-348.

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  本文从食品接触材料定义、暴露评估、危害评估等方面讨论食品接触材料的安全性评估以及毒理学在其中的应用。目前全球已经开展食品接触材料安全评估的国家和地区包括欧盟、美国、加拿大、日本等发达国家,较全面且有代表性的是欧盟和美国两套体系,其中欧盟的暴露评估方法较为保守,主管当局正着手开发新的评估方法,而美国的膳食暴露评估结果更接近真实的暴露水平,因此本文围绕美国的食品接触材料评估体系展开讨论。
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  T19.15 改变环境保护工作理念,加强化学品环境管理

  聂晶磊;霍立彬

  2013, 27(S1): 349-350.

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  工业制造过程是有管理、有组织、有预谋、人为主观故意的输入与输出的综合过程,这种过程包括原料和能源(水与电)的输入,过程工艺的控制和产品的输出收集。传统的"三废"管理并没有涉及原料、产品和工艺,只是聚焦于排放后的事实,而化学品的环境管理正是将管理的视野从后端调整到了前端,不仅仅聚焦于产品和原料,还特别关注于工艺过程。而只有生产工艺改进,才是减少三废排放和少用有毒有害原料和产品的技术本质。从三废排放的后置角度实施环境管理,容易让人理解和接受,但难的是通过环境监测来量化排放量实现管理。环境监测主要是针对化学物质在某个时刻和某个地点的存在浓度。作为一种量化污染排放的技术,我们强调环境监测的技术,关注环境监测的成本、时间、投入和结果。而工业制造的排放物及排放量是其工艺过程的固有规律。生产过程的原料、工艺和产品,以及规模大小已经决定了此生产过程会产生何种排放物以及排放量的大小,只是我们尚未有技术了解到。环境管理需要做的是真正以减少污染物为目标,了解生产工艺,细化分类,排除干扰,掌握各行业各情况的规律,突破监测的限制。通过将事后废水、废气、固体废物三废排放与事前原料、工艺、产品三项要素相结合的方式,推进对企业的全面了解和污染排放的深入理解,而这种综合的手段和视角从整体出发,能够从前往后查找和解决问题,而不是孤立地从某个环境介质入手。同时环境监管者可以基本掌握企业的各方面情况,综合检查企业。此外,参考和理解发达国家的环境管理实践,可以看到化学品环境管理和立法的重要性。将化学品、设施和企业这三个不同维度的管理与三废管理的结合将给环保工作注入新的活力和理念,一改以前的补救式、倒逼式的事后管理和厂外管理的被动状态,向着指导型、主动型的事前管理和厂内管理的主动管理转变。只要我们加强化学品环境管理,将生产工艺、毒理学、物质筛查的知识纳入管理技术体系,工业污染防治的环境保护工作必将会进入一个全新的时代。
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  T19.18 药物安全评价试验中普通级Beagle犬的管理

  杨光;吕耀中

  2013, 27(S1): 350-351.

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  针对动物的采购和运输,接收检疫适应和驯化,饲养管理,日常观察和异常情况处理等环节,结合我单位对普通级Beagle犬管理经验,做好普通级Beagle犬管理,维护Beagle犬的健康和福利,保证试验数据的可重复性和科学性。通过犬的采购和运输,犬的接收检疫适应和驯化,犬的饲养管理,犬日常观察和异常情况处理,资料的归档与保存等环节的管理,规范各项操作,建立犬管理的各项文件,对于试验中可能出现的问题提出解决方案和预防措施。动物要通过合法手段获得,在运输过程中提供饮水和饲料,合适的温湿度条件和足够的空气,将运输对犬的应激刺激降到最低。犬在进入实验室之前动物室管理人员核对供应商提供动物质量合格证,动物健康档案和动物检疫合格证明。确认动物数量体重年龄等条件是否与订单相符。兽医对动物进行临床检查观察是否有异常症状。保证饲料、饮水、卫生措施符合国标要求,保证犬的行为管理符合《实验动物饲养管理和使用指南》的要求、环境监测。在试验过程中根据试验计划书的要求对犬的健康状况定期监测。犬实验室的资料包括相关SOP,各项资质证明,检测报告和试验记录。针对性的管理措施在实际工作中取得良好的效果。
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  T19.20 辽河水系沉积物重金属的分布特征及污染评价

  武江越;周俊丽;高富;刘征涛

  2013, 27(S1): 351-352.

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  本研究通过对辽河表层沉积物的重金属污染状况调查,对比分析丰水期、枯水期6种重金属(Cr, Ba, Ni, Cu, Zn和Pb)总量,评价了辽河水系沉积物中的重金属含量及污染程度,并利用统计分析的方法进行了污染来源分析,以期为综合治理辽河流域重金属污染提供基础数据。采用ICP-MS方法测定了辽河流域19个采样点位枯水期以及丰水期表层沉积物中6种重金属(Cr, Ba, Ni, Cu, Zn和Pb)的含量。用地累计指数法对污染程度进行了评价,并通过主成分分析法确定了重金属污染来源。结果显示,辽河水系表层沉积物各重金属含量明显低于2008年的调查结果,与中国其它水系相比重金属含量处于低等水平,枯水期重金属含量和污染程度高于丰水期数据。重金属Ba和Zn污染程度较大,Cr和Ni污染较轻,Cu、Pb属于无污染,各重金属污染程度排序为:Zn>Ba>Ni> Cr>Cu>Pb。浑河抚顺段L3点位的污染最为严重。通过主成分分析进一步对重金属污染来源的确定,发现前2个主成分的贡献率分别为57.49% 和17.22%,污染来源主要是工业和生活污水。
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  T20.3 百草枯和MPTP诱导小鼠神经母细胞瘤细胞microRNA表达谱的改变

  王清清;吴思英;李煌元

  2013, 27(S1): 356-357.

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  目的 探讨百草枯(PQ)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)损害时microRNA(miRNA)表达谱的变化情况,并比较这两种神经毒物所致miRNA表达谱改变模式。方法 (1)PQ 0, 100和300 μmol·L^-1分别处理Neuro-2a细胞12, 24和48 h,Hoechst33258染料法(n=5)和AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞仪(n=3)测定细胞凋亡;MPTP 0和300 μmol·L^-1处理Neuro-2a细胞48 h(n=3),AnnexinⅤ-FITC/PI测定细胞凋亡;(2)PQ 0和300 μmol·L^-1和MPTP 300 μmol·L^-1处理Neuro-2a细胞48 h(n=3)后,进行miRNA芯片检测,分析miRNA表达谱的变化,并通过火山图(Volcano Plot)过滤,确定差异表达的miRNA(差异倍数(FC)≥1.2,P<0.05);(3)挑选出6个差异表达的miRNAs (miR-17-5p, miR-93-5p, miR-210-3p, miR-374-5p, miR-378-3p, miR-503-5p),用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证其表达水平;(4)用TargetScan,miRbase和miRanda预测miRNA潜在靶基因;对特异的miRNA下游靶基因进行基因本体(GO)分析和KEGG通路分析。结果 (1)PQ可诱导Neuro-2a细胞凋亡和死亡,且存在时间-剂量效应和浓度-剂量效应,时间和浓度之间存在交互作用;MPTP也可诱导Neuro-2a细胞凋亡和死亡。(2)300 μmol·L^-1 PQ和300 μmol·L^-1 MPTP处理细胞48 h,均可引起miRNA表达谱的改变;与对照组比较,PQ组60个miRNAs表达上调, 228个表达下调;MPTP组506个表达上调,70个表达下调。(3)qRT-PCR验证miRNAs的表达水平的结果表明:与对照组比较,PQ组miR-374-5p和miR-503-5p表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);MPTP组miR-93-5p表达上调,差异无统计学意义(P>0.05);与PQ组比较,MPTP组miR-17-5p和miR-378-3p表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),miR-93-5p和miR-210-3p表达上调,差异无统计学意义(P>0.05);其结果与芯片结果大体一致。(4)联合应用靶基因预测程序预测到362个共同靶基因,基因本体(GO)分析结果表明:miR-17-5p和miR-93-5p共同参与DNA依赖的转录调控、RNA代谢过程和分子功能的调节,miR-17-5p还参与细胞内信号级联、嘌呤核苷酸的结合过程,miR-93-5p还参与磷代谢、转录调节子的活性过程;KEGG pathway分析结果表明:miR-17-5p和miR-93-5p共同参与内吞作用、细胞周期通路, miR-17-5p还参与MAPK信号通路、泛素介导的蛋白质水解,miR-93-5p还参与膀胱癌、TGF-β信号通路、p53信号通路。总之,这些结果共同提示miRNA可能参与PQ诱导和MPTP诱导的神经细胞退行性病变过程。结论 PQ和MPTP致神经细胞损害时均出现miRNA表达谱的特征性改变,miRNA可能参与PQ和MPTP致神经细胞退行性病变的分子机制。
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  T20.6 Runx2在氟砷联合染毒大鼠骨骼毒性PTH-cAMP-PKA信号通路中的调控作用

  洪峰;郑冲;徐德淦;钱亚利

  2013, 27(S1): 358-359.

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  目的 探讨Runx2在氟砷联合染毒大鼠骨骼毒性PTH-cAMP-PKA信号通路中的调控作用,在剂量-效应关系基础上分析氟砷联合骨骼毒性的作用模式,为氟砷联合骨骼毒性的分子机制研究提供实验依据。方法 SD大鼠析因设计方法随机分成9组,每组6只,雌雄各半。用氟化钠(NaF)和亚砷酸钠(NaAsO₂)灌胃染毒:对照组、低氟组(5 mg·kg^-1)、高氟组(20 mg·kg^-1)、低砷组(2.5 mg·kg^-1)、高砷组(10 mg·kg^-1)、低氟低砷组、低氟高砷组、高氟低砷组、高氟高砷组,连续染毒6个月。收集大鼠血样、尿样、骨骼样本,检测尿氟、尿砷、骨氟、骨砷、骨密度、骨钙素(OCN)、骨涎蛋白(BSP)、尿Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(UNTX)、Runt相关转录因子2(Runx2)、甲状旁腺素(PTH)、蛋白激酶A(PKA)、cAMP反应原件结合蛋白(CREB)、金属基质酶9(MMP-9)、Osterix因子、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)蛋白浓度及Runx2 mRNA相对表达量。氟离子选择电极法测定氟浓度,氢化物发生器-电感耦合等离子体离子发射光谱法测定砷浓度;双能x线骨密度仪测定骨密度;酶联免疫吸附法测定OCN, BSP, UNTX, PTH, PKA, CREB, Runx2, MMP-9, Osterix和RANKL蛋白浓度;荧光定量PCR法测定Runx2 mRNA相对表达量。结果 高氟低砷、高氟高砷组大鼠氟斑牙随砷染毒剂量增加病变程度增加,低氟暴露下砷对氟斑牙程度无明显影响;氟、砷染毒剂量与UNTX之间存在剂量-效应关系(P<0.05),氟、砷对大鼠UNTX的主效应均有统计学意义(P<0.05),但氟、砷对UNTX的交互作用无统计学意义(P>0.05);氟染毒量与OCN和BSP之间存在剂量-效应关系(P<0.05),砷与OCN和BSP浓度无明显相关关系(P>0.05)。低砷组、低氟高砷组骨密度略降低,其余各剂量组骨密度均略高于对照组,随着氟剂量的升高而增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。氟与PTH-cAMP-PKA信号通路各标志间为正相关关系(P<0.05),砷与PTH、PKA蛋白、Runx2 mRNA间为正相关关系(P<0.05),与Runx2蛋白为负相关关系(P<0.05);氟、砷与Runx2 mRNA, Runx2, mmp-9, RANKL和 Osterix蛋白交互作用明显(P<0.05),Runx2 mRNA在低氟高砷、高氟高砷组分别低于低氟与高砷组、高氟与高砷组表达量之和,Runx2蛋白在高氟低砷、高氟高砷组分别低于高氟与低砷组、高氟与高砷组浓度之和,低氟低砷组MMP-9蛋白浓度低于低氟与低砷组之和,高氟低砷组Osterix和RANKL蛋白浓度均低于高氟与低砷组之和,差异均有统计学意义(P<0.05);Runx2 mRNA与Runx2, MMP-9, Osterix和RANKL蛋白之间为正相关关系(P<0.05)。结论 砷能促进较高剂量氟暴露致大鼠氟斑牙的严重程度,表现为不完全协同作用;氟、砷对骨质溶解吸收的影响主要表现为单独作用,在一定剂量组合下表现为相加作用,而对成骨细胞的影响主要为单独作用;氟砷联合染毒致大鼠骨骼毒性效应主要表现为骨质硬化;氟砷联合染毒对Runx2, mmp-9, RANKL和Osterix蛋白及Runx2 mRNA的交互作用为拮抗作用;PTH-cAMP-PKA通路参与了氟致骨骼毒性作用机制,砷通过影响Runx2转录水平表达而影响Runx2蛋白水平,继而使mmp-9, RANKL和Osterix蛋白改变,间接参与了氟致骨骼毒性的作用机制。
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  T20.39 缺氧诱导因子2α介导EMT和TSC特性获得在砷所致HBE细胞恶性转化中作用及其分子机制

  徐媛;罗菲;李远;赵越;徐文超;庞瑛;申璐;周建伟;王心如;刘起展

  2013, 27(S1): 378-379.

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  目的 研究缺氧诱导因子(HIF)调控上皮-间质转化(EMT)和肿瘤干细胞(TSC)特性获得在亚砷酸钠(NaAsO₂)所致肺支气管上皮(HBE)细胞恶性转化中作用及其分子过程,为寻找砷化物致癌的早期生物学标志及发现新的防治措施提供新的线索。方法 NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1慢性处理HBE细胞30代后,通过软琼脂集落形成实验和裸鼠皮下致瘤实验检测细胞恶性转化程度及其致瘤性;通过免疫荧光实验、流式细胞检测和TSC成球实验检测NaAsO₂慢性处理HBE细胞发生EMT, TSC特性获得情况,观察正常及恶性转化细胞中E钙黏着蛋白、N钙黏着蛋白、波形蛋白、HIF-1α和HIF-2α的mRNA和蛋白水平及其变化情况;并应用免疫共沉淀(IP)检测HIF-2α蛋白的泛素化情况;应用染色质免疫共沉淀和Southwestern实验检测HIF-2α与其下游靶基因Twist1和Bmi1结合情况;并进一步观察应用HIF-2α抑制剂托泊替坎处理对NaAsO₂所致HBE细胞以上指标的影响。结果 NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1慢性处理HBE细胞后,细胞生长速度加快,其倍增时间缩短,并且恶性转化细胞能在软琼脂培养基上形成细胞集落,且能在裸鼠皮下形成肿瘤;恶性转化HBE细胞形态逐渐由上皮样细胞向间质样细胞转化,上皮细胞标志E钙黏着蛋白水平显著下降,而间质细胞标志N钙黏着蛋白和波形蛋白水平显著升高;而且在发生EMT过程中,恶性转化细胞SP侧群细胞数显著上升,且能够形成悬浮干细胞球,细胞具有TSC特性;随着NaAsO₂处理HBE细胞代数(恶性程度)增加,HIF-2α水平逐渐增加,而HIF-1α水平无明显变化;NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1阻滞了HIF-2α泛素蛋白酶体降解,从而引起蛋白表达水平及其转录活性升高;HIF-2α直接作用于Twist1和Bmi1启动子区调控其转录,从而调控EMT及TSC特性获得;HIF-2α抑制剂托泊替坎可明显拮抗NaAsO₂所致HBE细胞的增殖、软琼脂细胞集落形成、裸鼠皮下肿瘤形成,而且还可逆转EMT及TSC特性获得。结论 NaAsO₂慢性处理引起HBE细胞阻滞了HIF-2α泛素化分解,从而引起其表达水平升高,然后直接作用Twist1和Bmi1而调控EMT及TSC特性获得,从而使HBE细胞发生恶性转化。
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  T20.41 过氧化物酶体增殖物激活受体γ在胰岛素抵抗中的作用

  李文丽;张伟;王欣;海春旭

  2013, 27(S1): 380-380.

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  糖尿病是一种全世界广泛流行的代谢紊乱性疾病,是继心脑血管病和肿瘤之后,人类的第3大致死原因。全世界现有1.5 亿糖尿病患者,预计到2025 年患者人数将达3亿。大约90%的糖尿病患者是2型糖尿病(T2DM),且患病人数正以每年4%~5%的速率增长。T2DM人群预防的主要难点在于发病机制目前尚不清楚,已知与肥胖、年龄、饮食、遗传、环境等多种因素有关,其主要特点是在慢性发病初期,体内胰岛素分泌水平"正常"或升高,但敏感性下降、血糖持续升高,出现"胰岛素抵抗"(IR)。关于IR形成的机制有多种说法:遗传易感学说、免疫损伤学说、线粒体功能异常学说、氧化应激学说、血管炎性损伤学说、内质网应激学说、游离脂肪酸毒性学说及胰岛素信号转导障碍等。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是一类依赖配体活化的转录因子,属核激素受体超家族成员,参与了许多生理反应的调节,如脂质代谢、糖稳态、细胞分化与凋亡等。迄今已发现,有PPARα, PPARβ和PPARγ三种亚型。(PPARγ)属于II型核受体超家族成员之一,主要在脂肪组织、肝脏和肌肉中表达。PPARγ功能机制的研究表明,PPARγ 位于细胞内多种信号转导crosstalk的关键节点。PPARγ表达激活对炎症、胰岛素抵抗、肿瘤发生发展等过程中都起到重要的调节作用。目前的研究表明,PPARγ与IR关系密切。其一,药理学证据表明,活化PPARγ可以减轻IR。PPARγ激动剂,无论是被广泛使用的胰岛素敏感剂噻唑烷二酮类(TZD)药物还是几种非TZD药物,他们都是通过与PPARγ结合减轻IR,发挥抗糖尿病作用。其二,PPARγ活性的改变可以影响胰岛素敏感性。PPARγ基因突变的个体较少发生IR而患糖尿病。此外,PPARγ磷酸化的改变也可以激活PPARγ而选择性的增强了胰岛素敏感性,在IR阶段具有抗糖尿病作用。其三,活化PPARγ能提高脂代谢而减轻IR。活化PPARγ减少游离脂肪酸的摄取和生成,增加胰岛素的敏感性,减轻胰岛素抵抗及增加血糖的稳定。研究表明,在氧化损伤介导的T2DM模型大鼠中,肝的PPARγ表达下调;氧化剂叔丁基过氧化氢刺激的正常肝细胞系,PPARγmRNA表达下调,给受试动物或细胞补充PPARγ激动剂罗格列酮,细胞的PPARγmRNA表达上调。其四,在脂肪细胞,活化的PPARγ能促进PI3K亚单位p85的表达,促进胰岛素信号传导,改善胰岛素抵抗 。总之,PPARγ在IR中起着非常重要的作用。
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  T20.43 自噬在有机磷引起的迟发性神经毒性过程中的作用

  许海洋;孙英健;许明圆;董晶晶;陈丽萍;伍一军

  2013, 27(S1): 381-381.

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  目的 探讨自噬在有机磷引起的迟发性神经毒性(OPIDN)过程中的作用。方法 将成年母鸡分成对照组与实验组(TOCP染毒组),TOCP处理组的鸡经口给予装入医用胶囊的TOCP。实验组只给予相应的空胶囊。染毒后每天检查动物,观察记录神经毒性症状。分别在染毒后不同时间点取样,检测脊髓与坐骨神经自噬变化;体外实验采用人成神经瘤细胞SH-SY5Y细胞作为TOCP染毒模型,观察和测定TOCP染毒24 h后线粒体自噬变化。结果 TOCP染毒鸡在第7天开始出现轻微的步态失调,且随时间发展而加重。在第13天时发展为严重的共济失调(平均症状分数5.3级),所有鸡在第17天时表现为站立困难或跌倒(平均症状分数7.2级),到第21天则完全瘫痪(平均症状分数8级)。TOCP染毒后出现迟发性毒性症状前期脊髓与坐骨神经自噬相关蛋白表达显著增加,免疫荧光染色和透射电子显微镜显示自噬小体样结构明显增多,而到迟发性神经毒性症状出现后的时期,脊髓与坐骨神经表现为明显的自噬不足;体外研究结果显示TOCP染毒SH-SY5Y细胞24 h后,细胞线粒体自噬显著增强,但并不引起显著的细胞凋亡。结论 染毒TOCP早期异常增强的自噬和染毒后期明显不足的自噬可能参与了OPIDN毒性症状的起始和发展;自噬增强可能是引发OPIDN过程中神经细胞死亡的早期事件。
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  T20.45 三氯乙烯肝细胞毒作用下SET相关磷酸化蛋白质组学

  任晓虎;黄培武;张航;洪文旭;杨细飞;黄海燕;黄新凤;刘建军

  2013, 27(S1): 382-382.

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  目的 利用磷酸化蛋白质组学技术筛选三氯乙烯(TCE)肝细胞毒性作用下SET相关的磷酸化蛋白,为研究TCE致肝细胞毒性的分子机制提供依据。方法 以正常及SET缺陷L02肝细胞为受试细胞,选取TCE 8 mmol·L^-1染毒剂量,染毒24 h,收集总蛋白,胰蛋白酶切后进行iTRAQ标记,混合所有样品后利用二氧化钛柱对磷酸化肽段进行富集,脱盐后利用LC-MS进行分离和鉴定。Western blot验证磷酸化位点。结果 共鉴定1623个磷酸化位点,差异的磷酸化肽段有175条,其中存在显著差异的有15个磷酸化位点。对它们进行基因功能分类后发现共分为14类,其中4.9%磷酸化蛋白参与细胞凋亡,针对HSP-90(Ser 254),4E-BP1(T46),MARCKS(S158)三个磷酸化位点,以及PKM2,ATP5A磷酸化程度进行Western blot验证以及功能性研究,发现这些蛋白磷酸化的变化均可能在不同程度参与TCE毒作用下SET介导的L02细胞凋亡。结论 TCE致肝细胞毒性中,SET及其相关磷酸化蛋白均可通过不同途径参与人肝L-02细胞凋亡的进程。
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  T20.47 高硒诱导氧化应激导致肝胰岛素抵抗

  王欣;海春旭

  2013, 27(S1): 383-383.

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  目的 探讨高硒对糖、脂代谢的影响及其分子机制。方法 SD大鼠随机分为6组,1 正常对照;2 亚硒酸钠灌胃给予219 μg·kg^-1·d^-1;3 亚硒酸钠438 μg·kg^-1·d^-1;4 亚硒酸钠438 μg·kg^-1·d^-1+巯基琥珀酸10 mg·kg^-1·d^-1(ip);5 亚硒酸钠 438 μg·kg^-1·d^-1+吡啶甲酸铬0.5 mg·kg^-1·d^-1(ip);6 亚硒酸钠 438 μg·kg^-1·d^-1+水杨酸钠10 mg·kg^-1·d^-1(ip)注射;亚硒酸钠灌胃6周,进行腹腔注射10 d。培养BRL-3A大鼠肝细胞,以亚硒酸钠1和10 μmol·L^-1处理36 h,构建高硒诱导模型。测定血糖、糖耐量、胰岛素耐量,检测ROS水平,使用分子生物学技术测定相关分子通路。结果 高硒可以激活硒蛋白,包括谷胱甘肽过氧化物酶和硒蛋白P,拮抗铬,导致脂肪组织脂肪分解,脂解产物涌入、并积累于肝组织。肝组织脂肪酸β氧化,产生乙酰辅酶A进入三羧酸循环,同时为线粒体氧化磷酸化提供电子,导致ROS的过量生成,干扰胰岛素信号,引起糖脂代谢的紊乱,导致肝胰岛素抵抗的发生。结论 高硒可以通过多种途径诱导氧化应激,导致肝胰岛素抵抗。
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  T20.49 毒胡萝卜素诱导肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及调控机制

  王丛丛;张燊;邓思君;张朝明;周延;汤树生;肖希龙

  2013, 27(S1): 384-384.

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  目的 本实验旨在探讨毒胡萝卜素(TG)对人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬的影响及其调控机制。方法 体外培养肝癌HepG2细胞,经不同浓度TG干预24 h,分别用Hochest33342染色和罗丹明123检测细胞凋亡形态和线粒体膜电位的变化。生长对数期用TG 1 μmol·L^-1分别处理24, 36, 48和60 h和不同浓度TG(1, 2, 4和8 μmol·L^-1) 处理24 h诱导HepG2细胞,流式细胞术检测TG引起的HepG2细胞凋亡的变化。Western blot检测凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3,Bcl-2,Bax,以及线粒体通路相关蛋白胱天蛋白酶9,细胞色素c(Cyt C) 和内质网通路相关蛋白胱天蛋白酶12的表达情况。体外培养肝癌细胞HepG2细胞,经不同浓度TG(1, 2, 4和8 μmol·L^-1) 作用 24 h和0.5 μmol·L^-1的TG分别处理24, 36, 48和60 h后,采用MDC染色,荧光显微镜观察自噬囊泡,流式细胞术检测其荧光强度。pGFP-LC3质粒瞬时转染HepG2细胞,TG处理24 h后,荧光显微镜检测自噬。Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ, Beclin1, DAPK1的表达情况。结果 TG作用24 h后,HepG2细胞呈典型的凋亡细胞形态。与空白对照组相比,线粒体膜电位显著下降,且呈浓度依赖性。TG作用HepG2细胞后,细胞凋亡率均明显升高,且在一定范围内呈浓度和时间依赖性。免疫印迹法结果显示,凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3,胱天蛋白酶9均发生了剪切表达量下降,抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax和Cyt C表达增加,同时内质网应激相关蛋白胱天蛋白酶12表达量也显著上升,且在一定范围内呈浓度和时间依赖性。经不同浓度TG作用24 h和同一浓度不同时间处理的HepG2肝癌细胞在细胞质可见明显聚集的点状MDC阳性荧光颗粒,且流式细胞术结果显示,自噬发生率在一定的范围内呈时间和浓度依赖性。GFP-LC3在攻毒细胞组中出现明显点状聚集,其数量呈时间依赖性增加。免疫印迹法结果显示,LC3Ⅱ/Ⅰ表达量比值呈时间、剂量依赖性增加,Beclin1和DAPK1的蛋白表达水平随处理时间和浓度的增加,表达量也逐渐增加。结论 TG可诱导人肝癌HepG2细胞发生凋亡,其机制可能与线粒体通路和内质网应激有关。同时通过激活Beclin1引起HepG2细胞发生自噬。
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  T20.52 苯对造血干细胞更新分化及其信号通路的影响

  谈柯宏;孙蓉丽;韦海燕;尹立红;张娟;浦跃朴

  2013, 27(S1): 385-386.

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  目的 探讨苯对C57BL/6小鼠造血干细胞分化能力影响,及其代谢产物1,4-苯醌对多能造血干细胞LSK(Lin^-sca1⁺c-kit⁺)更新与分化信号通路的关键基因表达的影响。方法 36只雄性8周龄C57BL/6小鼠,随机分成3组,以食用油为溶剂,苯染毒浓度分别为0, 150和300 mg·kg^-1·d^-1,皮下注射染毒,每周5 d,连续染毒4周。染毒期间,观察小鼠一般情况,隔天称重,记录小鼠体质量。实验结束,检测各组小鼠体重、血常规指标、脏器系数,分离骨髓细胞并应用流式细胞术分析多能造血干细胞LSK(Lin^-sca1⁺c-kit⁺)比例,比较各组多能造血干细胞(LSK)的比值。以Ari^Ⅲ流式细胞仪分选正常小鼠的LSK细胞,以0.5 μmol·L^-1 1,4-苯醌对多能造血干细胞LSK进行染毒, 48 h后收获细胞,提取RNA, 逆转录获得cDNA,以real-timePCR方法测定造血干细胞信号通路Wnt,Notch与Hh中关键基因β联蛋白,Notch,Bmil的mRNA表达量。结果 实验前后,各组间体重变化无显著性差异。染毒组胸腺系数与对照组相比明显降低。血常规结果显示,染毒组红细胞、白细胞、中性粒细胞与对照组相比明显降低(P<0.05),高剂量组与低剂量组在红细胞、白细胞、血红蛋白中存在统计学差异(P<0.05)。流式细胞仪分析结果显示,每10万个骨髓细胞,对照组、低剂量组和高剂量组多能造血干细胞(LSK)均值为52.64, 28.59, 17.95,染毒组与比照组明显降低,两实验组间无显著性差异。以1,4-苯醌0.5 μmol·L^-1染毒多能造血干细胞(LSK)48 h,结果显示,β联蛋白,Notch1,Bmi1基因在染毒组相对对照组的表达水平分别是0.17, 0.35和0.34,与对照组相比,表达量显著降低。结论 苯具有造血系统毒性,抑制骨髓造血干细胞的更新,其机制可能与苯的代谢产物抑制Wnt,Notch与Hh信号通路相关。
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  T20.55 DAB2IP/AIP1异构体转换在肿瘤发生发展中的作用

  纪卫东;何云;王敏

  2013, 27(S1): 387-387.

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  目的 探讨DAB2IP/AIP1A-1Cs异构体转换在肿瘤发生发展中的作用及机制,为开展异构体特异性靶向干预提供理论依据。方法 通过慢病毒系统,建立稳定的异构体1A和1Cs过表达和敲低的多种肿瘤细胞株(B16F10, 168-FAR, 4T07, 4T1, RWPE-1, PC3);细胞划痕实验和Time-lapse实验检测细胞迁移和活动能力;Transwell细胞侵袭实验评价细胞侵袭能力;小鼠尾静脉注射、皮下注射、原位注射肿瘤细胞实验分析异构体1A和1Cs在整体动物体内对肿瘤发生发展的影响;激光共聚焦检测异构体1A和1Cs的定位;免疫沉淀和GST pull-down实验分析异构体1A和1Cs相互作用蛋白及介导的信号通路;荧光素酶报告基因检测肿瘤细胞中异构体1A和1Cs的启动子活性。结果 成功构建了异构体1A和1Cs过表达和敲低的多种肿瘤细胞株;体外实验发现异构体1A抑制细胞迁移和侵袭,而异构体1Cs促进细胞迁移和侵袭;小鼠肿瘤模型证实异构体1A抑制肿瘤的生长和转移,而异构体1Cs促进肿瘤的转移;机制研究揭示异构体1A和1Cs通过PH结构域与FAK相互作用,异构体 1A存在于胞质,而异构体1Cs定位于细胞膜,且通过激活FAK/Src-Rac信号途径促进肿瘤细胞侵袭转移;异构体1A和1Cs存在不同的启动子,在肿瘤细胞中通过差异启动子活性介导异构体1A-1C转换。结论 肿瘤细胞DAB2IP/AIP1基因可变启动子活性介导了异构体1A-1Cs转换;异构体1A抑制肿瘤生长和转移,异构体1Cs激活FAK/Src-Rac信号途径促进肿瘤侵袭转移;异构体1A-1Cs转换双重促进肿瘤生长转移。本研究不仅为揭示蛋白异构体在肿瘤发生发展中的作用提供新的思路,而且为发现新的肿瘤分子标记和开展异构体特异性靶向干预提供理论依据。
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  T20.57 氢醌处理K562细胞红系分化相关miRNA的表达变化

  易宗春;李扬;余春红;苏日咕嘎;李怡然;唐恪雅;姜良

  2013, 27(S1): 388-388.

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  目的 观察氢醌处理K562细胞红系相关miRNA的表达变化。方法 K562细胞经经氢醌40 μmol·L^-1处理72,应用miRNA表达芯片分析miRNA表达谱变化,应用real time PCR分析确认与红系分化相关miRNAs表达,应用EBI's Microcosm Targets预测分析其靶基因。结果 K562细胞经40 μmol·L^-1氢醌处理72,miRNA表达芯片分析显示,红系相关的miRNAs中,Let-7家族、miR-126*, miR-144, miR-15a/16-1, miR-150, miR-155, miR-210, miR-221/222, miR-34a, miR-376a和miR-96无论是在对照组还是氢醌处理组表达水平均相对较低;miR-103a, miR-15b/16-2, miR-223和miR-24的表达在对照组和氢醌处理组之间没有明显变化;miR-126和miR-451在氢醌处理组的表达水平明显低于对照组。进一步应用real-time PCR进一步分析miR-451和miR-126的表达水平也证实miR-126和miR-451在氢醌处理组的表达水平明显低于对照组。应用EBI's Microcosm Targets预测miR-126靶基因937个,其中包括DNA甲基转移酶DNMT1,组蛋白去乙酰化酶HDAC6和HDAC8,转录因子SOX-2, SOX-30, cAMP-依赖转录因子ATF-2和ATF-3,调亡相关的BAD, VDAC2等;miR-451靶基因1025个,包括转录因子KLF1, KLF6, KLF11, c-myc和NF1-A,调亡相关的BAK1和BIK等。结论 氢醌处理导致miR-451和miR-126等在K562细胞的表达水平降低,从而减弱对靶基因的转录后调控,其中靶基因DNMT和HDAC6/8分别参与DNA甲基化和组蛋白去乙酰化,与以前的研究已发现氢醌可以引起红系相关基因某些CpG位点甲基化水平升高和组蛋白乙酰化水平降低一致;而KLF1也叫红系Krueppel-样转录因子1,是调节红系分化的重要转录因子,提示miR-451和miR-126等表达降低,会这些靶基因表达变化,参与氢醌抑制红系分化的过程。
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  T20.59 亚砷酸钠对HaCaT细胞XPD基因甲基化、mRNA转录及蛋白表达的影响

  肖芸;张爱华

  2013, 27(S1): 389-390.

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  目的 了解亚砷酸钠(NaAsO₂)染毒人皮肤角质形成细胞株(HaCaT细胞)对其着色性干皮病基因D(XPD)启动子区甲基化、mRNA转录及蛋白表达的影响。方法 NaAsO₂ 3.13, 6.25, 12.5和25 μmol·L^-1重复间隔处理HaCaT细胞72 h(NaAsO₂处理HaCaT细胞24 h,隔天再次用NaAsO₂进行相同处理,重复3次);同时以不染毒HaCaT细胞为空白对照(0 μmol·L^-1);各剂量组及空白对照均设三个平行样本。重亚硫酸盐测序-定量甲基化特异性PCR法检测XPD基因启动子区CpG岛甲基化状态,实时荧光定量PCR法检测XPD基因mRNA表达,Western blot法检测XPD蛋白表达。结果 NaAsO₂ 3.13, 6.25, 12.5和25 μmol·L^-1处理细胞后,XPD基因甲基化参照百分比(PMR)分别为(1.55±0.76)%, (4.84±1.98)%, (22.99±5.1)%和(33.69±7.57)%,空白对照未检出甲基化,差异有统计学意义(χ²=13.13,P<0.05)。对PCR产物进行电泳,NaAsO₂ 6.25, 12.5和25 μmol·L^-1剂量组出现阳性条带,进行凝胶DNA回收并克隆测序,测序结果显示NaAsO₂ 6.25, 12.5和25 μmol·L^-1组XPD基因启动子区13个CpG位点甲基化率分别为11.1%, 42.7%和64.1%,NaAsO₂ 12.5和25 μmol·L^-1组分别与NaAsO₂ 6.25 μmol·L^-1组比较差异有统计学意义(P<0.05)。随NaAsO₂剂量增加XPD mRNA转录表达明显降低(F=31.93,P<0.05),NaAsO₂ 6.25, 12.5和25 μmol·L^-1组中XPD mRNA表达明显低于空白对照,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照比较,XPD蛋白表达在低剂量组(3.13 μmol·L^-1)略有升高,后随NaAsO₂浓度的增加而逐渐降低(F=110.77,P<0.05),NaAsO₂ 6.25, 12.5和25 μmol·L^-1组中XPD蛋白表达明显低于空白对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 砷可导致XPD基因高甲基化改变,继而引起XPD基因mRNA及蛋白表达受抑,其可能通过影响XPD蛋白对受损DNA的解旋,继发性抑制DNA修复,促进砷中毒乃至皮肤癌的发生发展。
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  T20.62 wtp53/miR-18a介导砷所致三阴乳腺癌细胞恢复雌激素受体α的体内外研究

  蒋菲;司璐;穆娟;叶献青;王星星;宁士龙;李忠

  2013, 27(S1): 391-391.

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  目的 探寻恢复雌激素受体(ER)α阴性乳腺癌患者ERα功能的方法并深入研究其分子机制对ERα阴性乳腺癌的内分泌治疗具有重要临床意义。方法 检测三氧化二砷(As₂O₃,As)诱导三阴乳腺癌细胞再表达ERα的水平:RT-PCR, qRT-PCR及Western blot;检测As恢复ERα的功能:RT-PCR及qRT-PCR检测ERα靶基因pS2和GREB1的mRNA水平;检测microRNA(miRNA)表达水平:RT-PCR和qRT-PCR;检测miRNA在As恢复ERα中的作用:miRNA-mimics和anti-miRNA转染、RT-PCR、qRT-PCR和Western blot;检测p53在As所致miRNA表达改变及恢复ERα中的作用:野生型p53(wtp53)和突变型p53(mtp53)转染、qRT-PCR和Western blot;体内观察As处理对肿瘤组织p53, miR-18a和ERα的表达及功能的影响:裸鼠皮下荷瘤实验、RT-PCR、qRT-PCR及Western blot。结果 As处理MDA-MB-231细胞可剂量依赖性升高ERα的mRNA和蛋白表达水平,升高pS2和GREB1的mRNA水平,同时升高wtp53的表达和磷酸化水平而下调miR-18a;靶基因预测软件(TargetScan)分析ERα是miR-18a的下游靶基因;在MDA-MB-231细胞中转染anti-miR-18a可上调ERα的mRNA和蛋白表达水平,而在MCF-7细胞或As处理的MDA-MB-231细胞中转染miR-18a-mimics均可下调ERα的mRNA和蛋白表达水平及功能;在MDA-MB-231细胞中转染wtp53可下调miR-18a表达水平,进而上调ERα的表达水平和细胞增殖;转染wtp53可进一步增加As所致MDA-MB-231细胞miR-18a表达下降和ERα表达上升,相反,转染mtp53可阻滞As所致MDA-MB-231细胞miR-18a表达下降和ERα表达上升;将MDA-MB-231细胞接种至裸鼠皮下成瘤后再用As处理,结果发现与对照组肿瘤组织相比,As处理可上调wtp53的mRNA和蛋白表达水平,下调miR-18a表达,进而诱导ERα的表达和活性上升。结论 wtp53下调miR-18a的表达水平在As诱导ERα阴性MDA-MB-231细胞恢复ERα的表达及功能过程中发挥重要作用。
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  T2.53 2012年深圳市宝安区公共场所集中空调通风系统卫生学现况分析

  刘庆成;郭永乐;孙健;刘恩泽;邱燚;余家麟;梁卓凡;曾艳萍;孙群露

  2013, 27(S1): 53-54.

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  目的 调查分析深圳市宝安区医院、商场及宾馆集中空调通风系统的卫生学现况,为进行有效的卫生监管提供依据,预防和控制因集中空调通风系统污染而引起的呼吸道传染病的传播和流行。方法 于2012年随机抽取深圳市宝安区有集中空调通风系统的2家宾馆、2家商场及2家医院,对新风量、空调送风中微生物指标(细菌总数、真菌总数和β-溶血性链球菌)和可吸入颗粒物(PM₁₀);风管内表面的微生物指标(细菌总数、真菌总数和β-溶血性链球菌)和积尘量以及冷却水和冷凝水中的嗜肺军团菌进行检测和评价,并且对6家单位集中空调的基本情况进行了的调查分析。结果 6家单位送风中细菌总数、真菌总数和β-溶血性链球菌、PM₁₀的合格率分别为62.0%, 78.0%, 100.0%和33.3%;6家单位风管内表面的积尘量合格率为91.7%,微生物合格率为100%。6家单位冷却水军团菌的检出率为0,冷凝水嗜肺军团菌的检出率为0。结论 深圳市宝安区公共场所集中空调通风系统存在一定程度的污染,应该加强空调系统的清洗消毒及卫生管理,促进人群健康。
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  T2.56 芳香烃受体在环境毒理学研究中的新认识

  朱从会;赵斌

  2013, 27(S1): 55-55.

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  芳香烃受体(AhR)及其所介导的下游信号通路在二恶英类及其他各种芳香烃物质的体内代谢、生物毒性或生理活性效应等方面发挥着重要作用。其经典的作用机制为各种配体与AhR结合,激活后者并使其得以进入细胞核,进而与芳香烃核转移蛋白(ARNT)结合,AhR-ARNT二聚体能作为一种重要的转录因子,特异性结合到靶基因上游调控区域的二恶英响应元件(DRE)上,并进一步通过直接或间接的作用在基因或蛋白水平上影响多种靶基因的转录和表达。芳香烃受体配体与其他信号通路(如雌激素受体、炎症相关信号通路)交互作用的研究进一步提示AhR所介导的许多潜在的生理效应还尚未被揭示。过去对于二恶英类物质的研究大多集中于对生物体免疫抑制、免疫器官组织毒性病理学等毒性效应研究,近年来发现,TCDD的低剂量暴露条件下则可以通过AhR在免疫调节过程中发挥着重要作用,事实上,TCDD已经成为目前研究AhR激活介导的免疫调节效应的重要工具。目前认为这种调节效应主要是通过直接或间接地对辅助性T细胞(CD4⁺ T细胞)特别是调节性T细胞(Treg)的调控得以实现。然而目前人们尚无有效的方法来权衡低剂量TCDD暴露之后所表现出的对效应T细胞毒性效应和对Treg细胞的诱导效应,也就是说TCDD本身作为一种外源性毒物的属性注定不可能使其成为一种良药。值得注意的是,已经有研究表明机体中存在一些AhR的内源性配体,并且这类配体激活的AhR在维持机体正常的生理功能特别是免疫功能方面发挥着重要作用,尽管这种调控效应通常也会表现为配体依赖性的特征。考虑到AhR的配体在环境、食品、商业制品等中的广泛存在,显然AhR新功能发现对于我们进一步认识环境化学物影响机体免疫应答、免疫系统发育、免疫紊乱等生理或病理过程提供了新的研究思路。目前,我们实验室也正在从事一些AhR介导的TCDD为代表的二恶英类物质的免疫靶细胞毒性与免疫调节效应机制方面的研究,期望通过研究确定TCDD毒性潜在的靶免疫细胞,并期待着能对TCDD所表现出的免疫细胞之间的调控效应的潜在机制作出探究。综上所述,得益于对典型环境污染物TCDD的研究,人们对AhR的生理功能有了更为深刻的认识,对内源性及外源性环境化学物作为AhR配体所介导的不同生理调节功能,特别是免疫调节效应方面研究的深入,让我们越来越多的毒理学人认识到AhR的功能绝不局限于其介导的生物毒性效应,AhR在调节免疫应答、自主免疫性疾病发生发展等过程中的作用正逐渐受到人们的重视,并使其有望成为免疫相关疾病预防和治疗药物研发的一个新靶点。
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  T2.58 呋虫胺对意大利蜂的急性毒性效应

  舒林君;潘秀红

  2013, 27(S1): 56-56.

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  目的 通过摄入法和接触法测定了呋虫胺对意大利蜂的急性毒性,并进行安全性评价,从而为其合理评价和使用提供科学依据。方法 摄入法采用"小烧杯法"进行暴露实验,即将不同剂量的呋虫胺分散在50%蔗糖溶液中,用以饲喂成年工蜂,评估呋虫胺对蜜蜂的急性经口毒性效应。浓度为0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8及1.6 ai mg·L^-1 7个处理组,每组设3个重复,每个重复10只蜜蜂。接触法采用"点滴触杀法"进行暴露实验,即用微量点滴仪将不同浓度呋虫胺丙酮溶液点滴在实验用蜜蜂(供试蜜蜂通过CO₂麻醉后进行点滴操作,点滴量为1 μl)的前胸背板处,评估其对蜜蜂的急性接触毒性效应。实验设置0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08及0.16 ai g/只7个处理组,每组设3个重复,每个重复10只蜜蜂。点滴操作完成后转移至实验蜂笼内并饲以蜂蜜水(体积比:1:2)。将供试蜂在(25±2)℃,相对湿度为50%~70%的实验环境中暴露48 h,并且在暴露后24和48 h时观察各实验组供试蜂的死亡情况和中毒症状。结果 接触法和摄入法实验中各实验浓度出现不同程度的死亡,并出现乏力少动、挣扎跌落、侧倒蹬腿的中毒症状。经概率单位法统计得出:暴露24 h后,摄入法:呋虫胺对意大利蜂的急性毒性的LC₅₀为0.260 ai mg·L^-1,其95%置信限为0.030~0.927 ai mg·L^-1;接触法:LD₅₀为0.039 ai g/只,其95%置信限为0.030~0.048 ai g/只。暴露48 h后,摄入法:LC₅₀为0.084 ai mg·L^-1,95%置信限为0.056~0.113 ai mg·L^-1;接触法:LD₅₀为0.031 ai g/只,95%置信限为0.022~0.039 ai g/只。结论 呋虫胺对蜜蜂的毒性等级为剧毒或高毒。
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  T2.61 样品A对羊角月牙藻的生长抑制实验

  李双;张小艳;吴倩;盛俊杰

  2013, 27(S1): 57-58.

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  目的 本研究项目参考OECD 201测试指导,以羊角月牙藻作为实验物种,通过样品A对羊角月牙藻72 h的生长抑制实验来评价样品A对藻类的短期暴露效应。方法 样品A几乎不溶于水,很难测定溶解度,因此实验采用分散悬浮液。将一定量的样品A加入到OECD培养基中,超声辐射搅拌30 min,磁力搅拌器搅拌约48 h,用玻璃纤维过滤器过滤,制备样品A的储备液。根据预实验结果,正式实验设定一个供试品分散悬浮液滤液的暴露组(名义浓度100 mg·L^-1),同时设置一个空白组,每组6个平行。暴露周期72 h。在暴露开始后的24, 48和72 h分别测定各组的藻细胞浓度,统计72 h时暴露组的生长抑制率。在实验开始和结束时测定各组的样品A浓度。结果 p实验开始时,分散悬浮液(滤液)的样品A的实测浓度为0.13 mg·L^-1;实验结束时,样品A的实测浓度为0.11 mg·L^-1。实验期间,温度控制在22.5℃~23.2℃;空白组pH的变化为0.19,暴露组的pH变化为0.22;光照强度的范围为5.10~5.70 Klux,均满足测试要求。在72 h的试验周期内,空白组的藻类生物量最少增加到了39.14倍,相对应的生长率为1.22 d,满足测试指导要求的空白组的藻类生物量至少增加16倍,相对应的生长率为0.92 d;空白组阶段性平均生长率(对72 h试验来说是0~1,1~2,2~3 d)变异系数平均值为8.07%,没有超过测试指导规定的35%;整个实验周期内,空白组每个平行的平均生长率变异系数为2.02%,没有超过测试指导规定的7%;因此本次实验的有效性是符合的。实验结束时,样品A对羊角月牙藻的生长抑制率为-1.21%~4.18%,平均为0.93%,均低于50%。因此,样品A在本次实验中对羊角月牙藻的72 h-ErC₅₀ > 100 mg·L^-1(以名义浓度计算)。结论 在本次实验条件下,样品A对羊角月牙藻在分散悬浮液(滤液)的暴露水平上没有观察到不良影响,对羊角月牙藻没有急性毒性,样品A对羊角月牙藻的72 h-ErC₅₀ > 100 mg·L^-1(以名义浓度计算)。
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  T2.64 电子垃圾拆解区新生儿多种重金属暴露及其DNA氧化损伤

  倪文庆;黄越;王宵玲;张竞文;吴库生

  2013, 27(S1): 59-60.

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  目的 探讨电子垃圾拆解区新生儿铅、镉、铬、镍暴露对DNA氧化损伤的影响。方法 从电子垃圾拆解区某医院招募了125对母婴作为暴露组研究对象,从非电子垃圾拆解区某医院招募了76对母婴作为对照组研究对象。收集脐带血,并在分娩后对孕妇进行问卷调查。采用石墨炉原子吸收分光光谱法检测脐带血铅、镉、铬、镍浓度,采用酶联免疫吸附试验检测脐带血血浆DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷 (8-OHdG) 水平。结果 拆解区组新生儿脐带血血铅浓度明显高于对照组(中位值110.45 μg·L^-1 vs 57.31 μg·L^-1, P<0.01),同时拆解区组新生儿脐带血血铅浓度超过美国疾病预防控制中心2012年新修订血铅阈值(50 μg·L^-1)比例大于对照组(94.44% vs 58.67%, P<0.01)。拆解区组新生儿脐带血血镉浓度明显高于对照组(中位值2.50 μg·L^-1 vs 0.33 μg·L^-1, P<0.01)。新生儿父母居住在拆解区、父亲或母亲工作与电子垃圾拆解回收相关是导致新生儿脐带血血铅、镉浓度升高的危险因素。拆解区组和对照组新生儿脐带血血铬、镍浓度差异没有统计学意义。拆解区组和对照组新生儿脐带血血浆DNA氧化损伤标志物8-OHdG浓度差异没有统计学意义, 但是多元线性回归分析表明新生儿脐带血8-OHdG浓度与脐带血镉(β=0.097, 95% CI: 0.038~0.155)、铬(β=0.121, 95% CI: 0.044~0.198)和镍(β=0.251, 95% CI: 0.147~0.355)浓度呈正相关。结论 原始的电子垃圾拆解回收活动可导致新生儿脐带血铅、镉浓度升高,血镉、镍暴露可以促进DNA氧化损伤。
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  T2.67 黄曲霉菌与其周围拮抗菌的相互作用

  严全鸿;周建湘;李洪洲;贺竹梅

  2013, 27(S1): 61-61.

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  目的 从黄曲霉菌生长的环境中筛选对黄曲霉生长有抑制作用的细菌,探索黄曲霉菌与其环境周围拮抗细菌的相互作用关系。方法 采用固体培养基和液体培养基进行筛选和检测,从黄曲霉污染的大米中分离得到1株对黄曲霉菌生长具有明显抑制作用的菌株M3;通过16S rDNA序列分析结合革兰氏染色和形态特征对菌种进行鉴定;利用液液萃取、膜透析、固相萃取、制备液相等方法分离获得了M3代谢物的活性成分,采用超高效液相色谱-飞行时间质谱法鉴定了M3活性成分并与标准品的活性进行了对比;采用琼脂扩散法考察了M3菌代谢物对黄曲霉菌生长及高产毒黄曲霉菌代谢物对M3菌生长的影响。结果 初步确定M3菌为革兰氏阴性伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)。采用液体培养基检测,当M3菌的无细胞滤液(CCF)浓度达12.5%时能减少超过50%的黄曲霉菌丝生长量,当CCF浓度达50%时,能完全抑制黄曲霉菌的生长。进一步研究发现,M3菌代谢物能抑制黄曲霉孢子的萌发、减缓菌丝的生长和变粗,但不能降解黄曲霉毒素。虽然M3菌的代谢物能抑制黄曲霉菌的生长,但黄曲霉毒素却不能抑制M3菌的生长。活性成分的分离鉴定结果表明,M3抑制黄曲霉菌生长的活性成分为米酵菌酸。当米酵菌酸的甲醇溶液浓度为6.3~25 mg·L^-1时,从M3中分离纯化获得的米酵菌酸的甲醇溶液与相同浓度的米酵菌酸标准品甲醇溶液在抑制黄曲霉菌生长的活性上未见有明显差异,米酵菌酸能维持抑制黄曲霉菌生长的活性超过14 d。结论 从黄曲霉污染的大米中分离得到对黄曲霉菌生长有明显抑制作用的伯克霍尔德菌,丰富了微生物间作用的多样性,同时有助于了解黄曲霉菌与伯克霍尔德菌之间的相互作用。分离制备并鉴定M3菌的活性成分为米酵菌酸,由于其生物毒性不能直接作为黄曲霉毒素生物控制剂,但作为一种工具试剂可能有助于研究抑制黄曲霉菌生长的机制,并可能为控制黄曲霉毒素提供前体化合物。
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  T2.72 一种氧化应激生物标志物定量分析系统的建立及应用

  殷健;魏金锋;靳洪涛;王爱平

  2013, 27(S1): 63-64.

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  目的 建立一种生物体清除自由基能力的检测方法,并应用于生物体氧化应激效应的检测。方法 本项研究选用国际标准试验用鱼-斑马鱼作为试验生物,主要针对过氧自由基(ROO·)进行测定,以偶氮化合物2,2'-偶氮-双-(2-脒基丙烷)氯化二氢(AAPH)作为氧自由基来源,荧光素钠(FL)为荧光指示剂,并以维生素E类似物(Trolox)作为定量标准,观察自由基与荧光素钠作用后其荧光强度的衰减过程,检测各种抗氧化剂加入体系后延缓荧光素钠荧光强度衰减的能力,以此评价抗氧化剂的抗氧化能力。结果与结论 本研究所建立的定量分析方法具有强特异性;精密度在97%~108%之间,相对标准偏差(%RSD)小于15%;准确度高,回收率在97%~108%之间;重现性佳(变异系数是3.09%);此法的定量检出限和最低检测限分别为3.03和1.00 mmol Trolox/g蛋白,可接受的相关系数(R²)≥0.99。依据所建立的定量分析方法积累的斑马鱼ORAC生理正常值范围为0~50 mmol Trolox/g蛋白,并将四种重金属污染物的污染程度和毒性效应分别进行了评级和分类,提高实验数据互认程度,推动抗氧化防御系统生物标志物在环境污染监测中的应用。
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  T2.74 两种皮肤刺激试验在洗手液进行安全性评价中的应用

  杨美玲;张紫虹;李文立;胡帅尔;陆彦

  2013, 27(S1): 64-65.

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  目的 本研究比较急性皮肤刺激试验、多次皮肤刺激试验对洗手液的毒性结果,探讨这两种检测方法的灵敏性和合理性。方法 采用家兔急性皮肤刺激试验、多次皮肤刺激, 对45种洗手液类产品进行有效成分分析和皮肤刺激性毒理安全性的检测及结果评价,分析两种检测方法安全性评价结果的差异。结果 45个洗手液产品,有效成分包括三氯生(2,4,4'-三氯-2'羟二苯醚)26个、对氯间二甲苯酚5个、乙醇4个、醋酸氯已定3个、有效碘1个、聚六亚甲基胍1个、其它成分5个。洗手液的急性皮肤刺激试验结果不通过数为3个,不通过率为6.7%;多次皮肤刺激试验的不通过数为28,不通过率为62.2%,卡方检验表明其两种方法差异性具有非常显著的意义(χ²=33.987,P<0.005)。结论 洗手液的使用毒性安全性评价中,多次皮肤刺激试验的检验灵敏度过高,洗手液长期使用的刺激性客观存在,多次皮肤刺激试验的检验灵敏度较急性皮肤刺激试验强。在研究消毒抑菌产品时,在追求最大限度的消毒杀菌效果之余,也要充分考虑其安全性。另一方面在安全性规范的制定中,也要考虑实际的使用和产品的不同特点,对用后即冲洗的洗手液产品,急性刺激试验能较合理反映洗手液使用后的毒性。本研究结果表明需要规范检测工作,更好的促进行业发展,保证广大消费者的安全使用。
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  T3.8 临床前药物安全性评价试验的设计及数据分析

  曾宪成;顾性初

  2013, 27(S1): 71-71.

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  在临床前药物安全性评价试验中实施药品非临床研究质量管理规范(GLP)保证了试验数据的真实性、完整性和可靠性。试验结论的科学性则取决于试验设计和对数据分析评价的质量。药物临床前安全性评价试验的设计主要体现在动物种属选择,剂量水平设置,给药周期(包括恢复期)拟定,观察指标选取(包括征状观察、体重、摄食量、临床病理、心电图、体温等),毒代研究,终末解剖等方面。在试验设计时需要尽可能多的掌握受试物已有的试验或文献资料,明确其药学、药效、药代,尤其是受试物的血浆稳定性,体外代谢特征,即eADME信息,及安全性特点;获取相同或相似品种的临床前安全性试验资料,分析这些药物的试验设计,获取它们的安全性信息。另外,需要根据受试物的特点确定是否需要一些特殊的指标,比如免疫调节药物需要增加较多的免疫功能评价指标。对于创新药或者缺少相同或相似品种临床前安全性试验资料的受试物可以开展相应的预试验帮助试验设计。伴随着试验数据的不断生成,我们需要对这些数据进行阅读和评价,在所有试验数据出来之后,还需要对这些数据进行整合和综合评价。在分析试验数据时,我们应该尝试在委托方、试验单位及药物监管机构三个角度审视我们的数据和结果。我们需要结合受试物的药效学信息,明确毒性反应和药理作用的关系,是否是药理作用的放大。另外,我们需要结合受试物的类别,评价已经出现的毒性反应是否合理,比如喹诺酮类抗生素常常出现神经系统、胃肠道、心脏、关节软骨及光毒性。最后,我们需要整合所有试验数据判定所出现的异常是否与受试物相关。
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  T3.10 Nonclinical safety assessment in oncology drug development

  LI Li

  2013, 27(S1): 72-72.

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  Cancer is the third leading cause of death worldwide, with tremendous unmet medical needs. The important/unique factors that influence cancer drug development strategy include: life-threatening nature for malignant tumors, high death rate from cancer, limited effectiveness for existing therapies, and desire to provide new effective anticancer pharmaceuticals to patients more expeditiously. For these reasons, flexibility is needed in designing a program of nonclinical (preclinical) studies for anticancer pharmaceuticals. The development and adoption by the three ICH regulatory bodies of ICH S9 provided a harmonized global agreement on the design of an appropriate program of nonclinical studies for the development of anticancer pharmaceuticals. This guidance provided recommendations for nonclinical evaluations to support the development of anticancer pharmaceuticals in clinical trials for the treatment of patients with advanced disease and limited therapeutic options. This guideline aims to facilitate and accelerate the development of anticancer pharmaceuticals and to protect patients from unnecessary adverse effects, while avoiding unnecessary use of animals. The nonclinical safety assessment program for cancer therapy as recommended by ICH S9 is different from that nonclinical safety program for general medicine [as by ICH M3(R2)]. The key differences included the following: no need for non-rodent studies for initiation of clinical trials with cytotoxic drugs; limited duration of toxicity study covers continued treatment in PhaseⅠ & Ⅱ; allowing clinical trial get to active dose as quickly as possible; no need for chronic studies (6/9 month), and 13-week toxicology studies to be conducted in late stage development to conserve resources and reduce animal use; abbreviated reproductive toxicity package (no need for fertility and peri- and postnatal studies); safety pharmacology assessments could be conducted within the general toxicology studies. The implementing of ICH S9 will enable fast first-in-patients study; protect patients from unnecessary adverse effects, while avoiding unnecessary use of animals and other resources.
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  T3.13 恒河猴皮下注射HX长期给药毒性

  赵素微;魏金锋;王爱平

  2013, 27(S1): 73-74.

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  目的 观察反复给药后出现的毒性反应及毒性反应的性质和程度,毒性反应的发展和恢复情况;确定毒性剂量效应关系;确定毒性作用的靶器官及其损害的可逆性;确定无毒反应剂量,为临床安全用药的剂量设计和临床毒副反应监测提供参考资料。方法 设HX低、中、高3个剂量组(0.05, 0.15, 0.30 mg·kg^-1)及溶媒对照组,每组8只动物,雌雄各半。皮下注射给药,每周一次,连续给药9个月。给药体积为0.3 ml·kg^-1。恢复期2个月。给药及恢复期结束时每组4只动物实施安乐死进行病理学检查。检测指标包括动物一般状况、进食量、体重、体温,眼科检查、心电图、血液生化、凝血、尿液常规、抗体、病理组织学、血糖测定等。结果 各组动物笼旁观察、心电图、眼科检查、尿液指标、骨髓涂片、脏器重量及系数未见异常。给药第16天开始至给药结束,各给药组动物进食量出现不同程度降低或出现降低趋势。给药第91和180天高剂量组WBC,给药第36天中、高剂量组RBC, HGB和HCT,中剂量组PCT,高剂量组MPV,给药第91天中、高剂量组RBC, HGB, HCT和MPV,给药第180天中剂量组WBC、HGB、HCT,给药结束中剂量组HGB和HCT,高剂量组HGB和HCT,恢复期第300天中剂量组WBC低于溶媒对照组。恢复期结束均恢复正常。其它未见异常。给药第36天中剂量组,给药第91天和恢复期结束低、中剂量组GLU值降低,给药第180和239天和末次给药后各给药组动物给药后血糖值出现不同程度的降低,可能与供试品药理作用相关。其它血清生化、电解质、免疫学指标未见有毒理学意义的改变。抗体检测结果显示,给药结束(D₂₇₁)、恢复期D₃₀₀和D₃₃₆低剂量组1只动物,给药结束中剂量组1只动物结合抗体阳性,滴度在1:1024到1:256之内。低剂量组动物在D₂₇₁,D₃₀₀和D₃₃₆时均表现出较强的中和HX的活性,分别为78.42%,91.72%和80.66%,而中剂量组动物的抗体中和活性较弱,只有10.52%。各组动物大体解剖均未发现与给药相关肉眼病变。组织病理学检查未发现与给药相关的毒性病理改变。结论 在本实验条件下,恒河猴皮下注射HX反复给药实验其未见明显毒性反应剂量为0.15 mg·kg^-1。在本实验条件下,给药剂量0.30 mg·kg^-1组动物长期皮下注射HX可能会导致白细胞的轻度降低,且可逆;给药剂量0.15和0.30 mg·kg^-1组动物长期皮下注射HX可能会导致轻微贫血,但可恢复。
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  T3.16 CMV启动子序列检测的复合实时定量PCR方法的建立

  苗玉发;李波

  2013, 27(S1): 75-75.

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  目的 建立和验证用于巨细胞病毒(CMV)启动子序列检测的复合定量PCR方法。方法 以CMV 启动子序列和小鼠管家基因β-actin的cDNA序列为模版分别设计探针和引物,用SYBR GreenⅠ熔解曲线分析两对引物扩增的特异性。对反应体系进行系统优化,并验证检测方法的灵敏度、线性和重复性、以及复合反应效率的变化。结果 针对CMV启动子序列的上游引物为5'AGACTTGGAAATCCCCGTGAGT3',下游引物为5'CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGT3',探针为5'AACCGCTATCCACGCCCATTGATG3'。针对β-actin的上游引物为5'CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC3', 下游引物为5'TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3',探针为5'TCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGC3'。引物、探针、酶和Mg²⁺浓度都优化到最佳浓度。用CMV启动子标准品制作的标准曲线,反应效率为100%,相关系数为0.9978,定量范围达到1.5×10²~1.5×10⁷ copies,反应体系灵敏度为30 copies。相比于单独PCR反应,基因治疗产品与β-actin标准品复合PCR反应后扩增效率有所降低。结论 建立了检测CMV启动子序列的复合实时定量PCR方法。
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  T3.19 路易氏剂对大鼠蓄积毒性

  吴方晖;杨廷松;阴忆烽

  2013, 27(S1): 77-77.

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  目的 为销毁日本遗弃在华的化学武器路易氏剂(L),保障人员安全,保护生态环境,制定符合我国国情的环境质量及安全标准,提供毒理学依据。方法 采用染毒剂量定期递增法,对Wistar大鼠灌胃染毒。路易氏剂,纯度97.8%,防化研究院合成。溶剂,古币牌香油,北京统益油脂有限公司出品。Wistar大鼠,体重170~220 g,购自中国医科院实验动物研究所,合格证号SCXK11-00-0006。首先测出路易氏剂对大鼠一次性灌胃染毒的半数致死剂量(LD₅₀),然后另取40只大鼠,雌雄各半,从0.1 LD₅₀开始,每天定时染毒一次,4 d为一期,每期按1.5倍递增染毒剂量,每期称量一次体重,计算百克体重饲料消耗量,测出累积染毒半数死亡剂量,用K=LD₅₀(累积)/LD₅₀,求出蓄积系数K,获得蓄积强度,对实验过程中死亡的大鼠及时进行尸检。实验结束后,,处死部分大鼠,剩下待15 d恢复期后处死,进行病理解剖。按常规方法制片,HE染色,显微镜下观察组织病理学变化。同时取40只大鼠给予等量溶剂作平行对照。结果 路易氏剂对大鼠一次性灌胃染毒主要中毒症状有:进食量逐渐减少、流涎、流泪、松毛,严重时出现震颤、大小便失禁、瘫痪等,一般染毒24 h内死亡,其半数致死剂量为11.5(10.4~12.6)mg·kg^-1。路易氏剂对大鼠蓄积毒性实验累积染毒5期20 d,累积染毒剂量为60.26 mg·kg^-1,累积死亡率27.5%,蓄积系数 >5.24,属于轻度蓄积物质。累积染毒过程中,大鼠体重增长缓慢,与对照组比较,有显著差异。大鼠染毒4 d后,百克体重饲料消耗量开始下降,从第4天开始,百克体重饲料消耗由38 g下降到25 g,下降了34.2%,停止染毒后,百克体重饲料消耗量逐渐恢复正常水平。对实验过程中死亡大鼠尸检发现,胃内有少量残余食物或无食物,胃黏膜出血、溃烂,肠黏连和肠胀气,膀胱内尿液发黄、积储,肝呈深紫色。经制片镜检显示,喉部粘膜轻度水肿,食道黏膜下固有层轻度水肿,胃粘膜充血、糜烂性胃炎,肝小叶核浓染肝细胞散布,肾曲管核浓染上皮细胞散布,肺叶、支气管间质性肺炎,膀胱内有血性浆液,该损害在停止染毒后的短时间内难以恢复。结论 路易氏剂对大白鼠一次性灌胃染毒的LD₅₀为11.5(10.4~12.6)mg·kg^-1。属于高毒性化学物质,具有轻度蓄积作用,累积染毒8~20 d,大鼠百克体质量饲料消耗量减少,体重下降显著。路易氏剂对大鼠累积染毒损害的器官有喉、食道、胃、肝、肾、膀胱等,或因反流作用引起气管和肺的损伤。
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  T16.15 水胺硫磷在大鼠和人肝微粒体中的代谢增毒和减毒

  庄笑梅;魏霞;萧伟斌;李桦

  2013, 27(S1): 296-296.

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  目的 研究在大鼠和人肝微粒体体系中研究水胺硫磷(ICP)在动物和人肝的代谢途径,以及与毒性的相关性,比较种属差异。方法 应用液质联用技术在大鼠(RLM)和人肝微粒体(HLM)孵育体系中,鉴定ICP主要代谢产物,研究酶促动力学特征;应用重组CYP酶研究ICP的代谢酶表型;应用乙酰胆碱酯酶抑制法评价ICP及其代谢产物的毒性。结果 ICP与RLM和HLM孵育后,检测到氧化脱硫产物ICPO和羧酸酯酶水解产物,氧化反应的代谢酶表型为CYP1A2, 3A4, 2B6和2C19。ICP和ICPO对乙酰胆碱酯酶的IC₅₀分别为192 μmol·L^-1和31 nmol·L^-1,提示ICPO的毒性明显增加。ICPO在RLM和HLM中的生成速率分别为0.011和0.46 nmol·min^-1·mg^-1蛋白。ICP在RLM中的氧化脱硫是双相反应,K_m,app1和K_m,app2分别为1.12和67.92 μmol·L^-1。ICP在HLM中氧化脱硫反应明显慢于大鼠,K_m,app为32 μmol·L^-1;ICP在HLM中更容易代谢为非毒性的羧酸酯酶水解产物。结论 ICP在大鼠和人肝微粒体中的代谢清除存在显著的种属差异,ICP在HLM中的主要代谢途径是羧酸酯酶水解反应,以解毒为主;在RLM中以氧化脱硫生成ICPO为主,是增毒反应。预测ICP对人体的安全风险可能低于大鼠。
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  T17.9 组合式多浓度动物口鼻吸入暴露系统在吸入毒理学研究中的应用

  鹿建春;郑劲林;刘玉杰;张俊杰;郝勇斐

  2013, 27(S1): 304-304.

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  目的 研制一种可任意组合、同时进行多个浓度梯度暴露的动物口鼻吸入动态暴露系统,提高气溶胶吸入暴露实验的精确度、稳定性和安全性。方法 ① 系统研制:利用空气动力学原理和独有的正交稀释技术,通过加入稀释空气,实现上层气溶胶与稀释空气快速、均匀混合,改变各层动物吸入气溶胶的浓度。每层为一个独立的动物暴露单元,可根据实验需要改变组合的层数和层间气溶胶浓度。气溶胶发生、采样、稀释、浓度监控、暴露室压力等全部采用计算机集中控制,实现参数设置、过程控制和记录存储的自动化、智能化。② 性能测试:分别采用自行研制的旋转刷式粉尘气溶胶发生器发生粒径分布2.5~3.5 μm的粉尘,采用自行研制的液体气溶胶发生器发生5%的NaCl溶液。调节不同的气溶胶发生流量、载气流量、稀释气体流量和总抽气流量,使暴露装置各层之间达到要求的稀释浓度,并使暴露室内维持稳定的负压。采用CEL-712 Microdust Pro实时粉尘监测仪对各层每个动物吸入口的气溶胶浓度进行测试,根据测试结果计算各层气溶胶浓度混合的均匀性。结果 测试过程使用三层组合的气溶胶暴露装置,粉尘气溶胶每层各个动物吸入口的气溶胶平均浓度分别为:4937.4 mg·m^-3(一层)、989.7 mg·m^-3(二层)194.5 mg·m^-3(三层);每层各吸入口的浓度误差分别小于5.11%, 6.54%和5.37%。5%NaCl溶液气溶胶每层各个动物吸入口的气溶胶平均浓度分别为:4787.7 mg·m^-3(一层)、1013.3 mg·m^-3(二层)、148.3 mg·m^-3(三层);每层各吸入口的浓度误差分别小于2.76%, 6.13%和8.24%。结论 本系统采用同一个气溶胶源,通过独特的稀释技术,使各层动物吸入口获得粒谱分布相同、浓度混合均匀的气溶胶,消除了多次发生气溶胶的误差,结果一致可靠,并可节省试验材料、提高工作效率和工作人员的安全性。通过更换不同的动物暴露筒,可自动完成小鼠、大鼠、豚鼠啮齿动物口鼻暴露单一或多种浓度气溶胶动态吸入暴露实验,广泛适用于对各种液态、固态、气态实验材料的吸入毒理学研究和暴露评价。
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  T17.11 危险度评定中AOP的概念以及关于其中文译名的思考

  彭双清

  2013, 27(S1): 305-305.

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  随着科学技术的发展,新化学物质日益增多。传统的危险度评定模式无法满足大量化合物及环境污染物对人类健康危害评价的需求。为了迎接确保健康与安全的挑战,传统的危险度评定方法与模式正经历着前所未有的变革。2007年美国国家研究委员会(NRC)发布了"21世纪毒性测试:远景与策略"(简称TT21C)的报告,该报告阐述了毒性测试策略变革的必要性、可行性及其发展前景。该策略强调需要建立发展最大限度地应用已有知识的评价方法、有效靶向寻找关键的新知识,减少依赖于高资源强度的测试手段。为了实现新的人类危险度评定模式,要求构建一个新的工作框架,在此框架下整合从生物不同结构层次所获得的数据与知识,以有利于风险评估人员开展危险度评定。基于此,近年提出了AOP(adverse outcome pathway)这样一个概念工作框架(Ankley, 2010),鉴于目前我国尚无对应的中文名词术语,在此我们将其翻译为"有害结局路径"。AOP的概念,它是一个概念框架,用以描述已有的关于一个直接的分子起始事件(molecular initiating event,MIE)(如:外源化合物与特定生物大分子的相互作用)与在生物不同组织结构层次(如:细胞、器官、机体、群体)所出现的与危险度评定相关的"有害结局"之间的相互联系。AOP是跨越多种生物结构层次的一系列连续事件。连接起始事件与结局之间的内容可以有不同的构成,主要取决于产生AOP或所关注危险度内容的类型以及生物学信息的范围。生物不同组织结构层次之间的关系可以是基于原因的、机制的、推理的或具有相关性的,其相关信息可来源于体外、体内、或计算机系统。一个AOP框架始于化合物与生物靶标相互作用的MIE,由此导致一系列的更高效应水平的事件,从而导致具有与特定危险度内容(如:生存、发育、生殖等)相关联的"有害结局",其中前三个元素(分子特性、与生物大分子相互作用、细胞反应)就是NRC所定义的"毒性通路"(toxicity pathway)。AOP为有机整合已有知识提供了一个有用的框架,从而可以确定关键的不确定性以及要优先研究的内容,从而提高管理毒理学中的预测手段。AOP的概念有别于"毒性通路",毒性通路关注的是分子起始事件,是细胞水平可测量的关键机制终点,而不是效应本身。AOP代表的是各种分子起始事件导致与危险度评定相关的"有害结局"的相互联系,它包含了毒性通路的内容,同时又延生了毒性通路的范围。AOP概念的形成也是由于"作用机制"和"作用模式"使用领域所出现的不确定性,作用机制常常描述的是由分子起始事件导致有害结局过程中生物学反应的某一个环节,而作用模式 (mode of action)通常关注的是分子起始事件或有害结局,很少关注两者。AOP关注的是由分子起始事件到与危险度评定相关的有害结局,它包含了作用机制与作用模式的功能。综上所述,针对AOP的概念内涵,我们将其译为"有害结局路径",一是强调由分子起始事件产生毒作用所导致的结局,这种有害结局与危险度评定相对应,二是有别于"毒性通路",虽然英文中二者同为"pathway", 但此处译为"路径",包含了从起点到终点,即分子起始事件到有害结局的全部过程。
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  T17.13 皮肤致敏替代方法及化妆品安全评估

  邢泰然;宋健

  2013, 27(S1): 306-307.

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  基于化妆品的使用特点,皮肤致敏在化妆品的安全评估中,是非常关键的毒理学终端之一。也是各国法规要求和监管中,最严格的控制之一。 皮肤致敏是一种由皮肤接触致敏物导致的超敏反应。超敏反应有四个类型,其中和化学物质经皮接触较为相关的是四型超敏反应,由于通常在接触后24~72 h之间出现炎症反应,故又称为迟发型超敏反应。在1981年,世界经济合作和发展组(OECD)已经批准了皮肤致敏的动物学实验方法OECD试验指南406,并于1991年基于动物福利对其进行了修改。在这个试验指南中,主要介绍了两种动物试验方法,豚鼠局部封闭涂皮试验(Buehler test)和豚鼠最大值试验(GPMT test)。在2002年,OECD又通过了第二个关于皮肤致敏的试验指南429,小鼠局部淋巴分析试验(LLNA),并在2010年正式承认其作为替代方法可以替代豚鼠试验。和豚鼠试验相比,LLNA试验的优势非常明显,其减少了试验动物,改良并优化了试验方法,并且可以定量的评估皮肤致敏的阈值。随着科技的发展和对动物福利的考虑,动物替代试验方法也有快速的发展。首先是根据皮肤致敏的机制而设计的离体试验,包括直接肽反应试验(DPRA), KeratinoSens分析实验,人体细胞株激活试验(h-CLAT)以及骨髓U937皮肤致敏试验(MUSST)等。欧莱雅公司自上世纪90年代末就开始着手于皮肤致敏离体替代方法的研究,其中骨髓U937皮肤致敏试验就是由欧莱雅公司主要参与研发和设计的。虽然离体试验方法目前还在OECD的验证中,但通过多种离体试验的组合(ITS),在一定程度上可以鉴别出皮肤致敏性。其次是计算机模拟,也即定性/定量的构效关系(QSAR),现在已经有较为充分的数据库以及软件模拟方法支持对毒理学端点的计算机模拟,比如DEREK和OECD QSAR TOOL BOX。但目前还不能替代生物试验。在化妆品的安全评估中,可通过不同水平的毒理学试验来识别化学物质的皮肤致敏性,并得到无致敏诱发阈值(NESIL),由于各种类的化妆品都有比较明确的使用方法,故可以统计出暴露值。在进行皮肤致敏的风险管理时,我们比较暴露值和无致敏诱发阈值,并乘以相关的安全系数,来控制我们产品的安全性。
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  T17.15 危险废液急性毒性快速筛查评估体系

  高珊;李国君;马玲;敬海明;谭壮生;李煜;张鹏;郑珊;童英

  2013, 27(S1): 307-307.

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  目的 研究以急性毒性评价为基点,用啮齿类实验动物、细胞、线虫3种模式同步进行毒性研究,摸索了危险废液毒性初筛方法及评价标准。方法 研究对18件某蔗糖生产线不同工段所产生的有机残液进行毒性评估,动物实验进行了小鼠经口毒性LD₅₀、小鼠急性吸入毒性LC₅₀、大鼠急性经皮毒性LD₅₀。结果 按照国家标准判定,18件样品都不属于危险废物;18件样品的线虫半数致死剂量(24 h LC₅₀)为253.1~869.6 g·L^-1;18件样品的中性红细胞毒性半数致死剂量(24 h LC₅₀)为19.87~75.93 g·L^-1;但目前没有相关的细胞毒性、线虫毒性标准来判定研究对象是否为危险废液,在研究中,我们尝试以同步设定阴性对照、阳性对照的方法来进行结果的初步判定,细胞及线虫毒性判定标准的确立还需进一步研究与反复论证。结论 研究除了用传统的动物实验进行毒性评价外,把细胞毒性评价、线虫毒性评价方法作为危险废液毒性筛检的必要补充。它为建立危险废液快速、廉价、实用的多模式毒性评估体系提供科学依据。较传统的动物试验,细胞、线虫毒性的研究所需的成本低、实验周期快,在24 h内就能得到结果,是快速、廉价、实用的毒性评估体系。
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  T17.36 利用干细胞建立发育神经毒性筛选试验

  黄健聪;秦瑶;谈伟君;程树军

  2013, 27(S1): 320-320.

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  目的 现行化学物发育神经实验的标准有美国环保署(EPA)颁布的OPPTS 870.6300及国际经合组织(OCED)颁布的TG426,这些实验均采用活体哺乳动物进行研究,费用高、耗时长,且难以满足当前新化合物神经发育毒性检测需求。由于多能干细胞(PSC)拥有独特的自我更新及定向分化能力,可分化为不同类型的神经细胞,适用于神经发育毒性(DNT)的研究。已验证的发育毒性试验小鼠胚胎干细胞试验(EST)试验并不完全满足DNT筛选要求。因此需建立基于干细胞的DNT筛选试验。方法 选择小鼠胚胎干细胞系,体外培养扩增,以成体神经干细胞(如大鼠神经干细胞、海马干细胞)和神经细胞为对照。体外诱导PSC向神经细胞方向分化,从可用的诱导方法(如"4-/4+法"、"五步法"、单层细胞分化法、默认模式介导方式、基质细胞诱导法和遗传工程介导法等)中,本研究选择基质细胞诱导法。经神经元特异性标志物或电生理鉴定后,疑似神经发育毒性化合物暴露,选择阳性对照(甲基汞、镉、纳曲酮等)和阴性对照(青霉素G)。选择的检测终点包含一个或多个神经发育的关键事件,如细胞增殖和凋亡、胚胎干细胞分化、神经细胞迁移、轴突树突生长和突触发生、神经胶质细胞分化和髓鞘形成、神经递质合成与功能等。综合应用分子、基因、蛋白、形态、功能等检测技术,观察和分析神经细胞的变化。结果 基于细胞的测试系统优点在于高通量、敏感度高。本研究建立的胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞的方法,以及由此建立的发育神经毒性研究,可用于神经发育毒性物质的检测。而且针对神经发育的不同时期,不同暴露时间,对特定毒性效应进行研究,通过多个检测终点的调整,可以满足化合物不同作用机制的研究。干细胞的三维培养可提供更接近与体内的环境,克服成体永生细胞系(如PC12、神经瘤细胞)等细胞类型的不足。结论 采用干细胞诱导神经分化建立高通量神经发育毒物筛选方法有效可行,一方面可以满足对大量化学物快速筛选的要求,为安全性评价提供更多资料,另一方面符合3R原则和基于毒性通路的现代毒理学发展趋势。
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  T18.1 三氯乙烯肝细胞毒性机制及生物标志物

  刘建军;任晓虎;黄培武;洪文旭;杨细飞;黄海燕

  2013, 27(S1): 334-334.

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  目的 探讨三氯乙烯(TCE)的肝细胞毒性机制,以及筛选TCE相关的生物标志物。方法 运用2DE联合MALDI-TOF-TOF/MS鉴定差异蛋白,选择差异蛋白SET,联合使用Pull-Down串联亲和层析、液相色谱-串联质谱及Co-IP等,分离、鉴定并验证与SET相互作用的蛋白质。并运用血清蛋白质组学技术鉴定TCE致肝细胞损伤相关蛋白和TCE药疹样皮炎患者血清生物标志物。结果 发现TCE可诱导L-02肝细胞SET蛋白表达上调和TCE诱导肝细胞具有低剂量适应性反应效应。为此,利用慢病毒介导的RNA干扰技术成功得到稳定干扰SET的肝细胞。随后,以正常肝细胞与SET缺陷肝细胞为受试细胞,探讨了SET改变与TCE刺激后细胞增殖、细胞凋亡、PP2A活性及胱天蛋白酶3活性等指标之间的相互关系,结果显示,慢病毒介导的SET的下调显著性降低了TCE在肝细胞中诱导的细胞毒性。丝切蛋白1, peroxiredoxin-2和S100-A11可能在不同程度参与TCE毒作用下SET介导的肝细胞凋亡。同时,鉴定了62个与SET可能有相互作用的侯选蛋白,其中45个存在GO共注释;并验证了SET与eEF1A1/eEF1A2的相互作用以及TCE可改变其相互作用和亚细胞分布。鉴定了6个与TCE致肝损伤相关的抗原蛋白,并验证了NM23可作为TCE引起的自身免疫性疾病的潜在生物标志物。通过比较职业性三氯乙烯药疹样皮炎患者、三氯乙烯职业接触者和健康人群各自的血清肽谱,使用ClinProTools软件建立血清肽诊断模型。验证实验证明了诊断模型的高灵敏度和高特异性,并发现蛋白ABCA12和PRSS1在患者血清中出现明显的下调。结论 SET及其相关蛋白均可通过不同途径参与L-02细胞凋亡或增殖的进程,筛选了TCE毒性相关的可应用于诊断、治疗及预后监测的潜在生物标志物。
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  T18.3 膜蛋白质组学在毒理学研究中的应用

  黄爱博;洪文旭;许华;刘建军

  2013, 27(S1): 335-335.

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  膜蛋白是细胞膜的重要组成部分,执行着细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号转导和调控,以及能量传递等重要功能。随着蛋白质组学技术的发展,膜蛋白质组学成为毒理蛋白质组学研究的重要组成部分,为在膜蛋白水平阐明毒理机制和建立毒理评估模型提供了新的途径。本文综述了近年来膜蛋白质组学的技术进展以及其在一些毒理学研究中的应用。
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  Applying TT21C to DNA damage：the p53 network, modelling and IVIVE

  Rebecca CLEWELL

  2013, 27(S1): 409-409.

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  The National Academies of Sciences 2007 report, "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and A Strategy" envisions toxicity testing using human cells in vitro to evaluate perturbations of cellular response networks and coupling results from these assays with computational systems biology and in vitro-in vivo extrapolations (IVIVE) to complete human safety assessments. To support this transition in toxicity testing, our laboratory is evaluating key cell response networks to develop proof of concept safety assessments for a series of prototype compounds and networks, including the DNA damage response pathway. The DNA damage toxicity pathway project studies the p53-mediated DNA damage stress response in human cells to determine the underlying response circuitry for the p53 pathway and the dose response behavior for pathway activation after chemical induced DNA damage. This research effort has three overarching goals: (1) map the key determinants of cellular fate following DNA damage induced by chemicals with different mechanisms of action (indirect vs. direct DNA-damage), (2) identify dose-dependent thresholds associated with cellular adaptation and toxicity (mutation) and (3) perform a risk assessment for a prototype chemical based on predicted regions of safety determined from in vitro data. Initial work involved validation of the cell model and collection of a dense data stream comprised of dose response data at the gene, protein (p53, p-p53, p-H2AX, MDM2, p21, WIP1), and cellular (cell cycle arrest, apoptosis, micronucleus;MN) level using prototype chemicals for DNA damage: etoposide (topoisomeraseⅡ inhibition), methylmethane sulfonate (DNA alkylation) and quercetin (oxidative damage). 18 point dose-response curves were generated for protein and cell fate endpoints in a p53 competent cell line (HT1080) using flow cytometry and high content imaging. Whole genome transcriptomic analysis was also performed for each prototype chemical at several doses ranging from concentrations with no effect, minimal effect, or maximal effect on protein and micronucleus response. In concert with the data acquisition and pathway inference, a computational systems biology pathway (CSBP) model is being developed to describe p53 response networks that control biological functions in order to calculate dose response behaviors. The goal of the CSBP model is to predict the dose at which the increased level of damage triggers DNA-damage response. Biokinetic models will be then be used to facilitate in vitro-in vivo extrapolation and the determination of safe levels of human exposure from in vitro and CSBP results. This work demonstrates an approach to integrating data acquisition and model building in order to provide an‘in vitro only’risk assessment for prototype genotoxic chemicals as a an initial step in implementing the recommendations of the NAS Toxicity Testing report with the DNA-damage stress network.
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  Early attrition strategies：An integrated in vitro strategy for assessment of clinical hepatotoxicity hazard

  Lee GEIGER

  2013, 27(S1): 418-418.

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  Terminating drug candidates gets increasingly expensive as the candidate molecule moves through clinical development. The efficiency of the drug development process would be improved if candidates that will ultimately fail for safety reasons could be reliably detected earlier in development. Regulatory nonclinical safety assessment is primarily observational in nature. In 2007 the US National Academy of Sciences published "Toxicity Testing in the 21st Century: A vision and a strategy" which suggests that using new tools based on the use of human cells and cell components could significantly improve our ability to understand the hazards and risks posed by chemicals. Drug-Induced Liver Injury (DILI) is a key development issue for pharmaceutical drug candidates and has resulted in the termination of drug development programs during clinical safety and efficacy testing as well as withdrawal of approved drugs from the marketplace. There are a number of potential mechanisms by which DILI could be induced, but bioactivation is widely considered to be an initiating event. This can be assessed in vitro using human enzymes and cells, and this presentation will consider the following approaches to assessing bioactivation liability in the preclinical phase: glutathione adduct formation, CYP metabolism dependent inhibition, cell health, covalent binding and liver gene expression. The impact of clinical dose will also be addressed and outcomes from these preclinical datasets will be correlated with DILI for a set of marketed drugs and GSK compounds. GSK's strategy for using these data to reduce the risk of hepatotoxic liability for drug candidates will be discussed.
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  T3.74 药物致线粒体毒性的评价方法及其应用研究

  郭家彬;袁海涛;张廷芬;侯明月;赵君;彭双清

  2013, 27(S1): 107-107.

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  线粒体是细胞能量代谢的主要场所,同时也是细胞内活性氧自由基(ROS)的主要来源之一。线粒体损伤是许多药物毒性作用的重要靶标,线粒体毒性已经成为多种药物研发失败或临床应用受限的重要因素。已有多个候选药物因存在严重的线粒体毒性而被迫中止研发。一些因安全性问题而受到FDA提出"黑框"警告甚至要求撤市的已上市药物,也发现具有明显的线粒体毒性。另外,还有些药物因存在线粒体毒性风险而被要求进行上市后再评价。因此,一些国际大型制药公司以及药物研发机构纷纷将线粒体毒性评价作为候选药物临床前安全性评价的重要内容。针对药物致靶器官线粒体损伤的特点及可能机制,可以从以下几个方面开展药物致线粒体毒性的评价:① 在药物发现阶段早期开展高通量的线粒体毒性筛选,特别是基于多条毒性损伤机制的靶向筛选,可能涉及一些特殊体外细胞模型、高通量筛选和计算毒理学等技术和方法的应用;② 在药物发现阶段或临床前试验过程中开展基于特殊动物模型的线粒体毒性研究;3 药物在人体中致靶器官线粒体毒性的预测研究,包括体外试验及动物试验结果的外推及有关数学和/或生物学模型等。过氧化物增殖体激活受体γ共激活因子(PGC 1a)和转录因子NR-E2相关因子2和(Nrf2)分别是调控线粒体生成和线粒体氧化应激的重要调控因子。近年来,本实验室分别应用人源心肌细胞系和肝细胞系,综合采用高内涵筛选、基因沉默和过表达等技术,重点从药物致线粒体损伤的机制角度,研究了多柔比星和对乙酰氨基酚等药物对PGC 1a和Nrf2信号通路的扰动作用及其与线粒体毒性之间的相关性;同时应用抗氧化防御蛋白MT敲除小鼠观察了多柔比星等药物的靶器官线粒体毒性特征,旨在药物发现和临床前研究阶段建立快速、敏感的线粒体毒性评价方法。在药物发现和临床前研究阶段,选择合适的线粒体毒性评价方法对药物进行线粒体评价,及早发现候选药物可能存在的线粒体毒性风险,对于创新药物研发决策与利弊权衡、提高研发成功率具有十分重要的意义。
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  T3.77 大鼠经口灌服肠炎宁片6个月多次给药毒性

  刘翰墨;黄江;曾贵荣;马丽;姜德建

  2013, 27(S1): 108-109.

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  目的 观察经口灌服肠炎宁片对大鼠毒性反应和死亡情况,为临床的安全用药提供参考资料。方法 SD大鼠分为阴性对照组、肠炎宁片低剂量组(14.8 g生药/kg)、肠炎宁片中剂量组(29.5 g生药/kg)、肠炎宁片高剂量组(59.0 g生药/kg),3个剂量组,分别约相当于人用剂量的15.6, 31.3和62.5倍,将供试品配成所需浓度的溶液,按10 ml·kg^-1体积灌胃给药,每天1次,连续给药6个月(26周),并设4周恢复期。分别于给药中期、给药末期及恢复期随机解剖40只大鼠,检查项目包括:一般临床观察、体重、摄食、摄水量、血液学、血浆生化和病理学检查等。结果 大鼠经口灌服肠炎宁片6个月(26周),并经恢复期1个月后,肠炎宁片对大鼠的外观体征,行为活动,分泌物、粪便性状均无明显影响,未出现药物引起的动物死亡,动物的一般状况正常。各组动物体重组间比较没有显著性差异;各组动物摄氏量、摄水量组间比较没有显著性差异。 血液学检查各剂量组动物个别指标与同期对照组相比出现有统计学意义的改变,但都是正常范围内的波动。给药期大鼠血液生化未发现明显异常。肉眼未发现可疑病变组织;脏器系数未出现明显异常;病例检查未出现明显异常。结论 SD大鼠经口灌服肠炎宁片6个月的安全剂量为59.0 g生药/kg(相当于人临床剂量的62.5倍)。
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  T3.80 何首乌含药血清对体外培养的肝脏细胞活力的影响

  杨红莉;孙震晓

  2013, 27(S1): 110-110.

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  目的 探讨何首乌含药血清对人正常肝L02细胞和肝癌HepG2细胞活力的影响,明确何首乌对两种肝来源细胞是否具有细胞毒作用。方法 SD雄性大鼠灌胃给予何首乌生药24 g·kg^-1·d^-1,连续4 d,末次灌胃后1~2 h,腹主动脉取血,制备血清。将10%, 20%和30%血清作用于L02和HepG2细胞24, 48和72 h,观察空白血清对实验体系的影响。MTT法检测不同时相不同浓度含药血清及空白血清对两种细胞活力的影响,倒置相差显微镜下观察含药血清及空白血清作用于两种细胞后细胞的形态变化。同时测定含药血清作用于两种细胞48 h后,细胞培养液ALT、AST活性。结果 MTT结果显示,与空白对照血清相比,不同浓度含药血清对人正常肝L02细胞具有一定促增殖作用(增殖率均小于20%),但促增殖作用不具有时间、剂量依赖性,30%含药血清作用于L02细胞48 h后,与30%空白血清相比,增殖率为15.1%;倒置相差显微镜观察L02细胞形态,含药血清组与空白血清对照组、正常10%胎牛血清组相比,细胞数量及形态均没有明显变化。不同浓度含药血清作用于肝癌细胞HepG2后,对细胞具有一定抑制作用(抑制率均小于20%),抑制作用不具有时间、剂量依赖性;倒置显微镜下观察,各组细胞形态没有明显差异。药物作用于L02和HepG2细胞48 h时,测定各组细胞培养液中AST和ALT活性变化,结果表明,各浓度含药血清组与空白血清组相比,ALT和AST的活性没有显著性差异。结论 何首乌含药血清对两种肝脏来源细胞不具有明显的细胞毒作用,该结果与本研究组动物实验结果相吻合。
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  T3.83 家兔注射CJ006血管及肌肉刺激性

  杨春燕;王莹;张晶璇;魏金峰;王爱平;

  2013, 27(S1): 111-112.

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  目的 观察家兔静脉及肌内注射CJ006后对血管和肌肉是否存在刺激性,并与已上市CJ006进行比较,为该药的临床使用提供相关资料。方法 雄性日本大耳白兔12只,分别采用耳缘静脉注射法和肌内注射法。其中6只家兔左侧给予CJ006上市品,右侧给予0.9%氯化钠注射液;另外6只家兔左侧给予CJ006,右侧给予0.9%氯化钠注射液。每日给药1次,共给药2次。末次给药后48 h每组各处死3只动物,分别取注射部位组织,进行病理组织学检查。余下动物继续观察14d后取注射局部组织进行病理检查。根据肉眼观察及病理检查结果进行最终评价。结果 整个实验期间,各组动物饮一般观察情况未见异常。家兔CJ006上市品对照侧1只动物于首次给药后当天左侧兔耳耳缘静脉局部可见轻微淤血,症状持续2 d,其余5只家兔均未见刺激反应症状。家兔CJ006给药侧1只动物于给药第2天左侧兔耳注射部位及注射局部组织出现轻度充血,,该症状持续1天后逐渐恢复;其余5只家兔CJ006均未见刺激反应症状。各组实验动物股四头肌注射部位均未见任何刺激反应症状。给药结束时,部分动物0.9%氯化钠注射液对照侧兔耳B段耳缘静脉血管壁局部坏死,B和C段耳缘静脉血管旁组织轻微坏死、出血。CJ006上市品对照侧及CJ006侧兔耳耳缘静脉注射血管的病理改变主要表现为B和C段耳缘静脉血管壁的局部坏死,未坏死血管壁内皮细胞缺失,及周围组织的轻微水肿、出血、坏死等。恢复期结束时,3只CJ006上市品对照侧兔耳耳缘静脉注射血管均可见明显的血管壁增厚,管腔不规则或伴管腔变小;2只CJ006给药侧兔耳耳缘静脉注射血管及周围组织均未见明显异常,整个实验期间,对照组及给药组动物股四头肌均未见明显异常。结论 在本实验室条件下,家兔经耳缘静脉血管注射CJ006,对注射血管有轻度刺激性作用,主要表现为血管内皮细胞脱落缺失,停药14 d后可恢复正常;家兔经肌肉注射CJ006,对注射部位肌肉组织无刺激性作用。
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  T3.86 食蟹猴皮下注射重组人血小板生成素拟肽-Fc融合蛋白13周对外周血CD4⁺,CD8⁺ T淋巴细胞的影响

  周莹;赵一璐

  2013, 27(S1): 113-113.

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  目的 观察食蟹猴皮下注射重组人血小板生成素拟肽-Fc融合蛋白13周,研究外周血中CD4⁺,CD8⁺ T淋巴细胞数量的变化。方法 将26只食蟹猴分为高、中、低剂量组及辅料对照组,注射重组人血小板生成素拟肽-Fc融合蛋白,给药频度为1次/周,给药时程为13周,恢复期为4周;给药前(d 0)、给药后(d 42)、停药后1周(d 91)及恢复期结束(d 112)各采集动物全血不少于1 ml,EDTA抗凝;应用流式细胞仪进行分析:将全血样品进行处理,取50 μl全血,在绝对计数管底部加入APC标记的鼠抗猴CD8和PE标记的鼠抗猴CD4和FITC标记的鼠抗猴CD3及PerCP标记的鼠抗猴CD45,温和震荡,室温避光放置15 min后加入450 μl 10倍稀释后的溶血素,温和震荡,室温避光放置15 min后即可上机检测;统计4次检测的实验数据,分析不同给药期对外周血CD4⁺,CD8⁺ T淋巴细胞数量的影响。结果 经流式细胞仪分析,比较给药前(d 0)、给药后(d 42)、停药后1周(d 91)及恢复期结束(d 112)食蟹猴全血中CD4⁺,CD8⁺ T淋巴细胞数量,发现不同给药期CD4⁺,CD8⁺ T淋巴细胞绝对计数发生了变化,而CD4⁺,CD8⁺ T淋巴细胞亚群比例并未发生明显性变化。结论 食蟹猴皮下注射重组人血小板生成素拟肽-Fc融合蛋白13周,对外周血中CD4⁺,CD8⁺ T淋巴细胞亚群比例无明显性影响。
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  T3.89 多氯联苯代谢物引起细胞损伤的信号转导和蛋白表达

  李玲瑞;董慧;胡丽华;宋尔群;宋杨

  2013, 27(S1): 114-115.

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  多氯联苯(PCB)是人工合成的化合物,因其具有良好的化学稳定性、绝缘性、热稳定性、阻燃性、导热性,在20世纪30年代大量生产并被广泛应用。但PCB同时具备难降解性、生物毒性、生物蓄积性、远距离迁移性的特征,是典型的持久性有机污染物之一,造成了全球性的空气、水和土壤环境的污染问题,并对人类的健康构成持续性威胁。近年来,关于PCB及其代谢产物的毒性作用研究取得了充分进展,发现在低剂量长期暴露或短期大剂量暴露于PCB及其代谢物条件下,能够给生物体造成严重的危害,包括生殖毒性、免疫毒性、神经毒性、皮肤毒性、甚至致癌性。最近一些研究表明,PCB的代谢产物能够引起机体的氧化应激反应,造成不同程度的氧化损伤。PCB对细胞增殖的抑制作用,提示我们细胞凋亡可能在其毒性中起到了重要作用。细胞凋亡是一种主动过程,是细胞对环境的生理性病理性刺激信号,环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。细胞凋亡的调控是复杂而精密的,主要包括三种信号转导途径:死亡受体途径、线粒体依赖途径和内质网途径。我们认为线粒体途径可能在PCB醌类代谢物诱导细胞凋亡中起到了主要作用。但PCB代谢物是如何导致线粒体功能失调以及哪些上游信号参与了线粒体途径尚未明确,同时,在其诱导细胞凋亡过程中是否引起细胞周期的变化,二者之间的联系仍有待研究。综上所述,本课题以体外培养人肝癌HepG2细胞为研究对象,验证多氯联苯醌能否诱导HepG2发生凋亡。在此基础上,根据目前已知的细胞凋亡机理模式,逐步推测线粒体依赖凋亡途径中,上、下游可能参与涉及到的一些凋亡调控蛋白,并用系列实验验证,最终构建出一条必经完整的多氯联苯醌诱导凋亡的线粒体依赖信号转导途径。同时对多氯联苯醌引起细胞周期的变化进行检测,以期对凋亡机制有更深入的了解。通过本论文的研究,可以进一步完善PCB对细胞毒性作用机制,为深入阐明多氯联苯醌诱导细胞凋亡的分子机制提供重要的理论依据,进而为PCB造成疾病的治疗和预防提供新的思路。
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  T3.91 聚脱氧寡核苷酸生化药去纤苷用药安全性评价

  惠长野;张文;杨学琴;李丽梅;陈钰婷

  2013, 27(S1): 116-116.

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  去纤苷(Defibrotide, DF)是意大利Gentium SpA公司开发的多组分生化药,是由猪小肠黏膜基因组DNA,通过控制解聚制得的分子量在15~30 ku的单链脱氧寡核苷酸钠盐的混合物,临床上用于治疗多发性骨髓瘤及由化疗和干细胞移植引发的肝小静脉闭塞症。DF毒理学资料对新兴的核酸类药物安全评价具有很高的借鉴价值。DF可以通过静脉注射及口服两种方式给药,静脉注射可以迅速达到最大血药浓度C_max,口服30 min后可达到C_max。鉴于消化道DNase水解失活、小肠吸收效率及肝脏首过效应等因素,DF口服生物利用度只有58%~70%DF。急性毒性实验已在小鼠、大鼠、家兔和狗中开展,口服给药剂量高达3600~5000, 300~570 mg·kg^-1 iv,600~2280 mg·kg^-1 ip,实验动物均无毒性反应发生。慢性毒性实验结果表明:大鼠口服给药 3500 mg·kg^-1·d^-1,持续用药8周;口服给药 2000 mg·kg^-1·d^-1,用药52周;400 mg·kg^-1 iv 4周;150 mg·kg^-1 ip 26周;80 mg·kg^-1 im 13周;20 mg·kg^-1 im 26周;均无毒性反应发生。家兔40 mg·kg^-1 iv 14周;900 mg·kg^-1 iv 2.5周;Beagle犬口服3600 mg·kg^-1 4周;口服2000 mg·kg^-1 52周;150 mg·kg^-1 iv 26周;20 mg·kg^-1 im 52周,也无毒性反应发生。两代繁殖毒性、致畸实验证实其对大鼠、家兔无生殖毒性。DF被证实无免疫毒性,受试动物无过敏性反应发生,且不影响其细胞免疫应答。哺乳动物细胞染色体畸变、基因突变实验结果表明DF无致突变风险,而且可以拮抗某些化学致癌剂(二甲基苯并蒽、道诺霉素、苯并[a]芘)的诱变活性。已证实DNA疫苗不会在体内广泛分布和长期滞留, 同样DF注射给药的半衰期仅为10~30 min,而口服给药DF的清除需要数小时,主要通过尿液及粪便排出体外。多项临床试验已证实患者对DF口服给药具有很好的耐受性,过敏性或类变态反应如出汗、心动过速、红疹、瘙痒等发生率为1.9%~12.5%,偶见胃肠功能紊乱如恶心、呕吐、胃脘痛,发热、心悸、头晕、头痛和背痛也有少量报道。注射给药引起血液透析患者体位性低血压偶见报道。DF对凝血成分几乎没有影响,因而出血风险极低。DNA及其衍生物虽然没有免疫原性,但已出现DF引发Ⅰ型过敏反应的病例,这点在核酸类药物开发过程中值得借鉴。
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  T4.4 使用暴露边界比法进行我国居民乙酰甲胺磷膳食暴露风险评估

  乙楠楠;吴惠;姚欣雅;赵敏娴;曹正颖;王灿楠

  2013, 27(S1): 122-123.

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  目的 本研究应用暴露边界比法评估我国居民乙酰甲胺磷膳食暴露风险,以期更加客观地估计我国居民通过膳食途径的乙酰甲胺磷暴露风险,为市场监管以及政策制定提供理论依据,同时也为其他化合物的暴露风险评估提供参考。方法 人群膳食暴露量估计采用的数据来自2002年全国营养与健康状况调查,2000-2006年全国食品污染物监测网及2005-2006年海关出口农产品乙酰甲胺磷监测数据。本研究中为了便于计算,未检出值均以0代替。乙酰甲胺磷的每日膳食暴露量使用"中国膳食暴露评估模型软件"(CDEEMS2.0)计算得到。乙酰甲胺磷基准剂量的测定选择健康清洁级成年雌性SD大鼠80只,按体重随机分为8组。设定7个剂量(0.18, 0.37, 0.74, 1.48, 2.95, 5.90, 11.80 mg·kg^-1)组和1个对照(蒸馏水)组,每组10只,连续灌胃21 d。末次染毒结束6 h后,采取相关组织,并测定大鼠大脑皮质、海马和血清中乙酰胆碱酯酶的活性。基准剂量的值采用R语言PROAST28.1软件包进行计算。暴露边界比的定义为动物实验得到的点估计值(未观察到有害作用水平NOAEL或基准剂量值BMDL)与人群膳食暴露量的比值,一般认为值>100不存在暴露风险。本研究中使用BMD法进行暴露边界比的计算。结果 经计算,乙酰甲胺磷经口灌胃对大鼠脑组织海马、皮质和血清的BMD分别为1.35, 0.75和0.59 mg·kg^-1,95%可信区间下限(BMDL)分别为1.08, 0.51和0.38 mg·kg^-1。考虑到个体敏感性的差异,将皮质的BMDL值代入计算,即0.38 mg·kg^-1。计算得到,1~6岁、7~17岁、18~89岁人群各有约10%, 5%和2.5%的个体存在暴露风险。就全人群而言,P95小于100,提示有5%的个体可能存在膳食暴露风险。传统方法用各年龄组居民膳食乙酰甲胺磷暴露量分别与乙酰甲胺磷的ADI(30μg·kg^-1体质量)比较,得到1~6岁、7~17岁、18~89岁居民中存在暴露风险的比例分别为0.1%、0.01%和0.01%。可能低估了人群乙酰甲胺磷的膳食暴露风险。结论 部分居民存在膳食暴露风险,且未成年人的暴露水平明显高于成年人,在制定相关措施时应当重点考虑。与传统地以污染物ARfD和ADI值作为安全参考剂量相比,使用暴露边界比法进行暴露风险的估计能为人群提供更广泛的保护。暴露边界比法也可用于其他农药和化学性污染物的暴露风险评估,为监管政策的制定提供理论依据。
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  T4.6 Establishing GRAS status for food

  Qingdong "Karin" KE

  2013, 27(S1): 124-124.

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  "GRAS" is an acronym for the phrase Generally Recognized As Safe. In the United States (U.S.), food ingredients are considered either as a food additive, which requires premarket review and approval by FDA, or are GRAS for specific uses. If the use of a food substance is GRAS, it is not subject to the premarket review and approval requirement by FDA. GRAS determination can be a self-affirmed opinion that is not subject to FDA review or a GRAS notification that is submitted to the FDA. GRAS notifications to the FDA are voluntary. However, a positive response from FDA provides assurances of safety to end users of the ingredient and is useful in importing ingredients manufactured outside of the U.S.. The use of a food substance may be GRAS either through scientific procedures or, for a substance used in food before 1958, through experience based on common use in food. The specific data and information that demonstrate safety depend on the characteristics of the substance, the estimated dietary intake, and the population that will consume the substance. A step-wised approach is recommended in a GRAS assessment, which may include product identification and ingredient characterization, product specification and manufacturing process analysis, literature search and review, gap analysis, exposure assessment, safety evaluation, and a GRAS conclusion. In addition, review by an expert panel consists of 2-3 experts may also be recommended to strengthen the GRAS determination. A few real-life GRAS notification examples on food ingredients will be given to walk you through the GRAS process. The successful performance of the GRAS process brings safe food ingredients to the consumer in a timely manner. GRAS is an important concept that could likely not only provide a pathway for the Chinese manufacturer to export food ingredients into the U.S., but also serve as an example for the Chinese legislators in food safety.
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  T4.9 橄榄叶提取物的安全性毒理学评价

  陈新霞;徐军;徐德州;鹿奎奎;施伟庆

  2013, 27(S1): 125-126.

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  目的 对橄榄叶提取物进行安全性毒理学评价。方法 参照卫生部GB15193-2003《食品安全性毒理学评价程序和方法》进行小鼠急性经口毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验以及大鼠90 d喂养试验。结果 雌雄小鼠经口MTD值均大于15 g·kg^-1。橄榄叶提取物5000 μg/皿,加及不加S9,对标准测试菌TA97, TA98, TA100和TA102均未检出明显的诱变活性。橄榄叶提取物10 g·kg^-1。未检出对雌雄小鼠骨髓嗜多染红细胞的致微核作用。10 g·kg^-1。未检出对雄性小鼠精子的诱变活性。分别以750, 1500和3000 mg·kg^-1橄榄叶提取物掺入基础饲料中喂养大鼠90 d,期间各剂量组大鼠活动、生长正常,无动物死亡、拒食和其他异常行为。各剂量组雌雄大鼠每周体重、总进食量和总食物利用率与对照组值比较,均无显著性差异(P>0.05);各剂量组雌雄大鼠的脑、心、肝、脾、肾、肾上腺、肺、胸腺、卵巢/睾丸等脏器的绝对重量与脏体比与对照组比较均无显著性差异(P>0.05);雌雄各剂量组喂养中期、喂养末期的血液学检测值:WBC, RBC, HB, NE, LY, MO, EO, BA以及喂养末期的生化指标检测值:AST, ALT, BUN, CR, CHO, TG, GLU, TP和ALB均在正常波动范围内;高剂量组各大鼠大脑、小脑、心、肺、肝、脾、胃、十二指肠、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、卵巢、子宫均未出现与橄榄叶提取物明显有关的组织病理改变。结论 橄榄叶提取物属于无毒级;未见潜在致突变作用;本次90 d喂养实验雌雄大鼠实际摄入的橄榄叶提取物最大未观察到有害作用剂量(NOAEL) 分别为2912和2513 mg·kg^-1体质量。
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  T13.3 孕期乙醇暴露子代雌性大鼠成年脂肪肝易感的宫内起源

  沈朗;刘钟芬;龚俊;张郦;王林龙;Jacques MAGDALOU;陈廖斌;汪晖

  2013, 27(S1): 244-244.

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  目的 孕期乙醇暴露(PEE)可致子代宫内发育迟缓(IUGR)大鼠成年后脂肪肝易感性增加,并探讨其宫内起源机制。方法 Wistar大鼠自孕11 d开始灌胃给予乙醇4 g·kg^-1·d^-1,部分孕鼠于孕20 d取胎鼠血清及胎肝待检,余待至自然生产。雌性仔鼠出生后第一周(PW1)起每周测体重,PW4时断奶、分笼。子代随机给予正常饮食或高脂饮食至成年。PW24麻醉处死大鼠,留取血清及肝。ELISA法检测血皮质酮(GC)含量及血清胰岛素样生长因子(IGF-1)含量;生化方法检测血清葡萄糖及甘油三酯(TG)含量; HE染色及胎肝电镜观察肝病理及超微结构变化,并进行脂肪肝评分;实时PCR检测成年大鼠肝IGF-1信号通路重要基因、糖/脂代谢相关基因的mRNA表达;Beckman公司GeXP多基因表达系统检测胎肝胰岛素/IGF1信号通路、瘦素/脂联素通路、脂质代谢相关基因及代谢性核因子的表达。结果 正常饮食下,PEE组仔鼠血GC轻度降低,而血IGF1及血糖含量显著升高(P<0.01);在摄食量及基础体温不变的情况下体重发生部分追赶性生长;肝IGF1通路及糖/脂代谢相关基因表达无显著改变。在高脂饮食下,PEE组仔鼠血GC显著降低(P<0.05),血IGF1、血糖及血TG含量显著升高(P<0.05);摄食量不变但基础体温升高(P<0.01),体重发生明显追赶性生长;肝病理检测示雌性PEE组肝发生明显脂肪变,病理评分显著升高(P<0.01);肝IGF-1, IGF-1R, IRS2及GLUT2的mRNA表达明显增加(P<0.05),糖异生关键基因G6Pase表达显著增强(P<0.01),脂肪合成相关基因SREBP1c, ACC及FASN表达均明显增加(P<0.01),TG输出相关基因MTTP表达降低(P<0.05)。PEE胎鼠血GC显著升高(P<0.05)而IGF1显著降低(P<0.01),体重显著降低并IUGR率显著增高(P<0.01);胎肝电镜显示肝发生超微结构改变;胎肝多基因表达分析提示肝IGF1表达降低,脂质合成增强、输出降低,代谢性核因子谱发生改变。结论 孕期乙醇暴露子代雌性大鼠成年饮食诱导的脂肪肝易感性增加,存在"二次打击"。第一次打击为肝糖、脂代谢的宫内编程改变,促进脂肪肝的易感;第二次打击为适应性编程的皮质酮-IGF1轴所致的追赶性生长,造成脂肪肝发病。
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  T13.17 低剂量镉模拟雌激素样作用诱导子宫内膜上皮干细胞自我更新和增殖

  黄志雄;张双玲;吴磊;陈丹;王萍;宋世震;江高峰

  2013, 27(S1): 252-252.

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  目的 探讨镉对体外培养小鼠子宫内膜上皮干细胞自我更新和增殖的影响作用及可能机制,为镉污染所致女性生殖系统疾病的防治提供理论依据。方法 小鼠处死后无菌取出子宫,酶消化获得子宫内膜上皮单细胞悬液,用Hoechst33342-SP法筛选子宫内膜上皮干细胞,接种于培养板进行原代细胞克隆形成实验,用无明显细胞毒性浓度的镉(0和1 mol·L^-1)处理,同时加或不加抗雌激素物质ICI182780,15 d后计算细胞克隆形成率,并消化后细胞计数,观察镉对干细胞增殖的影响。接着从原代细胞克隆制成的单细胞悬液中筛选子宫内膜上皮干细胞,在无镉培养液中进行第二代细胞克隆形成实验,计算细胞克隆形成率,观察镉对干细胞自我更新的影响作用。然后挑取第二代细胞克隆,在正常培养液中继续第三代细胞克隆形成实验,观察子宫内膜上皮干细胞的自我更新能力是否恢复。结果 原代细胞克隆形成实验发现各组细胞克隆形成率无差异,但镉处理组的细胞克隆所含细胞数量比空白对照组、镉联合ICI182780组明显增多,提示无细胞毒性浓度的镉可促进子宫内膜上皮干细胞的增殖,该作用可被ICI182780阻断。第二代细胞克隆形成实验发现,原代培养时镉处理组的细胞克隆形成率显著高于对照组和联合处理组,提示镉可诱导子宫内膜干细胞的自我更新,另外未发现三组细胞增殖的差异。第三代细胞克隆形成实验结果发现3组细胞克隆形成率无明显差异,镉所诱导的子宫内膜上皮干细胞自我更新能力在传代后恢复到正常水平。结论 本研究结果提示低剂量镉能模拟雌激素样作用,诱导子宫内膜上皮干细胞自我更新和增殖。该结论对进一步明确镉对女性生殖系统的作用机制提供了科学线索。
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  T13.19 内质网凋亡通路在二硫化碳致大鼠睾丸细胞凋亡中的作用

  郭寅生;董煜;王为;张振;陈国元

  2013, 27(S1): 253-253.

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  目的 通过研究二硫化碳(CS₂)染毒大鼠睾丸生殖细胞中内质网通路相关指标的改变,探讨内质网凋亡通路在CS₂致男/雄性睾丸细胞损伤中的作用。方法 将40只雄性SD大鼠随机分为对照组和3个CS₂暴露组(染毒浓度分别为50, 250和1250 mg·m^-3),每组10只。3个暴露组每日静态吸入CS₂ 2 h,每周染毒5 d,共染毒10周,对照组仅吸入空气。染毒结束后处死大鼠,取睾丸组织,通过光镜和电镜检测大鼠睾丸超微结构的改变;采用末端标记(TUNEL)法检测睾丸细胞凋亡率;应用实时荧光定量PCR检测内质网凋亡相关胱天蛋白酶12和Calpain基因表达的改变;用蛋白免疫印迹法分析检测胱天蛋白酶12和Calpain蛋白表达;并且制备原代细胞,通过胞内钙离子探针检测细胞内钙离子含量。结果 实验结果显示,各染毒组超微结构显著改变,光镜下睾丸曲细精管结构松散,细胞排列紊乱,组织部分溶解缺失,大量空泡清晰可见。由电镜图片可知,支持细胞和生精细胞均出现早期凋亡的表现(细胞核染色体边聚,细胞质中生成大量空泡),并且图片显示空泡是由内质网肿胀而形成的。同时,与对照组相比,各染毒组随剂量升高细胞凋亡率显著升高(P<0.05);胱天蛋白酶12和Calpain基因表达以及蛋白表达显著升高(P<0.05);胞内钙离子含量也随染毒剂量升高而显著升高(P<0.05),并且这些改变呈剂量-反应关系。结论 CS₂暴露可导致大鼠睾丸结构明显改变,睾丸细胞凋亡率增加,内质网凋亡途径相关基因胱天蛋白酶12和Calpain表达显著增高,而且作为内质网凋亡途径的重要标志,胞内钙离子含量也显著升高,以上结果提示内质网凋亡途径在CS₂诱导大鼠睾丸生殖细胞损伤中发挥着重要作用。
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  T13.22 4-t-辛基酚暴露大鼠睾丸基因芯片分析揭示睾丸功能改变与凋亡信号激活

  卞倩;朱宝立;王心如

  2013, 27(S1): 254-255.

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  目的 阐明4-t-辛基酚(OP)暴露后大鼠睾丸功能改变与其相关凋亡信号激活的分子机制。方法 1)将成年雄性SD大鼠随机分成对照组和染毒组(1/90LD₅₀, 1/30LD₅₀和1/10LD₅₀),染毒剂量为:对照组0 mg·kg^-1·d^-1)、低剂量组50 mg·kg^-1·d^-1、中剂量组150 mg·kg^-1·d^-1)和高剂量组450 mg·kg^-1·d^-1,每天灌胃染毒,每周染毒6 d。连续染毒4周(2个生精周期)后,处死大鼠,迅速分离睾丸等脏器。2)对照组和OP染毒150 mg·kg^-1·d^-1组大鼠睾丸组织总RNA提取并纯化后,与约含15 900个大鼠全基因组的Affymetrix Genechip RAT 230A寡核苷酸芯片进行杂交,快速、并行、高效地检测睾丸组织中基因的转录水平,考察基因的应答特征。3)用定量PCR(RT-PCR)法验证差异表达基因,并从中选出与凋亡密切相关的2个基因,用TaqMan-MGB探针技术实时观察对照组和各染毒剂量组凋亡基因mRNA水平的变化。4)用Western blot的方法验证凋亡相关基因的蛋白表达水平变化,以及睾丸组织中细胞色素C(Cyto C)的释放水平、促凋亡基因Bax的表达水平改变以及胱天蛋白酶3的激活状态。结果 1)评估了基因芯片技术分析大鼠睾丸受到OP作用之后mRNA表达水平的改变应答,得到满足差异基因判定标准("Signal Log Ratio"一栏中log2值≥0.7或≤-0.7)的112个探针组(probe set),其中表达上调的基因19个,表达下调的基因93个。2)用RT-PCR法检测了对照组和各染毒剂量组(50, 150和450 mg·kg^-1·d^-1大鼠睾丸组织的Bcl-x, DED和YWKⅡ基因mRNA水平的表达变化,这3个基因都是在芯片中差异表达的基因,并从中选出与凋亡相关的2个关键基因(Bcl-x和DED),用TaqMan-MGB探针技术实时观察对照组和各染毒剂量组凋亡基因mRNA水平的变化。一方面,基因芯片、RT-PCR、Real time PCR三种方法得出的基因表达变化在趋势上是一致的;另一方面,所检测的Bcl-x, DED和YWKⅡ基因随染毒剂量的增加,表达水平逐渐下降,且450 mg·kg^-1·d^-1剂量组显著低于对照组。3) Western Blot结果表明,随着OP染毒剂量的增加,Cyto C的释放随之增加,激活型Bax的表达增加,Bcl-x表达下降,胱天蛋白酶3激活。结论 OP可引起大鼠睾丸组织多种基因mRNA水平表达的改变。凋亡相关基因Bcl-x、DED基因的mRNA表达水平随OP染毒剂量的增高逐渐降低,Cyto C的释放、胱天蛋白酶3的激活、激活型Bax表达增加,提示内源性凋亡通路的激活。
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  T13.35 宫内TCDD暴露对成年大鼠血清性激素和睾丸核受体基因表达的影响

  马静;陈曦;刘亚男;陈京山;冷玲;汤乃军

  2013, 27(S1): 261-261.

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  目的 探讨性腺性别决定期宫内TCDD暴露对子代成年大鼠血清性激素和睾丸类固醇核受体基因表达的影响。方法 孕SD大鼠按照GD0天体重随机分为对照组(玉米油)和TCDD染毒组(200,800 μg·kg^-1)。于性腺性别决定期(GD 8~14 d)灌胃染毒。测定子代大鼠一般生长发育指标,直接化学发光法测定成年雄性大鼠血清雌二醇(E2)和睾酮(T)的含量,实时荧光定量PCR法测定大鼠睾丸组织中类固醇核受体ESR1(NR3A1)和雄激素受体(NR3C4)的mRNA表达水平。结果 (1)TCDD染毒组(200,800 μg·kg^-1)和对照组雄/雌比值分别为0.704,0.740和1.125,差别无统计学意义;TCDD染毒组(200,800 μg·kg^-1)出生存活率(4 d)低于对照组(P<0.05),分别为74.58%,57.58%和92.62%;TCDD染毒组哺乳存活率(21 d)亦低于对照组,但差别无统计学意义; (2)TCDD染毒组仔鼠的围产期体重、身长、尾长和AGD均低于对照组,显示了宫内TCDD暴露对生长发育的长远影响;TCDD染毒组子代成年雄性大鼠体重,睾丸,附睾,前列腺重量以及前列腺脏器系数均低于对照组(P<0.05);脾,脾器系数和心脏脏器系数均高于对照组(P<0.05);(3)TCDD染毒组血清E2含量低于对照组(P<0.05),对照组,200,800 μg·kg^-1 TCDD组子代血清中E2含量分别为27.04±4.57,20.87±3.64,(20.93±3.07)pg·ml^-1;TCDD染毒组血清T含量与对照组差别无统计学意义,对照组,200,800 μg·kg^-1 TCDD组子代血清中T含量分别为135±56,112±20,(133±47)ng·dl^-1;(4)TCDD染毒组睾丸组织类固醇核受体基因ESR1,AR的表达与对照组差别有统计学意义,其中200 μg·kg^-1 TCDD组ESR1,AR mRNA表达低于对照组(P<0.05)。结论 关键生长期TCDD宫内暴露可影响成年雄鼠血清中E2和T的水平,性激素水平的改变可能与睾丸组织类固醇核受体ESR1和AR mRNA表达的降低有关。
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  T13.40 2,4-二氯苯氧乙酸对仔代大鼠早期神经行为发育的影响

  薄存香;张振玲;郭启明;谢琳;刘永霞;戈扬;赛琳琳;张放

  2013, 27(S1): 264-264.

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  探讨孕哺期暴露2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)对仔代大鼠早期神经行为发育的影响。大鼠于受孕后第2日开始经口灌胃染毒2,4-D 0, 25, 50, 100 mg·kg^-1·d^-1直到仔鼠出生后第21天,结果显示各染毒组仔鼠出生后张耳、门牙萌出、开眼、睾丸下降、阴道开启等生理发育指标与对照组比差异无统计学意义。仔鼠早期神经行为测试中100 mg·kg^-1·d^-1组断崖回避、空中翻正及听觉惊愕的阳性发生率明显低于对照组(P<0.05),出现神经行为发育迟缓。提示2,4-二氯苯氧乙酸对早期神经行为发育具有一定毒性作用。
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  T13.42 青春期前双酚A暴露对卵泡Kitlg基因表达及启动子区DNA甲基化的影响

  李昱辰;吴停停;谢美美;王文祥;刘谨;翁绍峥;肖世华;张文昌

  2013, 27(S1): 265-265.

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  目的 探讨双酚A(BPA)影响卵泡发育相关基因的表观遗传学调控机制,为进一步阐明BPA的雌性生殖毒性机制提供依据。方法 28日龄雌性Wistar大鼠腹腔注射BPA 10, 40, 160 mg·kg^-1,对照组注射等容量的橄榄油,每天染毒1次,连续染毒1周。用实时荧光定量PCR分析检测Kitlg基因mRNA的表达水平,用Western blot和免疫组化法检测上述蛋白的表达水平。采用亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)检测Kitlg基因启动子区CpG岛的甲基化状况。结果 随着染毒剂量的增加,促进卵泡发育的Kitlg基因mRNA及其蛋白表达水平下调;采用Methprimer软件对基因的启动子区域进行CpG岛检测,Kitlg基因启动子区存在一个CpG岛(1554-1944,391 bp),对该区域进行PCR扩增,共包含35个甲基化位点(Cs)。Kitlg基因 BSP 产物重组 T 载体质粒的测序结果显示,随着染毒剂量增加,发生的个数呈上升趋势,其中,160 mg·kg^-1 BPA组Cs的甲基化率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);第7甲基化位点(Cs)在对照组存在甲基化状态,在染毒组中出现较为明显的去甲基化现象;第16甲基化位点在对照组呈现无甲基化状态,而随着染毒剂量增加,在染毒组中出现较为明显的甲基化现象。结论 青春期前BPA暴露可诱导促进卵泡发育相关的Kitlg基因表达水平下调,其下调可能与其启动子区CpG岛甲基化模式的改变有关,但其进一步的转录调控机制值得深入研究。
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  T13.44 SD大鼠灌胃RATOS生育力与早期胚胎发育毒

  叶向锋;王灵芝;刘芷含;邓轩;魏金峰;王爱平;

  2013, 27(S1): 266-266.

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  目的 观察RATOS是否对大鼠的配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前阶段和着床的生殖能力及生殖系统产生影响,为评价RATOS的安全性提供依据。方法 SD大鼠灌胃给RATOS 100, 300和900 mg·kg^-1,给药量为1 ml·100 g^-1。交配前雄鼠连续给药28 d,雌鼠连续给药14 d,雌雄按1:1同笼交配,交配期继续给药至交配成功,雌鼠交配成功后仍继续给药至受孕第6天。观察指标包括大鼠一般状况、体重变化、进食量、交配率、受孕率、着床率、活胎率、精子计数及精子活动度、雄鼠生殖系统检查等。结果 给药期间,各组动物行为活动正常,一般状况良好,均无动物死亡。空白赋形剂组和RATOS各给药组大鼠的体重、进食量、交配率、受孕率、平均交配时间、雄鼠生殖器官重量及脏器系数、精子数量及活动度等指标与溶剂对照组相比无显著性差异。雌鼠孕期未见其他与给药相关的中毒症状,未见早产、流产等异常现象。于孕第15天解剖孕鼠发现,空白赋形剂组和RATOS各组窝平均黄体数、平均着床数与溶剂对照组无显著性差异,空白赋形剂组和高剂量组着床前丢失率及中剂量组的死胎率显著高于溶剂对照组。结论 RATOS对雌鼠的生殖功能没有影响,但在一定剂量下具有早期胚胎毒性。
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  T13.46 SD大鼠灌胃RAJN1胚胎-胎仔发育毒性

  叶向锋;王灵芝;刘芷含;邓轩;魏金峰;王爱平;

  2013, 27(S1): 267-267.

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  目的 观察RAJN1能否在大鼠胚胎发育时期引起永久性的、肉眼可见的形态改变及胚胎毒性,为评价RAJN1的安全性提供依据。方法 将受孕SD大鼠灌胃给RAJN1 100, 300和1000 mg·kg^-1,每天1次,连续10 d。于孕20 d时处死孕鼠解剖观察,观察指标包括孕鼠一般状况、体重变化、活胎率、吸收胎率、畸形率、胎鼠外观、骨骼及内脏等。结果 孕鼠连续10 d灌胃RAJN1,孕期均未见阴道流血、流产等异常现象。空白赋形剂组和RAJN1各剂量组孕鼠的体重、孕鼠窝平均黄体数、着床数、活胎数、子宫连胎重以及胎鼠的身长、尾长、窝重、胎重等指标与溶剂对照组比较均无显著性差异;溶剂对照组及RAJN1三个剂量组胎鼠枕骨0级及Ⅰ级骨化率均为100%以上;胸骨主要表现为第5、第6胸骨缺失,除上述现象外未见其它骨骼异常。水杨酸钠组胎鼠死胎率升高、胎鼠的身长、尾长、平均胎重等指标与溶剂对照组比较均有显著性差异,胎鼠内脏检查有明显畸形,骨骼出现骨化不全、延迟、胸骨缺失、肋骨分叉、融合等现象。结论 RAJN1对孕鼠的生殖功能及胚胎-胎仔的发育没有影响。
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  T14.2 基因多态性和DNA甲基化在砷致病及致癌中的作用

  张爱华;梁冰;潘雪莉;肖芸;赵转地;魏绍峰;徐晓静;黄晓欣

  2013, 27(S1): 269-269.

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  目的 探索基因多态性与燃煤型砷中毒发病风险的关系及DNA甲基化在砷致病致癌中的作用。方法 选择贵州省兴仁县燃煤型砷中毒病区砷中毒患者为病例组,以12 km以外某村经健康体检合格的居民为对照组;病例组自愿手术者依据皮肤病理诊断分为癌变组和非癌变组。知情同意原则下采集研究对象血液样本,提取DNA;应用PCR-RFLP和测序法检测分析其代谢酶基因(GSTM1, GSTT1, GSTP1, GSTO1)、DNA修复基因(XRCC1, hOGG1, ERCC1, XPD, XPC)、氧化应激相关基因(CAT, MPO)多态性;采用MSP和测序法检测抑癌基因(p53, p16)、DNA修复基因(MGMT,hMLH1, hMSH2)甲基化情况。 结果 携带GSTT1^(-/-), GSTO2 142Asn/Asp+Asp/Asp基因型个体发生砷中毒的风险分别是携带GSTT1^(+/+)或GSTT1^(+/-) , GSTO2 142Asn/Asn基因型个体的2.18和1.18倍;携带XRCC1 399Gln/Gln基因型个体发生砷中毒的风险是携带XRCC1 399Arg/Arg基因型个体的2.15倍;携带hOGG1 326Cys/Cys基因型个体发生砷中毒的风险是携带hOGG1 326Ser/Ser个体的3.03倍;携带ERCC1 8092CA/AA基因型个体发生砷中毒的风险是携带ERCC1 8092CC个体的1.78倍;携带XPD Lys751Gln+Gln751Gln、XPD Asp312Asn+Asn312Asn个体发生砷中毒的风险分别是携带XPD Lys751Lys, XPD Asp312Asp个体的1.79、1.68倍。p53基因启动子区甲基化阳性率在轻、中、重度砷中毒组分别为13.16%, 27.91%和45.16%,均显著高于对照组(1.01%),P<0.05;非癌变组和癌变组分别为25.00%和63.16%,显著高于对照组,P<0.05。轻、中、重度组砷中毒患者hMSH2基因甲基化阳性率分别为11.76%, 16.28% 和32.14%,均明显高于对照组,P<0.05;癌变组患者hMLH1和hMSH2基因甲基化阳性率分别为11.11%和27.78%,均明显高于对照组,P<0.05;砷中毒组MGMT基因启动子区甲基化阳性率为40.4%,显著高于对照组(2.91%),P<0.05;轻、中、重度砷中毒组甲基化阳性率分别为22.73%, 39.02%和52.78%,均显著高于对照组,P<0.05;非癌变组与癌变组甲基化阳性率分别为27.78%和65.00%,均显著高于对照组。砷中毒患者p53, p16, MGMT, hMLH1, hMSH2基因启动子区甲基化阳性率随皮肤病损程度加重而增高,P<0.05。结论 三类基因多个位点的8种基因型是燃煤型砷中毒发生的重要危险内因之一;p53, p16, MGMT, hMLH1, hMSH2启动子区高甲基化与砷中毒发生发展乃至癌变密切相关。
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  T14.17 葡萄糖酸氯己定消毒液的毒理安全性评价

  赵荣;王丽云;肖竟;施伟庆

  2013, 27(S1): 277-278.

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  目的 为保障消费者使用安全、了解其反复使用的安全性,对葡萄糖酸氯己定消毒液进行毒理学各项试验,从而为其安全性评价提供毒理学依据。方法 一次最大限度剂量为5000 mg·kg^-1。一次破损皮肤刺激试验:将受试物0.5 ml滴于该破损区内。小鼠骨髓细胞微核试验设1250, 2500和5000 mg·kg^-1 3个剂量组。亚急性经口毒性试验:雌雄大鼠急性经口LD₅₀值均大于5000 mg·kg^-1,设纯净水对照组和111, 333和1000 mg·kg^-1 3个剂量组,采用灌胃方式每天经口染毒,每次灌胃容量均为10 ml·kg^-1,连续给予28 d。临床检查:每天观察动物表现,每周称量体重一次。实验结束时,取血后处死,解剖观察并取脏器。血常规及生化检查及其分类计数及肝肾功能相关生化指标。大体解剖和组织病理学检查:计算脏器系数。结果 急性毒性试验:最大耐受剂量(MTD)大于5000 mg·kg^-1,根据急性毒性分级标准属实际无毒级。一次破损皮肤刺激试验:葡萄糖酸氯已定消毒液对家兔皮肤刺激反应积分均值为1.75,刺激强度为轻刺激性。小鼠骨髓微核试验:葡萄糖酸氯己定消毒液剂量达5000 mg·kg^-1未检出对雌雄小鼠骨髓嗜多染红细胞的致微核作用。亚急性经口毒性试验:各剂量组雌雄大鼠多个观察点的体重与对照组值相比,均无显著性差异(P>0.05)。与对照组比较,各剂量组大鼠各血液学指标均无显著差异(P>0.05)。雌性大鼠高剂量 ALB, GLU与低剂量GLU差异有显著性(P<0.05),但其值在本室正常值范围内,且未见剂量-反应关系,其他各剂量组各生化指标值均无显著性差异(P>0.05)。各剂量组肝重、肾重、肝体比、肾体比与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。体质量、增重、摄食量、食物利用率、肝、肾、脾和睾体比、血液、血生化和病理组织学检查与对照组试验动物比较差异均无统计学意义。结论 葡萄糖酸氯已定消毒液对破损皮肤刺激强度为轻刺激性,且未见潜在致突变作用,亚急性经口毒性试验未观察到有害作用,最大剂量(NOAEL) 为1000 mg·kg^-1。该消毒液安全可靠,可应用于杀菌消毒。
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  T14.19 乌拉坦诱发小鼠肺癌过程中miR-1a异常表达

  李勋;吴建军;郑晶利;李远奇;杨倜;胡功成;戴嘉彬;杨巧媛;戴丽军;蒋义国

  2013, 27(S1): 278-279.

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  目的 探索乌拉坦诱导肺癌发生过程中microRNA表达改变并鉴定肺癌发生相关的特异microRNA。方法 将置于SPF环境饲养的BABL/c小鼠随机分为生理盐水对照组(n=30只)和乌拉坦处理组(n=30只),处理组每只小鼠经腹腔注射1 g·kg^-1剂量乌拉坦溶液,每周1次,连续4周。对照组每只小鼠相应地经腹腔注射等量生理盐水,分别在初次给予乌拉坦之后的第6周、12周、24周剖杀对照组和处理组小鼠,获取相应的血清、肺癌组织以及相关脏器组织样本。提取第24周乌拉坦处理组小鼠总RNA,等RNA量混合肺癌组织以及肺癌旁组织RNA构建相应的肺癌组织RNA pool以及肺癌旁组织RNA pool。利用高通量Solexa sequencing技术,对肺癌组织以及肺癌旁组织RNA pool进行small RNA测序,在不同时间点运用Taqman qRT-PCR方法检测miRNA在组织、血清中的相对表达水平。结果 本研究成功建立乌拉坦诱发小鼠肺癌模型,乌拉坦初次处理后6周,小鼠肺表面尚未观察到肿瘤,病理学结果显示肺组织仅发生炎症细胞渗出等轻微改变。自初次给予BALB/c小鼠乌拉坦之后第12和24周,肺肿瘤发生率分别为90%及100%,肺肿瘤经病理学鉴定为肺腺癌。第24周乌拉坦处理组肺癌组织以及癌旁组织small RNA测序结果表明,癌组织以及癌旁组织富含大量22 nt左右长度的microRNA分子,利用Mireap软件预测到一簇新microRNA分子。依据一定的筛选原则,在第24周肺癌及癌旁组织中鉴定到23个差异表达microRNA。基于Solexa sequencing结果中肺组织miR-1a差异表达改变明显以及miR-1a转录本的高丰度,拟选定miR-1a进一步研究。运用Taqman qRT-PCR方法检测乌拉坦诱发BALB/c小鼠肺癌模型第6周、12周、24周肺组织中miR-1a相对表达水平。相对生理盐水对照组,在第6周时,乌拉坦处理组肺组织中miR-1a表达下调;第12周时,相对生理盐水对照组,乌拉坦处理组肺癌旁组织以及肺癌组织中miR-1a表达下调。在第24周,本研究也证实相对生理盐水对照组,乌拉坦处理组肺肿瘤组织中miR-1a表达下调。此外,相对于生理盐水对照组,本研究也证实在乌拉坦处理组肾、肝组织中尚未观察到miR-1a表达异常改变。在第6周、12周、24周三个时间点,相对生理盐水对照组,miR-1a在乌拉坦处理组血清样本中维持低表达水平。结论 乌拉坦诱发肺癌发生发展过程中,microRNA表达发生异常改变;miR-1a在肺组织及血清中的维持表达下调,表明miR-1a与乌拉坦诱发的肺癌相关。
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  T14.21 应用搭桥PCR法构建人GADD45a荧光素酶报告基因质粒

  齐田力;王恺;殷宏;田世民;安子扬;邹明强

  2013, 27(S1): 279-280.

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  目的 生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(GADD45)基因家族位于p53下游,是DNA损伤修复的重要相关基因。为检测环境中可能存在的致癌物,建立GADD45a双荧光素报告基因系统,本实验构建了人GADD45a荧光素酶报告基因质粒。方法 以人Hep-G2培养细胞基因组DNA为模板,在涵盖GADD45a基因启动子序列2.3 k及基因组DNA序列2.6 k(包括3个内含子和4个外显子)范围内,分别以三对引物进行扩增:CCGCTCGAGATAGCATGCAGTATAATTTTTGAGT(GD2.3K-sens1)/TTAAAAAAGTGTCTCCAGACCTC(GD2.3K-anti1), CAGCTTTCCAAAAATAAATCAAAC(GD2.3K-sens2)/CAGCGTCGGTCTCCAAGAG(GD2.3K-anti2), CACTTCCTGTCGCTTTTCTG(GD2.3K-sens3)/GAAGATCTTCAGGGAGATTAATCACTGGAAC(GD2.3K-anti3),扩增片段大小分别为1890, 1925, 1558 bp。 然后以三条扩增片段产物为模板,以GD 2.3k-sens1/GD2.3K-anti3为引物进行搭桥PCR,获得全长为4924 bp的目的序列。序列回收后,通过TA克隆构建到载体pMD18-T内,为质粒pMD-GD 2.3 k,经XhoⅠ及BgⅢ酶切后插入pGL4.10[luc2]质粒相应位点内。质粒构建成功后测定全长并进行酶切鉴定。结果 质粒全长测定及酶切鉴定结果显示,利用搭桥PCR方法,正确扩增了全长为4.9 k的人GADD45a基因片段,成功构建了人GADD45a-GL4.10[luc2]报告基因质粒。结论 在扩增大片段DNA序列的时候,应用搭桥PCR方法可以比较轻松地得到全长序列。通过设计三对引物扩增中等大小的片段,之后经搭桥PCR得到将近5 k的目的序列,顺利构建了人GADD45a-GL4.10[luc2]报告基因质粒。
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  T6.36 甲醛染毒和染毒恢复阶段诱导型热休克蛋白70的交互作用蛋白分析

  魏薇;胡建安;段燕英

  2013, 27(S1): 177-177.

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  目的 鉴定和分析人支气管上皮细胞(HBE)在甲醛染毒和染毒恢复时,诱导型热休克蛋白70(Hsp70)的所有交互作用蛋白,为阐明甲醛暴露条件下Hsp70的生物学作用提供依据。方法 用3.3 mmol·L^-1的甲醛染毒HBE 3 h和染毒3 h后恢复3 h,消化后离心收集细胞,用RIPA裂解液裂解细胞,蛋白定量后调整蛋白浓度为2 μg·μl^-1。先在细胞裂解物中加30 μl琼脂糖蛋白A/G预清除,然后加3 μl小鼠抗人Hsp70抗体4℃摇动孵育过夜,再加30 μl琼脂糖蛋白A/G 4℃旋转孵育1 h,用RIPA清洗3次,最后加1×SDS煮沸变性蛋白。用SDS-PAGE分离蛋白样本后,运用质谱技术鉴定蛋白,通过查询数据库和文献资料,根据功能对鉴定的蛋白进行分类。结果 甲醛染毒阶段的Hsp70交互作用蛋白经过鉴定共有41种,分别为:ANXA2、核糖体蛋白S3、谷胱甘肽S-转移酶 P、核糖体蛋白S3a、膜联蛋白A3、14-3-3蛋白、E3泛素蛋白连接酶RNF12、钙蛋白酶、核糖体蛋白L19、酸性核糖体蛋白P0、核糖体蛋白L7、核糖体蛋白L14、不均一核内核蛋白A2B1、核糖体蛋白L7a、核糖体蛋白S8等,根据功能分为13类;甲醛染毒恢复阶段的Hsp70交互作用蛋白经过鉴定共有55种,分别为:过氧化还原酶1、KIN17、谷胱甘肽S-转移酶P、半乳糖凝集素7、包含锚蛋白重复区域蛋白32、泛素蛋白连接酶CBL、磷酸酯酶和肌动蛋白的调节子2、E3泛素蛋白连接酶、cAMP调节的磷蛋白21、磷脂酰4磷酸盐3激酶、RNA外切酶1、核糖体蛋白L7等,根据功能分为20类。其中既有具有正常生理功能的蛋白,如骨架蛋白、糖和能量代谢蛋白、细胞连接蛋白等,也有具有抵抗损伤促进修复功能的蛋白,如抵抗氧化性损伤蛋白、毒物代谢解毒蛋白、DNA修复蛋白等。结论 在甲醛染毒和染毒恢复阶段,Hsp70可能通过和特定蛋白的交互作用而在加速甲醛代谢解毒、减小甲醛导致的生物学损伤、促进变性蛋白和损伤DNA的修复方面发挥了一定的作用。
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  T7.7 神经前体细胞增殖分化平衡调节与农药神经发育毒性

  陈晓萍;王大炜

  2013, 27(S1): 185-186.

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  胚胎神经发育期暴露低浓度有机磷农药,能在成年动物遗留认知行为机能低下与脑组织结构异常,其病理过程涉及胚胎早期神经发育调节,目前,确切的毒理机制仍不清楚。神经前体细胞是神经发生的源头细胞。它分为顶端神经前体细胞(AP)和基底神经前体细胞(BP),AP细胞位于神经生发中心脑室腔周围,它通过分裂完成自我复制或衍生为BP细胞,而BP位于AP层上方,通过分裂进一步衍生为神经元。AP与BP增殖分裂与分化分裂的平衡调节,是正常脑结构与机能发育的前体条件。以往的研究结果表明,低浓度有机磷农药暴露引起神经发育期细胞基因调控、形态发育的一系列改变。例如,将低剂量有机磷农药毒死蜱或二嗪农暴露出生1~4 d SD鼠,随后分析脑干与前脑的基因微阵列,在252个基因中60%发生了显著的转录活性改变,主要涉及细胞生长、树突与轴突发育、细胞应激与凋亡;在体外培养的神经发育模式细胞PC12,毒死蜱在发育早期使转录因子SP1表达下降,在发育后期则使转录因子AP1表达下降;毒死蜱处理抑制PC12细胞向胆碱能神经元的分化,但促进向儿茶酚胺能神经元的分化过程;在体外培养的脊髓背根神经节细胞与N2a细胞,有机磷农药抑制轴突生长,而在颈上神经节交感神经元,有机磷农药在抑制轴突生长的同时,却促进树突生长。我们基于前人的文献报道及自己实验室的长期研究,提出有机磷农药通过干扰神经前体细胞增殖与分化平衡调节,从而导致神经发育毒性发生。通过对胚胎神经发育早期在体脑片的研究以及神经前体细胞体外培养,我们已经取得了一系列支持性的证据。例如,胚胎侧脑室壁呈现细胞分层结构,自内向外依次为VZ, SVZ, CP和IZ。Pax6⁺细胞主要位于VZ层,是早期神经前体细胞标志。Tuj1⁺细胞位于CP和IZ层,是已分化神经元的标志。从VZ到IZ,依次代表细胞的不同发育阶段。我们发现,有机磷农药如毒死蜱处理后,VZ层变薄而CP层变厚,Pax6⁺细胞数量明显下降,而Tuj1⁺细胞变化不大,这说明神经前体细胞的增殖进程被选择性抑制,而分化进程无明显改变或轻度激活,正常增殖/分化平衡已被扰乱;对胚胎神经前体细胞进行体外培养,可获得由数十个细胞聚集在一起的神经球,这也是胚胎干细胞的早期特征。当细胞进入分化阶段,神经球将逐渐解聚。我们的实验证实,在培养液中加入浓度不同的有机磷农药毒死蜱,神经球将出现与剂量相关的解聚,由数十个细胞的聚合体分散为数个甚至单个细胞。神经前体细胞增殖分化平衡失调,是有机磷农药神经发育毒性的一种新型作用机制。
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  T7.12 多巴胺受体D1和D2在锰致运动及学习记忆障碍中的作用

  邓宇;李乐慧;魏衍刚;徐斌;焦聪聪;郝作鹏

  2013, 27(S1): 188-189.

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  目的 探讨纹状体多巴胺受体D1和D2在锰致小鼠运动及学习记忆障碍中的作用,为阐明锰中毒的发病机制及其防治提供依据。方法 昆明小鼠腹腔注射MnCl₂ 0, 12.5, 25和50 mg·kg^-1,连续2周。进行自主活动、疲劳转棒、Morris水迷宫和避暗活动检测,免疫组化法检测DRD1和DRD2的表达,Western blotting法检测DRD1和DRD2的蛋白水平。结果 随着锰浓度的升高,小鼠的自主活动、站立次数及疲劳转棒的潜伏期逐渐缩短,水迷宫训练阶段逃避潜伏期和游泳总路程逐渐增加,空间探索阶段穿环次数逐渐减低,训练后的避暗潜伏期逐渐减少,进入暗室的次数逐渐增加,DRD1和DRD2的表达及蛋白水平逐渐降低,并呈现剂量依赖性。与对照组比较,在中锰组中小鼠的站立次数明显下降至65.50±14.80次,训练后避暗潜伏期明显下降至(55±34)s,进入暗室次数显著增加至13.63±5.40次,DRD2免疫组化的阳性面积比明显下降至(0.53±0.07)%,积分光密度下降至6.00±0.77,Western blotting检测DRD2的相对蛋白水平下降至(0.58±0.13)%;在MnCl₂ 50 mg·kg^-1组中,小鼠的活动和站立次数明显下降至对照的53.89%和52.22%,转棒潜伏期显著下降至47.67%,在训练阶段第3~5天Morris水迷宫逃避潜伏期和游泳总路程明显增加,空间探索阶段(第6天)的穿环次数下降至60.16%,训练后的避暗潜伏期明显下降至32.57%及进入暗室次数增加2.39倍。DRD1和DRD2的阳性面积比下降至39.29%和66.25%,两者的积分光密度下降至33.39%和39.11%,两者的蛋白水平减低至59.26%和56.47%。结论 过量锰暴露可能通过下调纹状体内多巴胺受体D1和D2的表达,导致小鼠的运动和学习记忆障碍。
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  T7.19 毒死蜱和氯化镉亚慢性联合神经毒性作用

  许明圆;孙英健;许海洋;陈丽萍;董晶晶;朱丽;伍一军

  2013, 27(S1): 192-192.

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  目的 了解有机磷农药与重金属的联合神经毒性作用。方法 以成年SD大鼠为实验动物,以毒死蜱和氯化镉2种化学物作为测试药物,以低中高3种给药剂量(分别是1.7, 5, 15 mg·kg^-1·d^-1和0.7, 2和6 mg·kg^-1·d^-1)染毒,采用4×4全析因设计的研究方法,单独和联合染毒90 d后,通过对大鼠脑组织氧化损伤指标(SOD, CAT, MDA和PCO)检测、组织病理学检查(FJB染色的方法及电镜观察)以及基于GC-MS的脑代谢组学分析等方法研究毒死蜱和氯化镉这2种化学物对大鼠脑组织的毒性作用。结果 毒死蜱和氯化镉单独和联合染毒后会引起大鼠脑组织的氧化损伤,在蛋白质过氧化损伤指标上主要表现出拮抗作用。检查大鼠大脑皮层、海马齿状回以及海马CA2-CA3区发现,两种化学物对神经组织的损伤作用主要呈现出拮抗效应。脑代谢组学分析发现了22种变化的代谢物,主要涉及能量及氨基酸代谢。电镜观察到这两种化学物引起的线粒体结构损伤,支持药物引起能量代谢紊乱这一推断。此外,发现了能够区分毒死蜱、氯化镉以及两者联合作用中毒后的脑代谢物的标记成分:反映毒死蜱毒性的代谢谱变化——L-缬氨酸和L-亮氨酸均降低;反映氯化镉毒性的代谢谱变化——丙酸和酪氨酸均降低;反映两者联合毒性的代谢谱变化——1,2-丙二醇-1-磷酸、D-葡萄糖酸、9H-嘌呤、丝氨酸以及2-酮异戊酸含量均升高。结论 毒死蜱和氯化镉亚慢性联合染毒可致大鼠脑组织毒性呈现拮抗作用。毒死蜱和镉两种化学物染毒大鼠其脑组织代谢谱呈现单独和联合染毒不同的特征。
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  T7.21 醋酸铅染毒诱导PC12细胞lncRNA差异表达的分析

  赖延东;南阿若;高丽云;蒋义国

  2013, 27(S1): 193-193.

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  目的 探讨在铅中毒过程中长链非编码RNA(lncRNA)的表达变化及其相应的机制。方法 采用神经细胞系PC12进行醋酸铅(PbAc)的染毒实验,首先通过不同剂量的细胞毒性实验确定了染毒的剂量,染毒处理细胞与对照细胞分别3个样本进行了基因芯片检测,每个细胞样本的1 μg总RNA经过富集转录为荧光标记的cRNA,与4X44 Rat LncRNA Array (Arraystar)杂交后扫描分析。结果 染毒试验结果显示只有部分较高剂量(0.1 μmol·L^-1以上)在72 h染毒有明显的细胞生长抑制,其他均没有表现出明显的细胞生长抑制效应,可以作为神经毒性试验的参考剂量。PbAc 0.025 μmol·L^-1染毒24 h,空白组和处理组细胞的lncRNA表达谱存在明显的差异,以表达倍数和差异显著性检验值的分布进行分析,有显著性意义的2倍以上差异表达中,处理细胞较正常细胞表达上调的lncRNA有638个,表达下调的lncRNA有233个。mRNA的表达谱结果显示,处理细胞较正常细胞表达上调的编码基因有388个,下调的有374个。结论 醋酸铅染毒导致了PC12细胞lncRNA表达谱发生显著改变,lncRNA参与调控多种基础生物学进程,有可能作为新的生物标志物或者是药物靶标,对铅中毒的早期预防与生物监测有重要意义。
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  T7.24 亚慢性镧暴露对仔鼠空间学习记忆能力的影响

  郑琳琳;杨敬华;巫生文;庞妍;刘继薇;刘慧颖;赵永玲;蔡原

  2013, 27(S1): 195-195.

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  目的 探讨慢性氯化镧暴露对子代大鼠空间学习记忆能力的影响。方法 健康成年雌性Wistar大鼠40只,随机分为对照组(饮用蒸馏水);低剂量染镧组(饮用含0.25% LaCl₃的蒸馏水溶液)、中剂量染镧组(饮用含0.5%LaCl₃的蒸馏水溶液)和高剂量染镧组(饮用含1.0%LaCl₃的蒸馏水溶液),每组6只动物。然后将雌雄大鼠按1:1同笼进行交配,发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者记为妊娠第0天,孕鼠单笼饲养并自由摄水。子代大鼠在断乳前经由母体血循环和吸吮母乳染镧,断乳后则通过自行饮水摄入镧,至断乳后1个月结束。仔鼠每天在Morris水迷宫内训练4次,连续训练5 d。5 d训练结束后,间隔1周后将动物放置于迷宫内进行定位航行实验和空间探索实验。结果 在第1和第2个训练日,对照组和LaCl₃组仔鼠的平均逃避潜伏期及平均游泳距离之间无差异;训练第3天,中、高剂量组仔鼠的平均逃避潜伏期显著长于对照组(P<0.05),低、中、高剂量组仔鼠的平均游泳距离均显著长于对照组(P<0.05);训练第4天,低、中、高剂量组仔鼠的平均逃避潜伏期均显著长于对照组(P<0.05),平均游泳距离无差异;训练第5天,对照组和LaCl₃组仔鼠之间的平均逃避潜伏期及平均游泳距离之间无差异。在定位航行实验中,LaCl₃组仔鼠的逃避潜伏期和游泳距离均显著高于对照组,且与LaCl₃染毒剂量呈正相关(P<0.05)。在空间探索实验中,中、高剂量组仔鼠在目标象限内的时间明显短于对照组(P<0.05);低、中、高剂量组仔鼠进入目标象限的次数显著少于对照组(P<0.05);对撤除平台后仔鼠的游泳路径跟踪观察发现,对照组仔鼠寻找原隐蔽平台的目的性强,在平台区域附近反复穿越,而LaCl₃组仔鼠随着染镧剂量增加寻找原隐蔽平台的趋向性降低,高剂量组仔鼠甚至很少进入平台区域。结论 LaCl₃染毒的各组仔鼠与对照组仔鼠有相似的学习过程,但是LaCl₃组仔鼠比对照组仔鼠的学习能力差。在定位航行实验中,LaCl₃组仔鼠表现出剂量依赖的记忆损伤。在空间探索实验提示对照组仔鼠的长时记忆能力明显优于LaCl₃组。因此,LaCl₃可显著损伤仔鼠的空间学习和记忆能力。
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  T7.27 长期铅暴露致大鼠神经退行性改变

  冯昶;范广勤;黎砚书;陈英;焦欢;周繁坤;杜桂花;王志平;管临福

  2013, 27(S1): 196-197.

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  目的 探讨长期铅暴露所致的大鼠中枢神经系统退行性改变及其相关基因蛋白表达的变化。方法 将成年雌性SD大鼠随机分为空白组、低铅组和高铅组,分别给予0,800,1500 mg·L^-1醋酸铅溶液饮水染毒,10 d后与雄性大鼠合笼,繁殖仔鼠,雌鼠染铅至仔鼠断乳。雄性仔鼠断乳后对应于其母鼠所在组别继续分别给予醋酸铅溶液0,300,900 mg·L^-1。仔鼠于断乳(3周)、中年(41周)、老年(70周)时,采用ICP-AES测定血铅和皮质、海马铅含量;硫堇染色观察3个年龄皮质、海马神经元密度;采用透射电子显微镜观察老年大鼠海马神经元超微结构的改变;活体MRI(核磁共振)技术测量老年大鼠大脑及海马体积;采用ELISA法测定脑组织8-OhdG(8-羟脱氧鸟苷)含量;采用RT-PCR和Western blot测定APP, tau, GRP78和GRP94表达水平。结果 (1)各个年龄仔鼠血铅及脑组织铅含量均随着铅染毒剂量增加而增高(P<0.05);同一染铅剂量下各年龄仔鼠血铅无显著差异(P>0.05),但皮层、海马铅含量中年与老年鼠均比断乳鼠高(P<0.05)。(2)形态学改变:活体MRI结果显示,铅染毒老年鼠大脑体积下降(P<0.05),海马体积呈下降趋势,但无统计学意义(P>0.05);硫堇染色发现铅染毒组老年鼠,皮层顶区和海马CA1、DG区神经元密度减少,明显低于空白组(P<0.05);电镜结果提示,随着染铅剂量增加,胞质、胞核、内质网结构和突触结构均遭到不同程度的破坏,出现早期神经元细胞凋亡现象。(3) 大脑皮层、海马APP mRNA水平,铅染毒仅使老年鼠表达增加(P<0.05),中年和断乳鼠变化不明显;而皮层和海马APP蛋白水平在断乳和老年鼠均随染铅剂量增加而升高,且高铅组与空白组均有统计学差异(P<0.05)。(4) 铅染毒对各年龄仔鼠皮层和海马tau mRNA表达无明显影响;但断乳鼠海马tau蛋白表达两个铅染毒组均高于空白组(P<0.05),而海马磷酸化tau(Ser396)蛋白则在老年鼠表现为高铅组明显高于其余两组(P<0.05)。各年龄仔鼠皮层tau及磷酸化蛋白均不受染铅影响。(5) 铅染毒使老年鼠大脑皮层、海马GRP78 mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05),而断乳和中年鼠均无类似改变(P>0.05)。老年鼠仅高铅组海马GRP94 mRNA表达显著高于低铅和空白组(P<0.05),而蛋白水平各组间均无差异;GRP94 mRNA和蛋白在各年龄不同染铅组间皮层变化均不明显。(6) 铅染毒增加了断乳和老年鼠大脑8-OHdG的含量,且呈剂量-反应关系(P<0.05)。结论 铅暴露导致的神经退行性改变可能与内质网应激反应有关,也可能与铅导致的氧化应激和APP/tau的表达有关。
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  T7.30 GSK-3β参与氯胺酮精神依赖的机制

  黄娴妮;刘昱;周文华;

  2013, 27(S1): 198-199.

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  目的 探索GSK-3β是否参与氯胺酮成瘾及GSK-3β抑制剂是否影响大鼠氯胺酮自身给药,进一步探讨GSK-3β参与氯胺酮精神依赖的机制。方法 实验1:24只清洁级雄性SD大鼠进行颈静脉插管手术,手术恢复后随机分为两组,第1组大鼠采用固定频率FR1程序进行氯胺酮静脉自身给药训练(0.5 mg·kg^-1/infusion),每天4 h,给药次数稳定后转入自身给药维持期,仍然采用FR1程序,每天2 h,维持14 d;第2组大鼠每天放置入静脉自身给药笼,置于笼中的时间与第1组相同,但不给予氯胺酮。自身给药维持期最后一天给药结束后2 h,将大鼠处死并断头取脑,用Western blot的方法检测纹状体、海马、伏隔核和前额皮层中磷酸化GSK-3β及总的GSK-3β的表达变化。实验2:12只清洁级雄性SD大鼠进行颈静脉插管手术,手术恢复后进行氯胺酮自身给药训练(0.5 mg·kg^-1/infusion),给药稳定后进入维持期,在维持期内给予大鼠特异性GSK-3β抑制剂SB216763及其溶媒DMSO对自身给药进行干预,药物干预分别在固定频率FR程序及累进频率PR程序下进行,SB216763的剂量为2和4 mg·kg^-1,在自身给药前5 min进行腹腔注射。实验中的对照方式为自身对照,即前一天于自身给药前5 min给予大鼠DMSO,记录自身给药数(FR程序)或断点数(PR程序)作为对照,第2天在相同时间给予大鼠SB216763并记录相应结果。结果 实验1:自身给药维持期内大鼠每天给药量较为稳定,Western blot的结果表明,氯胺酮自身给药组与对照组相比,各脑区磷酸化GSK-3β占总GSK-3β的比例显著降低(P<0.01),即氯胺酮自身给药后GSK-3β的活性显著升高。实验2:FR程序中,给予两个剂量的SB216763并没有显著减少氯胺酮的给药量(P >0.05),而在PR程序中,两个剂量的SB216763均能够显著降低氯胺酮自身给药的断点(P<0.01)。结论 GSK-3β参与了氯胺酮的成瘾,且GSK-3β抑制剂能够显著降低大鼠对氯胺酮的奖赏动机,GSK-3β可能参与了氯胺酮的奖赏作用。
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  T7.34 碳纳米管的电学特性与神经再生

  程韵;陈晓萍

  2013, 27(S1): 200-201.

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  神经再生与修复需要克服分裂增殖能力低下、生长方向难以控制等技术难题,选择合适的生长支架对于损伤修复具有重要意义。碳纳米管(CNT)表面依附性能好、细胞毒性小、易于修饰加工,更重要的是,它具有独特的电学特性,是理想的支架材料。CNT的骨架结构是碳原子组成的六边形蜂窝状结构,碳-碳之间的共轭效应显著,因而具有良好的电导性。利用CNT良好的电导特性,在CNT制成的再生支架中可以导入弱电刺激,从而提高神经再生效果。例如,Malarkey等发现,弱电刺激下的神经细胞能够在CNT支架上正常生长与分化;Yamada等发现,短暂间歇性的微弱电刺激明显刺激胚胎神经干细胞向神经元的分化,神经元的生长速度也加快;Mazzatenta等的研究显示经CNT传递的电刺激信号首先作用于细胞表面,通过调节细胞应答,促进神经细胞的生长;Parpura等证实,培养在CNTs基底膜上的神经元具有良好的电生理特性;Liopo等对CNT进行简单的化学修饰,发现能更好地支持神经细胞的附着和生长,并控制细胞生长方向;Tran等将神经元耦合到CNT,利用CNT的高导电性提高神经网络回路活性; Barbara Nguyen-Vu等更是将碳纳米纤维组成阵列,导引PC12细胞生长分化并相互交联,最终构成人工神经网络。Britto等于1996年首先将CNT制成电极,用于对神经递质多巴胺的检测,从而开始了CNT的体内应用研究;Keefer等人用碳纳米管修饰电极表面,发现金属电极经CNT修饰后具备更低的电阻和信噪水平,能更好地记录植入脑区的电流变化。将其植入鼠脑皮层神经元区和猴脑视觉皮层区后,记录到的神经细胞电刺激与应答信号都有增强,加上CNT体积小、质量轻、耐腐蚀性强的特性,很适合于作为电极材料植入动物脑内;Webster等发现,使用CNT制成的电极,不仅可以减少瘢痕组织产生,还可以用于刺激中枢神经系统的神经元突触生长;通过植入脑内特定区域的CNT电极,可以进行体外控制的脉冲电流刺激,促进内源性神经干细胞的增殖与分化,从而促进神经损伤的修复。综上所述,CNT支架由于其良好的生物相容性及独特的电学特性,在神经再生领域具有重要的应用前景。
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  T7.36 岛叶与成瘾

  景小龙;刘静;万佳亮;申秀萍

  2013, 27(S1): 201-202.

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  毒品成瘾者当身体渴求毒品的时候吸毒者就会易怒和焦虑,而这种戒断症状往往作为一种负性强化因子强化了用药行为,从而使成瘾者不能自拔导致了药物的持续使用或复吸。在以往的成瘾觅药行为的研究中,人们主要集中在皮层下系统,例如杏仁核、腹侧纹状体、边缘多巴胺神经系统。而最近大量证据表明,人们在很大程度上忽视了岛叶能够参与自觉吸毒过程中,并能起到至关重要的作用。根据脑功能影像学研究表明:在成瘾中岛叶的主要作用是把对毒品渴求身体反应转化为相应的感觉信息,类似于感觉指令总部。如果身体反应因缺乏毒品引起,岛叶就会发出指令让人对毒品产生强烈渴望。在以往的研究中岛叶和大脑皮质、基底节及边缘系统有大量的联系,并且这些脑区具有多种不同功能,如情感、躯体感觉、语言功能、记忆、味觉和嗅觉等。岛叶能将这些内感受状态信息整合并转化成意识感觉和对未知危险与奖赏的决策过程。因此岛叶在成瘾中的作用可能是激活内感受性特征,一方面通过刺激奖赏通路引导动物得到适当的目标对象,另一方面岛叶的激活能影响前额叶皮层的功能,是其能够影响注意力、推理、计划、决策过程制定行动计划以需求获得药物。岛叶在成瘾研究中的发现不仅仅对于开发未来治疗毒瘾疗法具有实践和治疗意义,而且从一个基本的科学观点角度出发提供了有关岛叶皮层的新见解。
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  T7.38 单双倍剂量“清浊祛毒丸”治疗氯胺酮滥用伴泌尿系损害的疗效对照观察

  李晓东;秦泽慧;何志军;夏子胜;梁春梅;邓菊平;韦品清

  2013, 27(S1): 202-202.

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  目的 观察"清浊祛毒丸"治疗氯胺酮滥用导致泌尿系损害的临床治疗效果。方法 对88例氯胺酮滥用伴有严重泌尿系损害症状患者分单倍剂量组(每次8.0 g,每日3次)和双倍剂量组(每次16.0 g,每日3次)分别进行口服"清浊祛毒丸"治疗,通过对治疗的当天、第7日、第14日和第20日(出院前)的临床症状评分比较,以及相应的实验室尿常规检查结果的比较,观察两个剂量组的治疗效果。结果 通过"清浊驱毒丸"的治疗,两个剂量组的患者的尿频、尿急、尿痛、血尿等尿路刺激症状明显减轻和消失,尿常规结果逐渐恢复正常,治疗前后结果比较有显著性差异(P<0.05)。双倍剂量组在患者症状明显严重的情况下,仍能快速有效的发挥作用。结论 "清浊祛毒丸"对缓解和消除氯胺酮滥用导致的泌尿系损害有显著的效果,并且可以减轻和缓解腰痛、乏力、自汗盗汗等症状,双倍剂量治疗效果强于单倍剂量,无明显不良反应,可推荐临床采用。
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  T8.4 喹乙醇急性和亚急性

  张芳芳;徐娟;黄雅丽;陈琼姜;洪雅青;朱勇;黎关龙;顾刘金;吴立仁

  2013, 27(S1): 207-208.

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  目的 检测喹乙醇的亚急性毒性,通过观察毒性效应的临床表现、体重、摄食量变化、大体解剖、病理组织学检查、血液学、血液生化及尿常规检查,初步估计毒作用的靶器官和可能的毒作用机理,提出无明显有害作用水平(NOAEL),为喹乙醇的应用提供依据。方法 选用SD大鼠,大鼠急性经口毒性实验设464, 1000, 2150, 4640 mg·kg^-1组。亚急性试验设空白对照组,125, 500和2000 ppm组,经口染毒28 d。设对照附加组、高剂量附加组,经口染毒28 d结束后再观察14 d。结果 喹乙醇对SD大鼠急性经口毒性试验,可见出鼻血、毛发污秽和死亡等中毒体征,雌雄大鼠LD₅₀均为1470 mg·kg^-1,属低毒级。亚急性试验结果显示,与对照组相比,高剂量组雌性大鼠体重增长减缓,摄食量、食物利用率下降,血液学指标WBC, RBC, HGB和 HCT降低,RDW升高,脑、脾、肾脏器系数升高;高剂量组雄性大鼠体重增长减缓,摄食量、食物利用率下降,脑、脾、胸腺、睾丸、附睾脏器系数升高,血液学指标WBC, RBC, HGB, HCT, MID和PLT降低,RGW升高,血液生化指标无异常;与对照附加组相比,高剂量附加组雌性大鼠体重增长减缓,摄食量、食物利用率下降,脑、心、肾上腺、胸腺脏器系数升高,血液生化指标RBC, HCT和RDW升高;高剂量附加组雄性大鼠体重增长减缓,摄食量、食物利用率下降,血液学指标WBC, RBC, HGB和HCT降低,RDW升高,脑、心、肾、脾、胸腺、睾丸、附睾脏器系数升高。结论 在本实验条件下大鼠亚急性经口毒性实验对SD大鼠的最大无作用剂量为55.1 mg·kg^-1,对肾等脏器有明显损伤,在动物饲料添加剂应用中需按严格要求使用。
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  T8.8 SD大鼠饮水量分析

  陶核;黄雅丽;顾刘金;金锋;陈琼姜;朱勇;金爱华;徐娟

  2013, 27(S1): 209-210.

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  目的 对SD大鼠几个主要生长时期饮水量资料进行统计分析,以获得本实验室SD大鼠饮水量相关参数的参考值范围。方法 对以下SD大鼠饮水量数据进行统计分析:断乳后10周内SD大鼠,共48只,雌雄各半;孕鼠,45只,孕期0天至20天;哺乳期母鼠42只,哺乳期共21 d,哺乳期产后4 d,如每窝幼鼠多于8只,调整为8只,性别比尽量调整为4:4。计算每日饮水量、单位体重饮水量的平均数和标准差。结果 断乳后每周的平均每日饮水量,雌性大鼠:19.3±1.3, 27.7±1.8, 31.4±2.0, 30.9±3.6, 32.6±2.2, 35.1±3.2, 34.6±3.2, 37.5±3.3, 40.2±4.7和(38.5±3.4)g·d^-1,10周平均(32.8±2.1)g·d^-1;雄性大鼠:21.4±1.9, 30.8±1.2, 39.0±2.5, 44.9±2.5, 45.5±3.3, 48.7±4.2, 48.1±5.1, 47.9±4.6, 50.6±4.6和(50.8±6.2)g·d^-1,10周平均(42.8±2.9)g·d^-1。断乳后每周的单位体重饮水量,雌性大鼠:220.4±10.0, 210.6±15.7, 186.5±15.9, 154.2±20.3, 147.7±9.8, 147.6±13.4, 137.8±13.4, 142.9±14.0, 147.8±17.1和(137.3±14.5)g·kg^-1·d^-1,10周平均(163.3±8.8)g·kg^-1·d^-1;雄性大鼠:221.6±18.0, 194.9±11.1, 175.6±11.3, 157.2±9.7, 134.2±9.2, 127.4±9.8, 115.2±10.4, 107.1±9.8, 107.5±9.0和(103.5±12.1)g·kg^-1·d^-1,10周平均(144.4±8.3)g·kg^-1·d^-1。孕鼠孕期每周的平均每日饮水量分别为46.1±5.7, 54.1±7.7和(64.0±8.5)g·d^-1,3周平均(54.8±6.4)g·d^-1;单位体重饮水量分别为169.3±28.7, 176.1±22.5和(173.9±19.8)g·kg^-1·d^-1,3周平均(173.1±20.2)g·kg^-1·d^-1。母鼠哺乳期每周的平均每日饮水量分别为67.0±13.0, 88.6±19.8和(104.3±20.8)g·d^-1,3周平均(86.6±16.0)g·d^-1;单位体重饮水量分别为204.4±27.9, 255.0±42.6和(291.9±61.5)g·kg^-1·d^-1,3周平均(250.4±36.5)g·kg^-1·d^-1。结论 饮水量是毒理学动物试验重要观察指标,从历史数据获得相关正常参考值,对以后的试验设计,尤其是经口饮水染毒的试验具有一定的参考意义。对本次数据分析可见,哺乳期饮水量最高,孕鼠的饮水量明显高于交配前雌鼠的饮水量。
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  T13.5 Epigenetic transgenerational actions of dibutyl phthalate and male fertility

  WU Wei;YUAN Bei-lei;LU Jing;LI Jing;GU Hao;CHEN Min-jian;DU Gui-zhen;WU Di;LU Chun-cheng;XIA Yan-kai;WANG Xin-ru;

  2013, 27(S1): 245-246.

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  Increased occurrence of reproductive disorders has raised concerns regarding the impact of endocrine-disrupting chemicals on reproductive health, especially when such exposure occurs during fetal life. Spermatogenesis is a strictly regulated process, at both the transcriptional and the posttranscriptional level, which allows continuous gamete production throughout adulthood. A novel mechanism of posttranscriptional control mediated by microRNAs (miRNAs) has lately emerged as an important regulator of spermatogenesis. This study sought to investigate the epigenetic transgenerational effect of endocrine disrupting chemical dibutyl phthalate (DBP) on male fertility. Gestationg female rats were dosed with corn oil or DBP (5, 50, or 500 mg^-1·kg·d^-1, per os) during the period of gonadal sex determination (between embryonic days 8 and 15). We determined the expression levels of 760 mature miRNAs in F3 rat testes with or without prenatal DBP exposure using a miRNA microarray technique, verified by quantitative real-time PCR from F1 to F4. Dose-realted effects on male offspring included reduced sperm counts, sperm motility, and testicular and epididymal malformations. Of the screened miRNAs, 7 miRNAs were up-regulated and 212 miRNAs down-regulated (fold change>2) when compared with controls in 5 mg·kg^-1·d^-1 DBP treated group. There were 6 miRNAs up-regulated and 212 down-regulated in 500 mg·kg^-1·d^-1 DBP treated group. The target genes of 15 aberrantly expressed miRNAs (fold change>8) were involved in PI3K-Akt signaling pathway, Axon guidance, ErbB signaling pathway, Focal adhesion and Prostate cancer. We found permanent alterations in expression levels of multiple miRNAs suggesting an epigenetic mechanism of action. We propose that the deleterious effects of DBP on the male reproductive system are mediated by aberrantly miRNA expression in the testes. Overall, these results suggest that DBP can alter miRNA expression in F3 testes, a potentially novel mode of DBP transgenerational effect.
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  T13.6 DBP/MBP, DEHP/MEHP影响睾丸间质细胞睾酮合成相关机制

  周庆红;张静姝;陈曦;汤乃军

  2013, 27(S1): 246-246.

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  目的 探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)及其主要代谢产物邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)及其主要代谢产物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)对小鼠睾丸间质瘤细胞睾酮合成相关机制的影响,以期对邻苯二甲酸酯(PAE)生殖毒性的分子机制进行探索,为内分泌干扰物对人类潜在影响的研究提供科学依据。方法 CCK-8法测定DBP, MBP, DEHP和MEHP对小鼠睾丸间质瘤MLTC-1细胞毒性,确定染毒剂量。直接化学发光法测定细胞培养上清中的睾酮水平。运用实时荧光定量PCR检测P450scc, 3β-HSD, P450c17, INSL3 mRNA的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测INSL3蛋白表达水平的变。结果 根据检测结果确定DBP/MBP染毒剂量为:对照组(0 μmol·L^-1)、0.1、10、1000 μmol·L^-1; DEHP, MEHP染毒剂量为:对照组(0 μmol·L^-1)、0.001、0.1、10 μmol·L^-1。染毒24 h后,细胞合成睾酮的水平均随着染毒剂量的增加表现为先增加后下降的趋势。荧光定量PCR结果表明,DBP, MBP 均能抑制P450scc, 3β-HSD, P450c17 mRNA表达。低剂量 的DEHP处理组,三个基因表达水平都显著增加(P<0.05)。DEHP处理组,3β-HSD, P450c17 mRNA表达水平与对照组相较显著增加(P<0.05)。DBP和MBP抑制INSL3 mRNA表达水平,随染毒剂量的升高逐渐下降;DEHP和MEHP组,Western Blot结果与RT-PCR结果基本一致。结论 低剂量的DBP, MBP, DEHP和MEHP能刺激MLTC-1细胞增殖活性,随浓度的增加,MLTC-1细胞活性逐渐降低。DBP, MBP组DEHP和MEHP低剂量刺激,高剂量抑制MLTC-1细胞睾酮合成水平。实验中DBP, MBP能降低睾酮合成相关酶基因的表达水平,并能抑制INSL3基因蛋白表达水平;染毒剂量相对较低的DEHP和MEHP对睾酮合成途径的相关酶基因和蛋白的表达具有促进作用。DBP, MBP组DEHP和MEHP对基因表达的影响与睾酮合成变化之间存在一定的因果关系。
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  T13.7 肝微粒体体外活化对丁烯酸内酯体外发育毒性的影响

  郭隽;张立实;彭双清

  2013, 27(S1): 246-247.

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  目的 应用肝微粒体体外转化体系,进一步评价镰刀菌毒素丁烯酸内酯(BUT)体外发育毒性。方法 取孕9日雌性大鼠子宫,迅速将分离下的蜕膜团放入含有足量平衡盐溶液的培养皿中,剥离后保留脏层卵黄囊。选取体节3~5胚胎移入含有大鼠即刻离心血清培养瓶中。充入混合气体后37℃培养箱中旋转培养48 h。雄性大鼠腹腔注射多氯联苯500 mg·kg^-1,第5日取肝制备成微粒体混悬液,分装于塑料管中。采用BCA法对肝微粒体进行蛋白定量,环磷酰胺进行活性验证。研究共分为12组,即空白对照组,肝微粒体对照组,BUT组(浓度分别为0.625, 1.25, 2.5, 3.75和5.0 g·ml^-1),肝微粒体+BUT组(浓度分别为0.625, 1.25, 2.5, 3.75和5.0 g·ml^-1),每组20只胚胎,培养结束后测定卵黄囊直径、颅臀长、头长、体节数作为胚胎生长发育的指标,根据Brown法评分对器官形态分化进行评价。结果 BUT 1.25 g·ml^-1可导致胚胎头长、颅臂长,体节数均下降,BUT 2.5 g·ml^-1可致胚胎形态学评分下降,存在剂量反应关系且其差异具有统计学意义。BUT可致胚胎出现头部局部出血,头部出血,腭板出血,前脑、中脑、后脑均发育不全,尾神经管未闭合,心脏未见房室分隔多种畸形表现。肝微粒体体外转化后,BUT对胚胎的损伤作用较BUT的直接毒性作用减轻,2.5 g·ml^-1剂量组,颅臂长、头长等参数较对照组降低,但未观察到明显畸形表现。3.75 g·ml^-1浓度BUT作用下,与对照组比较,胚胎头长,颅臂长等生长发育下降,体节数减少,形态学评分下降,差异具有统计学意义,出现翻身转位,心脏异常等畸形表现。BUT 5.0 g·ml^-1剂量组表现出神经管未闭合,体节紊乱,心脏未见房室分隔,等多种畸形表现。结论 BUT可被体外活化系统转化,且转化后产物的胚胎毒性作用明显减轻,提示可能主要是一种解毒机制。
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  T13.39 玉米赤霉烯酮通过提前激活下丘脑-垂体-性腺轴诱发幼龄雌性大鼠性早熟

  杨嵘;王以美;张丽;彭双清

  2013, 27(S1): 263-264.

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  目的 观察镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮(ZEA)染毒后对雌性幼龄大鼠性发育过程中丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)功能的影响,探讨其诱发雌性性早熟的分子机制,为全面认识ZEA污染对儿童性发育的影响提供实验依据。方法 15日龄雌性SD大鼠,按体重随机分为ZEA 0.2, 1和5 mg·kg^-1染毒组、溶剂对照组和阳性对照组(50 μg·kg^-1雌二醇-E2),每日1次经口灌胃染毒,连续染毒5 d。实验中分两个部分检测ZEA对HPGA功能的影响。第一部分:分别观察染毒后各组大鼠阴门开启平均日龄(VO)和第一个发情间期出现的平均日龄(D1)及性周期稳定后第一发情期平均日龄(E1),于阳性对照组和溶剂对照组大鼠阴门开启及第一个发情间期出现当日分别眼眶静脉丛采血,其余各组等数量采血,检测以上4个时间点大鼠血清中黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌激素(E2)的水平。第二部分:分别于染毒后阳性对照组和溶剂对照组大鼠出现第一个发情间期当日处死,同时等数量处死其余各组大鼠,测量以上两个时间点各组大鼠卵巢、子宫与阴道的脏器系数,以及卵巢黄体出现率;实时PCR法测定下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)mRNA和垂体GnRH受体(GnRHR)mRNA表达水平;Western blot法测定下丘脑GnRH蛋白的表达量。结果 与溶剂对照组相比,中、高剂量ZEA及E2染毒后,大鼠VO, D1及E1均显著提前(P<0.05),不同时间点大鼠血清FSH, LH, E2水平均高于溶剂对照组(P<0.05)。与溶剂对照组相比,ZEA诱导大鼠子宫与卵巢系数及卵巢黄体出现率升高;ZEA及E2组大鼠下丘脑GnRH mRNA和垂体GnRHR mRNA表达量升高,下丘脑GnRH蛋白表达量也呈升高趋势。结论 E2作为阳性对照,可诱导幼龄雌性大鼠性早熟,证实了本研究体系的可行性和结果的可靠性;ZEA通过提前激活下丘脑-垂体-性腺轴,使大鼠青春期提前启动,导致大鼠性早熟。
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  T13.8 二硫化碳染毒对雄性大鼠生殖功能的影响及线粒体膜通透性的干预作用

  董煜;郭寅生;王为;张振;周义军;黄晓彧;陈国元

  2013, 27(S1): 247-247.

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  目的 观察二硫化碳(CS₂)对雄性大鼠生殖功能的影响及初步探讨线粒体膜通透性(MPTP)对这种改变的干预作用。方法 48只SD雄性大鼠随机分为6组:对照组,CS₂ 50, 250和1250 mg·m^-3染毒组,环孢素A(CSA)干预组和氯尼达明(LND)(MPTP开放剂)干预组(两个干预组均给予CS₂ 1250 mg·m^-3),采用静式吸入染毒,2 h·d^-1,5天/周,共10周,CSA和LND干预组在染毒的同时分别以12.5和25 mg·kg^-1浓度进行灌胃,1 次/d,共10周。染毒结束后,称量各组大鼠体重及其睾丸、附睾脏器重,计算脏器系数,测量睾丸横径,计数精子相对总数、精子活动率及分级、精子畸形率等。利用透射电镜观察生精细胞超微结构的改变。同时检测MPTP干预剂的干预作用。结果 随着CS₂染毒浓度的增加,各组大鼠体重,睾丸、附睾脏器系数,睾丸横径呈现不同程度的降低,尤以高剂量组明显(P<0.05)。精子总数、活动率及精子各运动参数等与对照组相比也有明显的降低,精子畸形率则高于对照组(P<0.05)。电镜结果显示CS₂染毒可造成生精细胞线粒体嵴减少或消失,甚至发生线粒体肿胀、形成空泡。MPTP抑制剂CSA对CS₂导致的生殖细胞的毒性有一定的拮抗作用,而开放剂LND则进一步加剧病变的发生。无论是睾丸、附睾脏器系数还是精子质量各指标都相应的增加或减少,LND干预组电镜结果出现生精细胞系层次的减少。结论 不同浓度CS₂染毒可以造成雄性大鼠睾丸、附睾不同程度萎缩,脏器系数降低,睾丸横径减小,精子数量、质量下降,生精细胞超微结构发生改变,最终导致生殖功能障碍,MPTP在此过程中发挥重要作用。
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  T13.9 类固醇生成因子1和肾上腺发育不全相关基因-1在毒理学研究中的应用

  胡艳辉;王玉邦

  2013, 27(S1): 247-248.

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  类固醇生成因子-1 (SF-1) 和X染色体上与剂量敏感的性逆转-先天肾上腺发育不全相关基因-1(DAX-1)两者均是孤儿核受体家族成员。二者在许多相同的位置如性腺、肾上腺皮质和腺垂体促性腺激素细胞等均有表达,其功能主要与肾上腺和性腺发育有关。然而针对SF-1和DAX-1二者如何受到外界因素的调控,以及与其他转录因子之间的交互关系等,还有待于进一步研究。同时,今后还可以从表观遗传学、发育毒理学和生殖毒理学等角度,结合人群外环境化学物暴露水平,深入探讨对SF-1和DAX-1表达的影响及相关作用机制,从而有利于综合评价二者在毒理学中的作用。本文主要从SF-1和DAX-1的结构、表达及其作用阐述了二者在肾上腺皮质和性腺分化方面的作用。
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  T13.10 RIS327对大鼠的生殖和发育毒性

  张乐;宋宏宇;柴云芳;覃少华;许雪萍;闵旸

  2013, 27(S1): 248-248.

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  目的 在GLP条件下,检测RIS327对雄性和雌性动物的生殖性能是否产生影响,为进一步的生殖/发育毒性或相关研究提供基础。方法 建立RIS327在溶媒中的分析方法并进行方法学验证。对RIS327在溶媒中的稳定性进行分析测试,并定期取样进行均一性分析。设一个溶媒对照组和三个剂量组,每组20只动物,雌雄各半。采用经口灌胃给药方法,连续给药两周后雌雄大鼠交配,交配结束后雌性大鼠继续给药,受孕雌鼠产后第4天解剖,没有交配成功的雌鼠在交配期结束后持续给药24 d后解剖;雄鼠在交配结束后继续给药14 d后解剖。实验期间进行大鼠一般症状观察、体重和剩食称量、分娩观察、幼仔外观检查、解剖检查及病理组织学检查。结果 配制的不同浓度的供试品混悬液浓度准确、均一。RIS327对雌、雄大鼠的一般状态没有明显影响,对母鼠的哺乳情况和仔鼠的一般状态没有影响,各剂量组雌鼠妊娠期正常,未观察到外观畸形和身躯短小的幼鼠,统计结果显示,与溶媒对照组相比,各剂量组动物的平均体重、体重增长和食物消耗没有显著性差异;黄体数、着床数和产仔数没有显著性差异;0和4 d雌雄仔鼠数没有显著性差异;除个别动物外,各组动物的大体解剖未见异常;中剂量组雄鼠附睾重量及附睾体重比与溶媒对照组比较有显著性差异(P<0.05),其他剂量组动物睾丸、附睾和卵巢的绝对脏器重量及相对脏器重量没有显著性差异;高剂量组(600 mg·kg^-1)所有雄性动物的睾丸、附睾、前列腺、精囊以及雌性动物的卵巢、子宫和阴道均未发现与该药物有关的生殖和发育毒性的病理改变。结论 在600 mg·kg^-1剂量下,RIS327对雌雄大鼠的一般状态没有影响,对体重和食物消耗没有影响,对母鼠的生殖能力、哺育能力及仔鼠的生长均无影响。
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  T13.23 X射线交叉互补修复基因1在小鼠精子发生过程中的作用

  徐诚;顾爱华;王心如

  2013, 27(S1): 255-255.

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  目的 X射线交叉互补修复基因1(XRCC1)参与精子发生过程以及调控精子机制。方法 本研究运用cre-loxp条件性基因打靶,DNA琼脂糖凝胶电泳,原位杂交,免疫组化,免疫印迹,Tunnel凋亡实验,实时荧光定量PCR和基因芯片信息学等多种分子生物学方法,利用小鼠模型探讨XRCC1在精子发生过程中的作用及其分子机制。结果 首先我们通过原位杂交和免疫印迹实验验证了该条件性敲除小鼠模型的成功构建。我们初步证实了:① XRCC1在精子发生过程中起一定的作用。处理组的小鼠睾丸外观大小和重量明显小于对照组,并且处理组的产仔率也显著低于对照组。② HE染色切片观察到处理组的部分睾丸曲细精管有明显缺失,附睾中精子数目也显著小于对照组。③ Tunnel结果发现处理组睾丸石蜡切片有明显凋亡迹象,这可能是未能对减数分裂时DNA损伤进行及时修复,从而诱发凋亡途径。④ 为进一步研究为何XRCC1的缺失能导致上述结果,我们后续利用实时荧光定量PCR发现处理组睾丸组织线粒体基因组在转录水平上有改变。由于已有研究报道XRCC1本身作为脚手架蛋白,并没有酶催化活性以及XRCC1并不直接参与线粒体基因组损伤的修复。结论 Xrcc1的缺失显著影响精子发生过程。提示XRCC1参与了精子发生这个过程,并间接的通过保护线粒体基因组的稳定性和完整性,从而保证精子发生过程的正常。
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  T13.24 小鼠胚胎干细胞实验评价十溴联苯醚的胚胎发育毒性

  程薇;于卓;王艳;

  2013, 27(S1): 255-256.

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  目的 本研究通过胚胎干细胞向心肌及神经前体细胞分化的胚胎干细胞试验(EST)模型来评价十溴联苯醚(BDE209)的发育毒性。方法 体外培养小鼠成纤维细胞3T3和小鼠胚胎干细胞(ES)系R1,并定向诱导ES细胞分化为心肌或神经前体细胞,使细胞暴露于不同浓度的模式化合物后,通过MTT和定量PCR计算各化合物的半数致死剂量(IC₅₀)和半数分化抑制剂量(ID₅₀),并根据欧洲替代方法研究中心(EURL ECVAM)提出的胚胎毒性评价方法,进行胚胎毒性评价。此外,通过定量PCR和免疫荧光染色的方法检测BDE209对ES细胞分化为心肌或神经前体细胞相关特异性基因及蛋白表达的影响。结果 ① 成功建立了EST模型;② 诱导ES细胞分化为心肌或神经前体细胞的2种EST均判断BDE209为弱胚胎毒性化合物;③ BDE209对ES细胞神经分化和心肌分化的影响均为剂量依赖性,且对神经分化更为敏感。 结论 BDE209为弱胚胎毒性化合物,在ES细胞向心肌及神经前体细胞分化早期即产生影响。
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  T13.12 8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1基因(ogg1)在保护斑马鱼胚胎心脏祖细胞功能中的作用

  严丽锋;周勇;余山河;吉贵祥;王磊;刘微;顾爱华;

  2013, 27(S1): 249-249.

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  目的 利用斑马鱼模型,研究ogg1基因在心脏发育中的功能及其对心脏祖细胞的调控机制进行研究。方法 采用斑马鱼模型对ogg1功能进行可视化研究及基因调控分析。运用吗啉代技术(MO)在胚胎显微注射敲除ogg1。通过原位杂交、心跳计数、心肌细胞计数等评价心脏形态及功能缺陷,利用p53^-/-突变鱼系、Brdu抗体荧光染色等描述:ogg1缺失后,发生于心脏发育中的DNA损伤,增殖及凋亡的分子机制。通过基因芯片信息学分析及原位杂交检测,探讨相关信号通路调节。结果 原位杂交结果显示ogg1基因主要表达于前侧板中胚层、原始心管以及胚胎心肌层。ogg1缺失导致严重的心脏形态及功能缺陷,包括:心脏长度缩短、心律不齐、心肌细胞以及nkx2.5⁺标志的祖细胞数量减少。这些心脏的表型可能是由ogg1缺失引起的凋亡增加、增殖抑制所致。芯片分析结果显示,ogg1缺失后,参与胚胎心管形态和心脏结构形成的基因的表达情况发生改变。其中,叉头转录因子H1(foxh1)是ogg1参与心脏发育过程中DNA损伤应答的共同基因。结论 ogg1在斑马鱼心脏祖细胞和心脏发育中发挥着重要作用。该发现有助于探讨ogg1不足所致的心脏发育易损性的病因学基础,或可为心脏发育异常的治疗提供了新的策略。
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  T13.13 SD大鼠生殖毒性试验相关参数正常参考值探讨

  黄雅丽;顾刘金;金锋;洪雅青;陈琼姜;陶核;朱勇;金爱华;徐娟;杨校华;张芳芳;黎关龙;孙建析

  2013, 27(S1): 249-250.

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  目的 对实验室已有生殖毒性毒理学资料进行统计分析,以获得本实验室生殖毒性相关参数的参考值范围。方法 对已有历史数据即8个批次的两代繁殖毒性试验对照组SD大鼠资料和14个批次的生殖和发育毒性筛选试验对照组SD大鼠资料进行统计分析。在两代繁殖毒性试验中,产后4 d,如每窝幼鼠多于8只,调整为8只,性别比尽量调整为4:4。观察终点包括雌性大鼠受孕和生产情况,窝重、窝大小和幼鼠性别比。采用t检验对各繁殖指数包括交配成功率、受孕率、活产率、出生存活率、哺育成活率及窝重、窝大小和性别比等进行统计学分析。结果 SD大鼠交配成功率94.75%(83.33%~100%),受孕率92.21%(75.00%~100.00%), 活产率98.43%(90.91%~100.00%),出生存活率95.31%(86.57%~100.00%),哺育成活率95.75%(89.74%~99.40%);出生0 d,4 d(窝调整前), 4 d(调整后),7, 14, 21 d的窝重分别为81.62±17.56, 124.38±27.24, 81.34±12.79, 126.39±21.79, 244.28±47.48和389.17±76.17;窝大小分别为12.74±3.59, 12.26±3.05, 7.79±0.86, 7.69±0.91, 7.53±1.13和7.50±1.12;性别比(♀/♂)分别为1.022, 1.033, 0.997, 0.999, 1.007和1.015;仔鼠平均体重分别为6.51±0.82, 10.35±1.62, 10.53±1.74, 16.49±2.43, 32.51±4.97和51.88±6.88;其中雌性仔鼠平均体重分别为6.44±2.31, 10.18±1.59, 10.28±1.68, 16.18±2.38, 32.19±7.18和50.81±7.59,雄性仔鼠平均体重分别为6.76±2.84, 10.57±1.89, 10.76±1.84, 16.81±2.57, 32.96±4.92和52.93±8.17,雌雄大鼠间P值分别为0.06568, 0.00090, 0.00035, 0.00084, 0.10004和0.00046。结论 从生殖毒性毒理学试验历史数据获得相关参数的正常参考值,对以后的试验具有一定的参考意义。本次数据汇总可见,哺乳期雄性仔鼠体重大于雌性仔鼠体重,其中4, 7和21 d雌雄仔鼠间的差异有统计学意义,因此建议将雌雄仔鼠分开进行统计分析。
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  T13.14 膳食诱导肥胖对雄性小鼠生殖影响及机制

  赵剑;翟玲玲;刘铮

  2013, 27(S1): 250-250.

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  目的 探讨氧化应激与肥胖引起生殖功能低下的关系。方法 本研究所用实验动物为8周龄c57bl/6雄性小鼠,随机分为对照组和实验组。对照组给予基础饲料,实验组给予高脂饲料,每周称重1次。在实验8周末,小鼠下腔静脉取血后断头处死,分离睾丸,进行精子数量和活动度检测,并进行透射电镜观察,采用生化方法测定分别检测睾丸组织的MDA,H₂O₂, T-AOC, GSH, SOD, GSH-PX和CAT水平。结果 实验前3周小鼠体质量并无明显差异,实验第7周,高脂饲料喂养小鼠体重开始分化,DIO组小鼠体重显著高于DIO-R组和对照组小鼠,到实验8周结束时,DIO组小鼠体重仍显著高于DIO-R组和对照组小鼠;DIO-R组与对照组小鼠相比体重始终没有显著性差异。DIO和DIO-R和对照组小鼠的精子数无显著差异;DIO小鼠和DIO-R小鼠的精子活动度低于对照组小鼠,其中DIO小鼠的精子活动度显著低于对照小鼠。电镜观察睾丸形态结果可见:肥胖小鼠睾丸间质细胞可见大量脂肪细胞,脂滴核型不规则,核内异染色质边集。抗氧化结果可见,DIO小鼠的MDA,H₂O₂ 水平高于对照小鼠,DIO-R小鼠的MDA和H₂O₂水平高于对照小鼠,而DIO和DIO-R小鼠CAT水平显著低于对照组,其他指标变化未见差异。结论 肥胖能降低小鼠的精子活动度,其机制可能与肥胖发生后睾丸组织的自由基与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应增强,机体精子细胞受到自由基严重的攻击,导致精子膜损伤,损害生殖细胞的功能有关。
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  T13.15 矮壮素的产前发育毒性

  刘莹娟;吴双;尚兰琴;郝卫东

  2013, 27(S1): 250-251.

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  目的 研究植物生长调节剂矮壮素(氯化氯代胆碱)对大鼠产前胚胎-胎仔发育的毒性作用。方法 将SPF级SD大鼠按照雌:雄=2:1的比例在9:00 am合笼,于11:00 am对雌鼠进行阴道涂片检查,以发现阴栓或查到精子为妊娠首日(E0),并认为受孕时间为10:00 am。在E0将孕鼠随机分为溶剂对照组(蒸馏水)、低剂量组(75 mgkg^-1)、中剂量组(150 mg·kg^-1)、高剂量组(300 mg·kg^-1)及维生素A(VitA)阳性对照组(20 只/组),3 d秤一次孕鼠体重及摄食量。矮壮素给药时间为E6-E20,VitA给药时间为E6-E15,于E21麻醉处死孕鼠,记录窝重、黄体数、吸收胎、死胎数、活胎数,测量胎鼠生长发育指标(体重、体长、尾长),观察胎鼠性别、外观畸形等。之后将1/2的胎鼠用Bouin's液固定以检查内脏畸形,另1/2用80%的酒精固定以检查骨骼畸形。结果 矮壮素给药后,与溶剂对照组相比,低剂量组孕鼠体重无明显变化,中剂量组略有降低,高剂量组明显降低;中、高剂量组孕鼠的摄食量明显下降,且总食物利用率也有所降低,其中,中剂量组与溶剂对照之间存在统计学差异(P<0.05)。同时,中剂量组孕鼠流产数(7只)也高于其他组(各1只)。各组均有吸收胎, VitA组较多(32例),其他组相对较少(各约10例)。孕鼠的窝重、卵巢重、黄体数、每窝活胎数以及胎鼠性别比在各组间无显著性差异,但胎鼠的生长发育指标(体重、体长、尾长)及胎盘重都有随矮壮素剂量的提高呈先增高后下降的趋势。低剂量组生长发育指标高于对照组,之后随剂量增加各指标相应降低,其中胎鼠体重的变化趋势最明显,溶剂对照组胎重(5.67±0.44)g,低剂量组(5.85±0.59)g明显高于溶剂对照 (P<0.05),中剂量组(5.66±0.45)g明显低于低剂量组(P<0.05),高剂量组(5.33±0.57)g明显低于其他各组(P均<0.05)。低、中剂量组胎盘重略高于溶剂对照,高剂量组胎盘重明显降低(与低、中剂量相比P<0.05)。除VitA组外,与溶剂对照组相比其他各组畸形率未见有显著性增加。结论 矮壮素在中、高剂量下具有一定母体毒性,在试验剂量下虽无明显致畸作用,但对胎鼠的生长发育水平及胎盘的发育有一定影响,低剂量下表现为促进作用,剂量增加后又逐渐表现为抑制作用。因此推测矮壮素具有一定发育毒性,但具体的作用机制有待进一步研究。
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  T13.16 低剂量双酚A的神经发育毒性及其机制

  刘然;蒋建军;尚兰琴;吴双;孔丹;王宛怡;郝卫东

  2013, 27(S1): 251-252.

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  目的 探索低剂量双酚A(BPA)的神经发育毒性以及信号转导通路在其中的作用。方法 低剂量BPA(10^-6, 10^-8, 10^-10和10^-12 mol·L^-1)作用于原代培养大鼠胚胎中脑细胞,观察中脑细胞的增殖和集落分化情况;利用Western blot 法检测神经前体细胞特异性标志物nestin、星形胶质细胞特异性标志物GFAP、神经元特异性标志物NeuN的蛋白表达情况,应用荧光定量PCR法检测nestin、GFAP、成熟神经元标志物NSE、不成熟神经元标志物tublin3、细胞增殖因子Ki67、notch通路受体notch1及其下游转录因子(Hes1、Hes5、math3和ngn2)mRNA表达情况。孕鼠随机分为3组,每组15只,从妊娠第6天(GD6)至仔鼠出生后第1天(PND1)经口给予0, 50 μg·kg^-1和50 mg·kg^-1的BPA。检测妊娠第14天和第18天和出生后第一天子代端脑发育情况:Western blot法检测nestin, GFAP和NeuN的蛋白表达情况,应用荧光定量PCR法检测nestin, GFAP, NSE, tublin3和Ki67 mRNA表达情况,免疫荧光法检测子代端脑nestin, Ki67和GFAP的表达情况。Western blot 法检测ERK和JNK磷酸化水平,荧光定量PCR法检测notch1, Hes1, Hes5, math3和ngn2 mRNA表达情况。结果 低剂量水平的BPA不影响原代培养中脑细胞的增殖和集落的分化,但可降低tublin3 mRNA表达水平,增加GFAP 蛋白和mRNA表达水平;显著增加Notch通路受体Notch1及其下游效应转录因子(ngn2和math3)mRNA的表达水平。孕期暴露低剂量BPA(50 μg·kg^-1)可以增加GD14, GD18和PND1子代端脑nestin mRNA和蛋白表达水平,增加细胞增殖因子Ki67 mRNA表达水平;免疫荧光染色显示BPA染毒组各时期子代端脑nestin和Ki67表达阳性细胞显著增加;低剂量BPA可增加GFAP蛋白和mRNA表达水平。50 μg·kg^-1 BPA可以增加ERK磷酸化水平,调节notch1, Hes1, Hes5, math3和ngn2 mRNA表达水平。结论 ① 低剂量BPA虽然不影响原代培养中脑细胞的增殖和分化,但可抑制新生神经元的分化,促进其向星形胶质细胞分化。② 孕期暴露低剂量BPA(50 μg·kg^-1)可以促进细胞增殖,促进神经前体细胞自我更新,此作用可能是通过激活ERK产生的。③ 孕期暴露低剂量BPA(50 μg·kg^-1)可以促使神经前体细胞提前分化,并促使细胞向星形胶质细胞方向分化,Notch通路和bHLH家族可能参与了这一效应。
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  T13.25 邻苯二甲酸酯DEHP对雄性幼鼠抗雄激素作用及其机制

  李小林;Evandro Fei Fang;邱璐;李健;郭红卫;卞俐娜;张丽婷

  2013, 27(S1): 256-256.

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  目的 邻苯二甲酸酯是一类广泛应用于化妆品、药品、PVC、个人护理产品的合成化学物,每年使用超过300万吨。DEHP是作为常用的邻苯二甲酸酯之一,其应用非常广泛。多项研究均表明DEHP具有环境内分泌干扰物效应,本研究主要关注邻苯二甲酸酯DEHP对未成年雄性大鼠抗雄激素效应并对其具体机制进行研究。方法 SD雄性幼鼠从PND10~PND24每天经口染毒玉米油或DEHP(20, 100, 500和1000 mg·kg^-1),氟他胺(50 mg·kg^-1)作为阳性对照,染毒14 d后分离并称重大鼠组织器官如心脏、肝、脾、肾、肾上腺及雄激素依赖组织睾丸、附睾、前列腺、精囊腺、LABC等,测量大鼠肛门生殖器距离。将大鼠肝、睾丸制成病理切片,进行H&E染色和TUNEl染色,观察组织病变及细胞凋亡情况。结果 邻苯二甲酸酯DEHP能够显著降低雄激素依赖组织大鼠睾丸、精囊腺、前列腺、附睾重量及LABC值,并具有一定的剂量效应关系,大鼠睾丸HE染色显示高剂量组DEHP引起生精小管精原细胞减少,部分出现凝固性坏死;TUNEL染色显示高剂量DEHP引起细胞凋亡明显增加。大鼠肝脏器系数随DEHP剂量增加而增加,肝HE染色显示肝细胞中度脂肪变性,偶见点状坏死。结论 DEHP能够损害雄性幼鼠雄性生殖系统,具有抗雄激素作用,DEHP引起大鼠睾丸细胞凋亡可能是其主要机制之一。
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  T13.26 印记基因H19甲基化在宫内暴露p,p’-DDE致雄性生殖毒性中的作用

  宋杨;王思梦;高明;吴南翔

  2013, 27(S1): 256-256.

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  目的 探讨印记基因H19 DMR甲基化在宫内暴露p,p'-DDE导致雄性子代生殖毒性中的作用。方法 母鼠交配成功后,于孕8~15 d灌胃给予p,p'-DDE(玉米油溶解)100 mg·kg^-1,另设溶剂对照组采用玉米油灌胃,孕鼠自由分娩,保留所有雄性仔鼠,保证每窝总数10只,雄鼠不够的用雌鼠补齐。测量雄性仔鼠肛殖距,观察出生后第13天(PND13)检查乳头存留情况,PND35检查包皮分离情况,并在成年后处死,分离精子,亚硫酸氢钠基因组测序法检测H19 DMR甲基化水平,计算机辅助的DNA荧光染色精子分析系统(荧光CASA)测定精子形态学指标。结果 p,p'-DDE宫内暴露可诱导雄性子代乳头存留、肛殖距缩短、包皮分离时间延长、精子数量和活力下降、精子印记基因H19印记控制区甲基化水平下降。结论 印记基因重编程可能在宫内暴露p,p'-DDE致雄性生殖毒性中起重要作用。
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  T13.27 氟化钠对雌性小鼠生殖功能及仔鼠行为的影响

  周健;李宏辉;杨惠芳;刘秀芳;朱玲勤;黄敏;李志梅;崔艳红

  2013, 27(S1): 257-257.

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  目的 研究氟化钠对雌性小鼠生殖功能及对子代行为的影响。方法 成年健康雌性小鼠随机分为对照组(蒸馏水),氟化钠10, 20和 40 mg·kg^-1组,测量雌性小鼠孕前体重增长量、动情周期、孕后母鼠增重、子宫重、胎盘重,胎仔存活情况。选择同一天出生哺乳25 d的仔鼠,每组5只。通过旷场实验检测仔鼠行为学改变。结果 氟化钠引起雌性小鼠动情期缩短、胎盘重量增加、活胎数减少(P<0.05);旷场实验中氟化钠能引起仔鼠中央格停留时间延长、穿格数减少(P<0.05)。结论 高氟对雌性小鼠的生殖功能和仔鼠行为有一定的影响。
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  T13.28 FIGLA, H1FOO和AMH基因的表达在青春期前双酚A干扰卵泡发育中的作用

  李昱辰;刘谨;王文祥;朱建林;翁绍峥;肖世华;张文昌

  2013, 27(S1): 257-257.

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  目的 本研究通过青春期前较高浓度的双酚A(BPA)短期暴露,探讨其对卵泡生长发育的影响及其可能机制。方法 28日龄雌性Wistar大鼠腹腔注射BPA 10, 40和160 mg·kg^-1,对照组注射等容量的橄榄油,每天染毒1次,连续染毒1周。通过检测卵巢重量、各级卵泡构成、血清性激素水平来评估对卵巢结构和功能的影响;用实时荧光定量PCR分析检测卵泡发育相关基因基础螺旋环转录因子(FIGLA)、卵母细胞特有的H1连结组蛋白(H1FOO)、抗苗勒激素(AMH)的mRNA的表达水平,用Western blot和免疫组化法检测上述蛋白的表达水平。结果 青春期前BPA暴露会导致大鼠卵巢重量降低,卵泡数量减少,闭锁卵泡构成比增加,其余各级卵泡构成比减少。随着染毒剂量增加,促进卵泡发育的FIGLA, H1FOO基因mRNA及其蛋白表达水平下调,而抑制卵泡发育的AMH基因mRNA及其蛋白表达水平上调。结论 青春期前期BPA短期暴露可能会对卵泡发育和功能产生抑制作用。FIGLA, H1FOO基因表达水平下调,AMH基因表达水平上调可能在双酚A导致的卵泡发育毒性机制中发挥了重要作用。
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  T13.29 小鼠断乳后持续暴露大豆异黄酮对卵巢发育的影响

  王文祥;蔡淑凤;张文昌

  2013, 27(S1): 257-258.

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  目的 研究雌性小鼠断乳后暴露大豆异黄酮对卵巢发育的影响,为探讨大豆异黄酮对卵巢早期发育的干扰作用提供依据。方法 刚断乳雌性ICR小鼠,按体质量随机分为大豆异黄酮0, 50, 100和200 mg·kg^-1组,每日1次,持续5周。干预结束后测定实验前后体重变化、观察阴门开放时间、计算卵巢脏器系数及各级卵泡构成比改变。结果 低剂量组、中剂量组和高剂量组实验前后体重增加值低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。中剂量组和高剂量组卵巢脏器系数低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而低剂量组与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05)。与对照组比较,中剂量组阴门开放时间提前,差异具有统计学意义(P<0.05)。干预组成熟卵泡比例随着剂量增加呈下降趋势而闭锁卵泡呈上升趋势,高剂量组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 大豆异黄酮可干扰断乳后幼鼠卵巢发育。
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  T13.30 重金属镉通过类泛素化特异性蛋白酶1增强雄激素受体的转录活性

  武瑞琴;崔亚雄;苑晓燕;王以美;朱悦;赵君;彭双清

  2013, 27(S1): 258-258.

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  目的 研究重金属镉(Cd)对雄激素受体(AR)转录活性的影响,探讨Cd内分泌干扰毒性的机制。方法 二价镉是环境中Cd的主要存在形式之一,本研究选择CdCl₂为研究对象,用AR表达阴性的人胚肾HEK293细胞和AR表达阳性的前列腺癌LNCaP细胞分别就Cd对外源性和内源性AR转录活性的影响进行研究。用流式细胞技术分析Cd对细胞周期的影响;用双荧光素酶试验检测Cd对AR转录活性的影响;用实时PCR和Western blot方法检测Cd对AR及其下游正调控靶基因PSA以及SENP1的表达;用Co-IP方法检测Cd对AR类泛素化修饰水平的影响。结果 流式细胞术结果显示,Cd可以使LNCaP细胞的增殖指数增加;荧光素酶试验发现Cd可增强AR的转录活性;实时PCR和Western blot结果显示,Cd可增加AR下游靶基因PSA的表达水平,但AR本身的表达量没有明显变化,提示Cd不是通过改变AR的表达量影响AR的功能。鉴于此我们从翻译后修饰角度考虑,检测了Cd对去类泛素化酶SENP家族分子的影响,结果发现Cd可增加SENP1的表达;进一步利用基因沉默技术将LNCaP细胞中SENP1的表达敲降,发现Cd处理后,AR的表达不随SENP1变化,而PSA的表达随之减少,这表明Cd通过SENP1调控AR的转录活性;反过来将AR的表达敲降后,发现SENP1的表达随之降低,提示调控网络中,AR处于SENP1的上游;Co-IP的结果显示,Cd通过SENP1分子降低了AR分子的类泛素化水平,从而增强AR的转录活性。结论 ① Cd增强AR的转录活性,改变LNCaP细胞的周期,促进细胞增殖;② Cd通过上调去类泛素化酶SENP1,降低AR的类泛素化修饰水平,以实现对AR活性的调节;③ AR处于信号网络的上游,正调节SENP1的表达,SENP1又反过来抑制AR的类泛素化,增强AR的活性。
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  T13.31 孕期外源物暴露子代大鼠骨关节炎易感及宫内发生机制

  倪曲波;谭杨;汪晖;陈廖斌

  2013, 27(S1): 258-259.

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  目的 整体水平证实孕期外源物(咖啡因、尼古丁、乙醇)暴露所致宫内发育迟缓(IUGR)子代成年后骨关节炎(OA)易感现象,并探讨其共性发生机制。方法 Wistar雌性大鼠自然受孕后,分为正常对照组、地塞米松机制对照组、外源物(咖啡因、尼古丁和乙醇)暴露组。孕11~20 d给予以上不同因素处理,孕20 d各组选取12只孕鼠剖腹取胎鼠。称胎鼠体重并计算IUGR率;取胎血使用ELISA试剂盒检测皮质酮(CORT)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)浓度,收集胎鼠长骨关节标本,行组织化学分析骨/软骨结构变化、GenomeLabGexP多基因表达系统和免疫组化方法检测IGF-1信号通路及软骨发育相关基因表达。正常对照组和外源物组留取12只孕鼠自然生产并正常饮食喂养,每周测量仔鼠体重并计算体重增长率,21周后各组随机选取半数大鼠进行长距离跑步以诱导OA。各组行膝关节软骨大体评分、OA的Mankin评分及细胞外基质组化分析。结果 (1)仔鼠体重变化:孕期地塞米松、外源物(咖啡因、尼古丁、乙醇)暴露,可降低胎鼠体重(P<0.01),增加IUGR发生率(P<0.01);各外源物组IUGR仔鼠出生后出现追赶性生长,但至21周时各外源物组绝对体重和增长率较正常对照组无差别(P>0.05)。(2)成年大鼠OA易感现象:与正常对照组相比,外源物组的IUGR成年仔鼠关节软骨大体形态无明显改变,但长距离跑步后,其关节软骨墨汁染色大体评分升高(P<0.01)、软骨Mankin评分升高(10.8, 5.0和8.0,P<0.01),软骨Col2a1蛋白表达下降(P<0.01)。(3)胎鼠关节软骨发育不良:胎软骨组织番红O染色结果表明,地塞米松和外源物组关节软骨静止区厚度变薄、细胞数减少、染色变淡;免疫组化证实Col2a1表达降低。(4)胎软骨发育不良机制:胎血清生化结果表明,各外源物组血清CORT水平升高(P<0.01),而血清IGF-1水平降低(P<0.01)。胎长骨干骺端软骨IGF-1信号通路结果表明,地塞米和各外源物组关节软骨MEK1, MEK2, PI3K, AKT, Aggrecan和Col2a1的mRNA表达降低(P<0.05),IGF-1R, IRS1和IRS2的mRNA表达升高(P<0.05),而IGF-1的mRNA表达仅有降低趋势。免疫组化结果表明,关节软骨区IGF-1, IRS-1, AKT1/2, SOX9和Col2a1蛋白的表达均显著下降(P<0.01)。结论 孕期外源物暴露可引起 IUGR胎鼠关节软骨发育不良及成年后OA易感,其发生机制与宫内母源性GC过暴露所致胎关节软骨IGF-1信号通路蛋白表达降低有关。
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  T13.32 环磷酰胺单次静脉注射给药对家兔致畸试验

  万红平;魏鹏;佘步宏;McPherson SUE

  2013, 27(S1): 259-260.

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  目的 研究家兔于妊娠第11天单次静脉注射给予环磷酰胺后对胚胎-胎仔发育的影响。方法 采用供应商交配成功的24只SPF级新西兰白兔作为实验系统。于妊娠2天接收。将孕兔随机分成给药组与对照组共2组,每组12只(给药组有1只家兔未孕,对照组有2只家兔未孕,总受孕率为87.5%)。给药组于妊娠11 d耳缘静脉注射给予环磷酰胺30 mg·kg^-1·d^-1,对照组于妊娠6~18 d口服给予纯化水,每天1次。对动物每天进行存活率观察和临床症状观察,测定妊娠6,9,12,15,19, 22, 25和29 d体重,计算体重增重及妊娠期增重(妊娠29 d体质量-妊娠6 d体质量-妊娠子宫连胎仔重),测定妊娠6~7, 9~10, 12~13, 15~16, 19~20, 22~23, 25~26及28~29 d的摄食量。所有动物于妊娠29 d进行解剖和大体检查。检查卵巢和子宫,确定窝参数。未见着床的子宫放入硫化铵溶液以确定是否早期吸收。所有存活胎仔进行称重及外观检查,测定冠臀长及性别。每窝所有活胎仔进行内脏新鲜检查(胸、腹、盆腔),另取大约1/2胎仔的头部放入改良后的Davidson固定液中进行固定,用于头部内脏检查。剩余活胎仔用茜素红溶液染色,用于骨骼检查。结果 环磷酰胺对母鼠临床观察、体重及体重增重、妊娠期增重、摄食量及剖检大体检查结果均无影响,未见母体毒性。环磷酰胺对子宫内黄体数、着床数、活胎仔数、晚期死胎数、早期死胎数、吸收胎数、早期吸收胎数、着床前损失率、着床后损失率等窝仔参数均无影响,未见胚胎致死毒性。但环磷酰胺延缓家兔胎仔发育,表现为给药组胎仔体重及体长显著低于对照组。环磷酰胺致家兔胎仔畸形,表现为给药组胎仔外观畸形率(95.8%)、内脏畸形率(4.7%)及骨骼畸形率(91.7%)均显著高于对照组(外观、内脏及骨骼畸形率分别为0, 0及0.15%)。结论 环磷酰胺于妊娠11 d对家兔单次静脉注射给药30 mg·kg^-1·d^-1不引起家兔母体毒性及家兔胚胎致死毒性,但延缓家兔胎仔发育,引起胎仔体重及体长下降,致家兔胎仔外观、内脏及骨骼畸形。环磷酰胺可以作为较好的阳性对照品用于家兔生殖毒性实验。
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  T13.33 小鼠断乳后持续暴露大豆异黄酮对初成年期卵巢及血清钙、铁、锌含量的影响

  王文祥;蔡淑凤;张文昌

  2013, 27(S1): 260-260.

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  目的 研究断乳后持续暴露大豆异黄酮对初成年卵巢及血清钙、铁、锌含量的影响。方法 32只刚断乳雌性ICR小鼠,按体重随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,连续5周每天给予0, 50, 100和200 mg·kg^-1的大豆异黄酮灌胃。干预结束后取卵巢及血清经消化后,采用原子分光光度计测定钙、铁、锌含量。结果 与对照组比较,各干预组卵巢钙含量明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.01);低剂量组卵巢铁元素含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),而中、高剂量组铁含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);干预组卵巢锌元素含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,干预组血清锌元素含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。而血清钙、铁含量在各组间差别无统计学意义(P>0.05)。结论 断乳后暴露大豆异黄酮可降低卵巢中钙、铁、锌含量;升高血清锌含量;而对血清钙、铁含量无影响。
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  T13.34 生殖毒性试验中基准剂量法的应用

  顾刘金;徐娟;黄雅丽;朱勇;金爱华;洪雅青;陈琼姜;陶核;来伟旗;金锋;杨校华;张芳芳;黎关龙;孙建析

  2013, 27(S1): 260-261.

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  目的 应用基准剂量法对生殖和发育毒性筛选试验资料进行统计分析,以获得相应生殖毒性试验毒作用阀值,并与未见明显有害作用量法(NOAEL)进行比较。方法 应用基准剂量法对某化学物生殖和发育毒性筛选试验敏感观察终点-出生存活率及相关数据进行分析,采用软件为美国EPA的BMDS 2.40。BMR取值0.10,分别采用NLogistic, NCTR, Rai_and_Van_Ryzin三个统计模型进行统计分析。结果 本次生殖和发育毒性筛选试验对照、低、中、高试验组染毒剂量分别为:0.00, 42.73, 165.13, 800.65 mg·kg^-1·d^-1, 其出生存活率分别为:93.1, 86.0, 76.3, 60.0。高、中、低剂量组出生存活率与对照组相比(卡方检验)P值分别为:0.00000, 0.00037, 0.06411,因此按出生存活率,本试验NOAEL值为42.73 mgkg^-1·d^-1。基准剂量法NLogistic, NCTR, Rai_and_Van_Ryzin三个统计模型获得的BMDL(基准剂量可信限下限,Benchmark dose lower confidence limit)分别为9.64, 8.083, 11.44 mg·kg^-1·d^-1,拟合优度检验(卡方检验)P值分别为:0.9845, 0.9707, 0.9846,AIC(AIC信息准则)值分别为546.957, 549.469, 546.976。按照AIC信息准则,最适合的统计模型为NLogistic(AIC值最小),BMDL为9.64 mg·kg^-1·d^-1。结论 基准剂量法是Crump (1984年)首先提出的进行化学物质、物理因素等危险度评价的新方法,用于克服传统的危险度评价方法-NOAEL法存在的不足。一般统计分析方法将生殖毒性试验资料作为单因素资料进行统计分析,美国EPA BMDS 2.40提供了NLogistic、NCTR、Rai_and_Van_Ryzin三个统计模型,将生殖毒性试验资料作为嵌套资料进行统计分析,充分考虑了生殖毒性试验中剂量和窝两因素对统计结果的影响。本次试验的BMDL为9.64 mg·kg^-1·d^-1远低于NOAEL值42.73 mg·kg^-1·d^-1,可能与上述因素有关。
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  T13.36 低剂量内分泌干扰物双酚A致前列腺增生作用及机制

  吴建辉;黄冬妍;苏欣;闫晗;潘琦;徐斯翀;许丽;李雷;孙祖越

  2013, 27(S1): 261-262.

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  目的 明确灌胃给予低剂量双酚A(BPA)致大鼠和老年犬前列腺增生作用并探讨其可能机制。方法 50只去势雄性SD大鼠随机分成阴性对照、模型组和三个BPA剂量组,每组10只动物。除阴性对照组外,其余各组动物sc给予睾酮1.0 mg·kg^-1。同时BPA组分别ig 10.0, 30.0和90.0 μg·kg^-1 BPA,连续4周。动物于末次给药24 h后,采血检测激素水平,剖取背侧叶前列腺进行相关病理分析。 40只成年雄性SD大鼠随机分成4组,每组10只动物,依次灌胃给予0, 10.0, 30.0和90.0 μg·kg^-1 BPA,连续4 周。动物于末次给药24 h后,采血检测激素水平,剖取背侧叶前列腺进行相关病理、基因表达谱、RT-PCR和免疫组化分析。 24只雄性老年Beagle犬随机分为4组,每组6只动物,口服给予0, 2.0, 6.0和18.0 μg·kg^-1 BPA,连续2月。每月B超探测前列腺大小一次,动物于末次给药24 h后,采血检测激素水平,剖取前列腺进行相关病理分析、基因表达谱和RT-PCR分析。结果 ① 与模型对照组相比,BPA降低模型大鼠睾酮水平(P<0.05),增加泌乳素水平,增大背侧叶前列腺湿重及脏体系数,增加前列腺上皮细胞高度(P<0.01),但各指标随BPA剂量增加逐渐降低。 与对照组相比,BPA升高成年大鼠血清雌二醇水平,下降睾酮水平,增大背侧叶前列腺湿重及脏器系数(P<0.01),增加前列腺上皮细胞高度 (P<0.01),增大前列腺腺腔面积;低剂量BPA明显影响背侧叶前列腺与细胞增殖有关信号通路。 与给药前相比,给予BPA 2个月后,老年犬前列腺体积均明显增大(P<0.05)。与对照组相比,BPA增大老年犬前列腺湿重和体积,且前列腺脏体系数明显增大(P<0.05);病理分析结果显示,BPA剂量组前列腺腺体多数呈增生性分泌状,前列腺上皮高度增加明显(P<0.01);低剂量BPA影响老年犬前列腺多基因表达,介入多信号通路影响前列腺增生,进一步miRNA表达谱芯片分析显示存在12个明显表达差异的microRNA。结论 低剂量BPA促进BPH模型大鼠、成年大鼠和老年犬前列腺增生,提示低剂量BPA可能促进人前列腺增生并加重BPH患者症状。这种增生通过激活DNA复制和甾体生物合成等信号通路而达到。
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  T13.37 对羟基苯甲酸丁酯妊娠哺乳期暴露后通过干扰睾丸甾类合成代谢途径影响雄性子代的生殖内分泌功能

  张林媛;丁思进;董力;乔佩环;汤宁;常兵

  2013, 27(S1): 262-262.

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  目的 探讨对羟基苯甲酸丁酯(n-BP)对雄性仔鼠的生殖内分泌毒性及其毒性作用机制。方法 采用Wistar大鼠妊娠哺乳期暴露模型,从雌鼠妊娠第7天到哺乳期第21天染毒n-BP。将孕鼠随机分为5组,分别为玉米油对照组、64、160、400、1000 mg·kg^-1的n-BP剂量组。分别在雄性子代出生后21, 35, 49, 90和180 d观察生长发育情况,并进行解剖,留取脏器,采集血样,并在90和180 d时检测精子参数。采用免疫印迹和荧光定量PCR技术检测睾酮(T)合成途径中重要的酶类固醇激素急性调节蛋白(StAR)和细胞色素P450侧链裂解酶(P450scc),以及雌二醇(E2)的合成代谢关键酶芳香化酶(Arom)和雌激素磺基转移酶(Sult1E1)的转录和蛋白表达水平。采用荧光定量PCR和重亚硫酸盐修饰后测序技术检测大鼠睾丸内甲基化转移酶(Dnmts)的转录水平和ERα启动子区域特异甲基化的程度。结果 n-BP染毒后导致雄性子代肛门生殖器距离(AGD)下降,包皮分离(PPS)时间延迟;在5个不同的时间点血清T显著下降,E2水平显著增加,生殖器官重量不同程度降低;仔鼠成年后(出生后90和180 d)附睾尾精子计数和睾丸每日精子生成量显著减少。n-BP染毒组StAR的转录和蛋白水平显著减少,P450scc转录水平减少而蛋白水平无显著变化。Arom表达显著增加,Sult1E1表达水平显著降低。Dnmt3b转录水平显著增加,而Dnmt1呈现下降趋势。同时结果显示大鼠睾丸内ERα启动子区域甲基化率呈剂量相关的下降,在1000 mg·kg^-1剂量组具有显著性差异。结论 (1)妊娠哺乳暴露n-BP对仔鼠具有通过下丘脑-垂体-性腺轴的生殖发育毒性。(2)n-BP暴露可引起循环中睾酮的减少和雌激素的增加,睾丸甾类合成代谢途径功能受到干扰。其机制可能与StAR/Arom/SULT1E1相关。(3)妊娠哺乳期n-BP暴露影响成熟期睾丸内甲基化转移酶的水平,从而调控整体基因组的转录水平,抑制或增强下游基因和蛋白的表达。
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  T13.38 Hsps基因在小鼠胚胎后肢正常发育和异常发生过程中的表达

  阎政礼;潘亚敏;任传璐;付虎;朱江波;朱勇飞

  2013, 27(S1): 263-263.

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  目的 研究热休克蛋白(Hsp)基因在小鼠胚胎后肢正常发育和异常发生过程中的表达情况。方法 ICR小鼠受孕后,将其随机分为实验、对照两组,实验组和对照组各56只。于孕11 d(GD11),经口灌胃一次给予实验组孕鼠80 mg·kg^-1的全反式视黄酸、对照组孕鼠给予等体积的大豆油,并分别于GD12~GD18取两组胎鼠的后肢(每窝各取胎鼠1只),利用实时荧光定量PCR检测Hsps基因的表达丰度。共检测了Hsps基因家族中36个Hsps基因在小鼠胚胎后肢正常发育和异常发生过程中的表达。结果 所有Hsps在小鼠胚胎后肢正常发生和异常表达过程中均表达。在GD12~18, Hsp25, Hspb3, Hsp20, Hspa1a, Hspa8, Hspa9, Hspa14, Hspab1, Trap, Hsp105, Grp170, Hspb5, Hspb7和Hspaa1在对照肢和实验肢中的表达模式一致;在GD12~GD18, Hsp25, Hspb3, Hsp20, Hspa1a, Hspa8, Hspa9, Hspa14, Hspab1, Trap, Hsp105和Grp170实验肢表达丰度高于对照肢(P<0.05);Hspb5, Hspb7和Hspaa1在GD12~GD17实验肢表达丰度高于对照肢(P<0.05),而在GD18无差异。在GD12~GD17, Hsp27, Hsp40和Hsp65在实验肢的表达丰度高于对照肢(P<0.05),而出生前低于对照肢(P<0.05);于GD12~GD15, HO-1和Hspa1b实验肢的表达高于对照肢(P<0.05),而GD16~GD18则低于对照肢(P<0.05)。于GD12~18, Hsp10, Hspb2, Hsp22,Hspb9, Hspb10, Hsp60, Hspa12a, Hspa1l和Grp78在对照和实验肢的表达模式不同,且在GD12~GD15(或GD16),实验肢中这些基因的表达丰度低于对照肢(P<0.05),而在以后的发育时间则高于对照肢(P<0.05)。于GD12~18, Hsp47, Hspb4, Apg-1在对照肢和实验肢中的表达模式一致;在GD12~GD15,3个基因在实验肢的表达丰度均低于对照肢(P<0.05);在GD16~GD18, Hspb4, Apg-1的丰度高于对照肢(P<0.05),而Hsp47无差异。于GD12~18, Hspa13, Grp94, Hsp110在对照肢和实验肢中的表达模式一致,且实验肢中这3个基因的表达丰度均低于对照肢(P<0.05)。Hspa12b于GD12~GD14在两组的表达无差异,于GD15实验肢低于对照肢(P<0.05),于GD16~GD18实验肢高于对照肢(P<0.05)。于GD12~GD18,Hspa2在两组的表达模式一致,且表达丰度无差异。结论 全反式视黄酸所致的小鼠胚胎后肢短肢模型中,Hsp25, Hspb3, Hsp20, Hspa1a, Hspa8, Hspa9, Hspa14, Hspab1, Trap, Hsp105, Grp170, Hspb5, Hspb7, Hspaa1, Hsp27, Hsp40, Hsp65, HO-1, Hspa1b, HO-1, Hspa1b可能起应激反应作用,Hsp10, Hspb2, Hsp22, Hspb9, Hspb10, Hsp60, Hspa12a, Hspa1l, Grp78, Hsp47, Hspb4, Apg-1可能和后肢发育有关,Hspa13, Grp94, Hsp110可能是后肢发育基因。
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  T13.43 阿特拉津对SD雄性大鼠的生殖毒性

  宋阳;贾贞超;陈锦瑶;胡俊翔;张立实

  2013, 27(S1): 265-266.

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  目的 探讨阿特拉津(atrazine)对SD雄性大鼠生殖系统的影响,为其毒性评价和风险评估提供依据。方法 SPF级成年SD雄性大鼠经口灌胃给予阿特拉津38.5, 77和154 mg·kg^-1,每日1次,连续染毒30 d。染毒结束后处死大鼠,取睾丸和附睾称重并计算脏器系数,观察睾丸组织病理学变化,检测精子数量及畸形率,测定睾丸组织的标志酶活性及抗氧化能力,并检测血清中性激素水平。结果 与溶剂对照组相比,阿特拉津高剂量组的睾丸脏器系数降低(P<0.05);高剂量组出现明显的睾丸组织病理学改变;中、高剂量组精子数量减少且精子畸形率升高(P<0.05);中、高剂量组的碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶及高剂量组的酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶的活性降低(P<0.05);各剂量组的总抗氧化能力均下降(P<0.05),高剂量组还原型谷胱甘肽的活性与丙二醛的含量分别降低、升高(P<0.05);中、高剂量组血清睾酮与抑制素B水平降低(P<0.05),高剂量组血清卵泡刺激素与黄体生成素水平升高(P<0.05)。结论 在本实验的染毒剂量和时间范围内,阿特拉津对SD雄性大鼠有一定的生殖毒性。
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  T14.4 Arsenic metabolism and arsenic-induced epigenetic modifications：the role and implication for arsenic-induced carcinogenesis

  Y GE;Z GONG;D GAILE;JR OLSON;REN Xue-feng

  2013, 27(S1): 270-271.

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  Consumption of drinking water contaminated with arsenic, a natural and carcinogenic metalloid, constitutes a global public health problem. The lack of knowledge regarding the carcinogenic mechanism of action of arsenic together with the wide spread contamination of drinking water with arsenic supports the designation of arsenic as one of the top-priority hazards throughout the world. Conversion of inorganic arsenic to methylated metabolites, in particular monomethylarsonous acid (MMAs^Ⅲ), is thought to be a critical step in arsenic-induced carcinogenesis because the higher cytotoxicity and genotoxicity of MMA^Ⅲ than inorganic and pentavalent methylated arsenic. Arsenic (+3 oxidation state) methyltransferase (AS3MT) has been long considered the major and only enzyme that is capable of biomethylating arsenic in humans. We recently identified N-6 adenine-specific DNA methyltransferase (N6AMT1) as a novel arsenic methyltransferase that is able to convert MMA^Ⅲ to the less toxic dimethylarsonic acid (DMA), suggesting that N6AMT1 may play a significant role in determining susceptibility to arsenic toxicity and carcinogenicity. Emerging evidence has suggested that the carcinogenic activity of arsenic may lie in its ability to induce massive aberrant gene expression and deregulate cell growth, proliferation and differentiation through disrupting epigenetic regulations. We recently showed that arsenic/MMA^Ⅲ exposure to human cells led to a decreased level of histone acetylation globally, which was associated with an increased sensitivity to arsenic toxicity. We further demonstrate that prolonged low-level MMA^Ⅲ exposure in human cells causes a systematic increase in the expression and activity of histone deacetylases (HDAC) with an associated reduction in histone acetylation. Administration of the HDAC inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), inhibits these MMA^Ⅲ-mediated effects, leading to increase histone acetylation and prevention of MMA^Ⅲ-induced malignant transformation. Moreover, we found that arsenic exposure could disrupt the balanced microRNA expression profiles in vivo and induce a dose-dependent changes of the expressions of micro RNAs. In summary, our new findings suggest that N6AMT1 is a novel arsenic methyltransferase and arsenic-induced dysregulation of histone modifications and microRNA expression may play a central role in arsenic-induced toxicity and carcinogenesis, and HDAC inhibitor could be a targeted measure to prevent or treat arsenic-related cancers.
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  T14.5 乙醇胺的遗传毒性

  霍娇;张梦云;张立实;徐培渝

  2013, 27(S1): 271-271.

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  目的 本研究拟补充乙醇胺的遗传毒理学资料,为完善其安全性评价提供帮助。方法 采用鼠伤寒沙门菌回复突变试验(Ames试验),小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试。Ames试验采用鼠伤寒沙门菌突变菌株TA97, TA98, TA100和TA102,使用标准平皿掺入法,分别在加与不加大鼠肝S9系统的条件下进行试验,观察自发回复突变数。Ames试验设5个剂量组0.08, 0.4, 2.0, 10.0和50.0 μl/皿,另设空白、溶剂、阳性对照。微核试验于第0小时和第24小时按0.1 ml/10 g 2次经口灌胃,第30小时颈椎脱臼处死小鼠,测定微核率和嗜多染红细胞与正染红细胞比例(PCE/NCE)。微核试验剂量设为343.75, 687.5, 1375.0 mg·kg^-1,另设阴性、阳性对照。TK基因突变试验在细胞经过前处理后,用受试物处理3 h,分别进行第0天的平板接种效率、第2天的平板接种效率及突变频率(MF)的测定。TK基因突变试验设剂量组为4, 6, 8和10 mmol·L^-1,另设阴性、阳性对照。结果 Ames试验中,各菌株不同阳性对照回复突变菌落数均远超自发突变菌落数,在剂量大于50.0 μl/皿时,由于乙醇胺的碱性过强未有菌落产生。在10.0 μl/皿时,加或不加S9的情况下,乙醇胺诱发TA97和TA100菌株的回复突变菌落数均超过自发突变的两倍以上,呈现剂量-反应关系。微核试验最高剂量组小鼠在两次给药之后死亡高达70%,不再对其微核结果进行分析。阳性对照组的微核率显著高于阴性对照组(P<0.01﹚,各组PCE/NCE比值均在正常范围内且差异无统计学意义。雄鼠低、中两组以及雌鼠中剂量组的微核率与阴性对照组比较均显著性升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。TK基因突变试验随着浓度增加,各剂量组的相对存活率、相对悬浮生长、相对总生长逐渐下降,呈现良好的剂量-反应关系。阳性对照组MF显著高于阴性对照组(P<0.05),各组突变频率有随剂量增加而增加的趋势,但与阴性对照比较均无显著性差异(P>0.05)。结论 在本次实验条件下,测试剂量范围内,Ames试验、微核试验结果提示阳性,TK基因突变试验显示阴性。由于生产工艺不同和生产使用需求量大,为保证乙醇胺生产使用过程中的安全性,应针对国产批次和工艺进行系统的毒理学评价。乙醇胺遗传毒性尚需结合其他相关数据综合评定。
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  T14.6 丙烯酸-2-乙基己酯的遗传毒性

  霍娇;张梦云;张立实;徐培渝

  2013, 27(S1): 271-272.

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  目的 拟补充和验证丙烯酸-2-乙基己酯(2-EHA)的遗传毒性数据,为其安全性评价提供资料。方法 采用三种致突变试验:鼠伤寒沙门菌回复突变试验(Ames试验),小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试。Ames试验采用鼠伤寒沙门菌突变菌株TA97, TA98, TA100和TA102,使用标准平皿掺入法,分别在加与不加大鼠肝S9系统的条件下进行试验,观察自发回复突变数。Ames试验设5个剂量组0.08, 0.4, 2.0, 10.0和50.0 μl/皿,另设空白、溶剂、阳性对照。微核试验于第0小时和第24小时按0.1 ml/10 g两次经口灌胃,第30小时颈椎脱臼处死小鼠,测定微核率和嗜多染红细胞与正染红细胞比例(PCE/NCE)。微核试验剂量设为350, 700, 1400 mg·kg^-1,另设溶剂、阳性对照。TK基因突变试验在细胞经过前处理后,用受试物处理3 h,分别进行第0天的平板接种效率、第2天的平板接种效率及突变频率(MF)的测定。TK基因突变试验设剂量组为12.5, 25, 50和100 μmol·L^-1,另设溶剂、阳性对照。结果 Ames试验中,各菌株不同阳性对照回复突变菌落数均远超自发突变菌落数。对于TA97和TA98菌株,在大于10.0 μl/皿时,2-EHA诱发的回复突变菌落数均超过自发突变的两倍以上,呈现剂量-反应关系;对于TA100和TA102菌株,2-EHA剂量在大于10.0 μl/皿(加S9时)和50.0 μl/皿(不加S9时)回复突变菌落数超过自发突变两倍,同样呈现剂量-反应关系。微核试验阳性对照组的微核率均显著高于阴性对照组(P<0.01﹚,各组PCE/NCE比值均在正常范围内且差异无统计学意义。雄鼠高剂量组微核率增高(P<0.05﹚,雌鼠各剂量组微核率尽管有增高趋势,但未有统计学意义(P>0.05﹚。TK基因突变试验随着浓度增加,各剂量组的相对存活率、相对悬浮生长、相对总生长逐渐下降,呈现良好的剂量-反应关系。阳性对照组突变频率显著高于阴性对照组(P<0.05),各组MF有随剂量增加而增加的趋势,50和100 μg·ml^-1剂量组MF与对照相比均有统计学差异(P<0.05)。结论 在本次实验条件下,测试剂量范围内,Ames试验、微核试验和TK基因突变试验均显示阳性。鉴于丙烯酸-2-乙基己酯日益增长的需求量且被广泛用于食品包装行业,应意识到国产2-EHA对我国食品安全和职业安全所带来的风险。针对国产工艺2-EHA的遗传毒性和致癌性期待得到进一步的阐释和验证。
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  T14.7 低剂量镉长期暴露对淋巴母细胞增殖的影响及p16基因及其甲基化在其中的作用

  袁德晓;叶爽;潘燕;邵春林

  2013, 27(S1): 272-272.

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  目的 了解低剂量镉(Cd)长期暴露对人B淋巴母细胞 (HMy2.CIR)增殖的影响,并探讨周期抑制基因p16基因及DNA甲基化在其中的作用。方法 以CdCl2 0, 0.005, 0.01和0.1 μmol·L^-1处理HMy2.CIR细胞,短期组Cd处理48 h,长期组Cd处理3个月(3 m)。采用细胞计数法检测HMy2.CIR细胞增殖情况;以real-time RT-PCR法检测DNMT1, DNMT3b和p16等基因表达;用胞嘧啶延伸实验检测细胞全基因组甲基化状态;用微核形成实验检测细胞损伤;用甲基化特异性PCR (MSP) 法检测p16基因启动子的甲基化状态。结果 低剂量Cd短期暴露可以明显促进HMy2.CIR细胞增殖,而低剂量Cd长期暴露促进细胞增殖的作用更加显著。Real-time RT-PCR检测长期低剂量Cd暴露细胞发现DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3b表达升高,而周期抑制基因p16表达下降。长期低剂量Cd暴露后全基因组发生高甲基化,且p16基因启动子也发生高甲基化改变。此外,用5-aza-dC处理低剂量Cd长期暴露细胞可以显著降低细胞增殖并恢复p16基因的表达。结论 低剂量长期暴露Cd诱导周期抑制基因p16启动子高甲基化而抑制该基因的表达,并诱导HMy2.CIR细胞增殖加快,这可能是Cd致细胞恶性转化的分子机制之一。
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  T14.8 成年人自发染色体畸变率与微核率的本底状况再分析

  张学清;陈英;王治东;王远;周平坤

  2013, 27(S1): 272-273.

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  目的 为了解环境因素对人类遗传物质的影响,以便正确评估放射从业人员以及低剂量辐射的健康效应,对87名成年人进行了自发染色体畸变率与微核率的本底水平调查。方法 采用提前加秋水仙素和松胞素B微核法分别制备染色体与微核标本,Metafer自动分析系统结合人工分析染色体畸变与双核淋巴细胞微核,按不同年龄段与不同性别分组进行统计比较。结果 87名受检者的染色单体型畸变率平均为0.70%,染色体型畸变率为0.20%,其中双着丝粒体和环为0.13%,单纯无着丝粒体为0.06%。微核与微核细胞率分别为23.43‰和20.47‰。除单体型畸变外,染色体型畸变率与微核率均随年龄增加而增加,两性之间无显著差异。结论 双着丝粒体+环畸变率与微核率均较以往报道的本底值有增高趋势。
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  T14.9 双酚A对胚胎干细胞及其向乳腺上皮细胞早期分化的影响

  杨淋清;罗凌凤;龚春梅;吴德生;黄海燕;刘建军;张文昌;庄志雄

  2013, 27(S1): 273-273.

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  目的 探讨双酚A(BPA)尤其在其低剂量条件下对胚胎干细胞及其定向分化为乳腺上皮细胞过程的影响,为全面评价BPA安全性提供实验基础。方法 本研究应用小鼠胚胎干细胞(mESC)和人类胚胎干细胞为研究对象,体外实验观察BPA的潜在毒性效应,首先应用胚胎干细胞实验方法(EST)评价BPA的胚胎毒性,同时观察双酚A对小鼠胚胎干细胞形成的拟胚体中三个胚层标志基因表达的影响;进一步建立人类胚胎干细胞定向分化为乳腺上皮细胞的体外模型,并观察低剂量BPA对人类胚胎干细胞及其定向分化为乳腺上皮细胞过程的影响。结果 EST结果显示BPA具有一定的胚胎毒性,低剂量BPA可以影响中胚层标志基因Flk-1和Gata-1的表达,提示其胚胎毒性的主要靶器官可能与中胚层起源的器官相关;成功建立人类胚胎干细胞定向分化为乳腺上皮细胞的体外模型,并发现虽然低剂量BPA对人类胚胎干细胞及其相关分子标志无明显影响,但可以影响其定向分化为乳腺上皮细胞的过程,可以导致分化后的乳腺上皮细胞多能性标志OCT4和NANOG蛋白表达水平上调,同时乳腺上皮细胞特征性标志/乳腺癌特异性抑癌基因E钙黏蛋白表达下调。结论 综上所述,我们应用体外研究的方法证实BPA具有一定的胚胎毒性,同时低剂量BPA对乳腺早期分化过程具有一定的影响,结果提示乳腺上皮细胞早期分化过程接触低剂量BPA可以使癌变风险增高。
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  T14.10 紫杉醇遗传毒性

  程东;韩晓英;张天亮;姚文环;周雯

  2013, 27(S1): 273-274.

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  目的 探讨紫杉醇的遗传毒性作用。方法 Ames试验(试验设立8, 40, 200, 1000和5000 μg/皿5个剂量,同时设立自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组。按平板掺入法在加与不加代谢活化系统(±S9)的条件下进行,每组设3个平行皿),小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验(设3个实验组,染毒剂量分别为30, 10和3.3 mg·kg^-1,另设蒸馏水阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组(40 mg·kg^-1),尾静脉注射给予实验动物),对CHL细胞进行细胞毒性试验(试验设7个剂量组,药物终浓度分别为5000, 1667, 556, 185, 62, 21和7 μg·ml^-1,另设空白对照组、阴性对照组和阳性对照组),并根据细胞毒性试验结果,在加和不加代谢活化系统的条件下,用CHL细胞进行体外哺乳动物细胞染色体畸变试验(试验设3个剂量组,药物终浓度分别为5000, 1667和556 μg·ml^-1。另设阴性对照组和阳性对照组。每组均设不加S9和加S9两组,各设三个平行)。结果 Ames试验结果为阴性;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验中,30.0 mg·kg^-1剂量组雌、雄小鼠微核率分别为20.4‰和20.0‰,与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);细胞毒性试验中,5000, 1667, 556, 185, 62, 21和7 μg·ml^-1剂量组RGR值分别为56.7%, 63.6%, 72.7%, 73.2%, 82.5%, 89.2%和93.2%,显示紫杉醇有细胞毒性,且存在剂量-反应关系;在加和不加代谢活化系统的条件下5000, 1667和556 μg·ml^-1剂量组致CHL细胞染色体畸变率分别为42.33%, 27.67%, 22.33%, 39.33%, 26.00%和20.33%,与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 紫杉醇对原核细胞在体外可能无遗传毒性,对真核细胞在体内和体外可能均有遗传毒性。
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  T14.11 一种医用消毒耦合剂细胞毒性实验

  张天亮;韩晓英;程东

  2013, 27(S1): 274-274.

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  目的 研究一种医用消毒耦合剂的细胞毒性,以期了解其使用的安全性,为临床合理使用提供依据。方法 实验组设立6个剂量组,最高剂量组为终浓度5.00 g·L^-1,以3倍间距往下设1.67, 0.56, 0.19, 0.06, 0.02 g·L^-1剂量组。称取受试样品1.00 g,经紫外灯照射2 h后,用DMEM完全培养液配至20 ml,受试物浓度为50 g·L^-1,然后用DMEM完全培养液按照体积比1:2, 1:8, 1:26, 1:80和1:249比例稀释,受试物浓度分别为16.7, 5.6, 1.9, 0.6和0.2 g·L^-1。同时设立阴性对照组(DMEM完全培养液)和阳性对照组(终浓度5 g·L^-1苯酚)。取对数生长期L929细胞,消化,以DMEM完全培养液调整细胞密度为1×10⁷ L^-1,将细胞悬液接种于3块96孔培养板中,每孔100 μl,每组设6个平行孔。置5%CO₂,37℃培养24 h后,各实验组分别加入11 μl受试物,阴性对照组加入11 μl完全细胞培养液,阳性对照组加入5.0 μl苯酚溶液100 g·L^-1(以DMEM完全培养液配制)。混匀,于5%CO₂,37℃培养。分别于1, 3和7 d进行细胞形态观察,判定毒性级别。观察后,吸去各孔培养液,换用100 μl DMEM非完全培养液,加入20 μl/孔 MTT 5 g·L^-1,继续培养4 h。培养结束后,弃去培养液,用150 μl DMSO溶解紫色结晶,连续光谱酶标仪570 nm波长测定A值,计算RGR值,判定毒性级别。结果 小鼠L929成纤维细胞在该医用消毒耦合剂的作用下,5.00, 1.67, 0.56和0.19 mg·ml^-1剂量组在各时间点出现1级到4级毒性的形态学改变,且有明显的剂量-反应关系;MTT实验显示,各剂量组各时间点相对增殖率(RGR值)均降低,毒性级别为1级到4级,呈现明显的剂量-反应关系。结论 该医用消毒耦合剂有明显的细胞毒性。
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  T17.7 化学品毒理学测试方法修订思路

  刘纯新;于丽娜;杨力

  2013, 27(S1): 303-303.

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  化学品毒理学测试是指为化学品管理提供生物系统效应、降解与蓄积、健康效应等数据而开展的一个或一组实验。测试结果是进化学品危险(害)性鉴别、分类、标签、风险和安全评价的基础,也是对化学品进行风险管理的科学依据。2004年原国家环保总局发布环境标准《化学品测试导则》(HJ/T 153-2004)并出版其规范性引用文件《化学品测试方法》。当时主要参照经济合作与发展组织(OECD)《化学品测试准则》2000版以及美国环境保护局(USEPA)和国际标准化组织(ISO)的78个生态毒理、健康毒理测试方法,其中生物系统效应18个,降解与蓄积17个,健康效应43个;另有我国科研人员提出的3个健康毒理测试方法,共81个毒理学测试方法。近5年来,在该书的基础上,我国出台了一百余项化学品/化学农药测试方法的国家标准。随着我国的化学品管理已进入风险管理阶段,对化学品测试数据,特别是在有关危害性分类、毒理替代试验、环境生物毒性和蓄积性、以及模拟系统中的环境行为等方面提出了更高的要求。同时,随着对化学品性质认识的不断深入和测试技术的快速发展,国际上新的测试方法不断推出,原有方法不断修订。为满足管理需求并与国际通行技术保持同步,进行了修订。国际上最完备、使用范围最广的化学品测试方法体系是OECD的《化学品测试准则》,已经过三十余年的实践,并不断修订、完善。本次修订主要以OECD的《化学品测试准则》2012年最新方法为主,参照其他先进的方法进行修订。增加陆地生物、水生及两栖动物毒性测试方法18个;增加降解、蓄积、迁移转化特性测试方法19个;增加健康效应测试方法27个(包括我国科研人员提出的4个免疫、发育毒理测试方法)。对"急性经口毒性试验"等国际上已更新(替代或废止)的34个方法,考虑到近10年来我国开展测试的实际情况,在引入新方法的同时,保留原方法,供实验室根据自身情况加以选用,或供验证、比对时使用。这样,修订后的生物系统效应方法36个、降解与蓄积方法37个、健康效应方法73个,毒理方面测试方法总共146个。为便于测试人员的理解和操作,本版在某些方法中保留了适当的解释、说明。
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  T17.8 转基因及基因敲除小鼠模型在毒理学中的应用前景

  何云

  2013, 27(S1): 303-304.

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  模式生物就是作为实验模型来研究特定生物学现象的动物、植物和微生物。转基因及基因敲除小鼠是目前最常用的模式生物。转基因及基因敲除小鼠模型可以应用于以下几个方面:① 可以利用内源性报告基因开发出一些体内突变检测系统;② 可以利用转基因动物模拟人类疾病,识别导致基因组不稳定性和早期肿瘤发生的重要的基因及其途径;③ 可以用于阐明化学物的毒性作用机制;④ 转基因报告小鼠有助于用无创成像技术在动物的整个生命周期中进行检测,并能及时重复,因此提供了一个完整的毒作用的时空观察;⑤ 可以建立外源性化合物代谢模型,检测外源性化合物代谢酶的构成是否可引起化学物代谢毒性反应;⑥ 可以建立转基因受体模型,改变外源性和内源性化学物质的代谢;⑦ 可以建立人源化小鼠模型,将作用模式数据应用到人类危害和风险评估中;⑧ 可以作为替代模型系统,如斑马鱼模型和秀丽隐杆线虫模型,进行毒性评估和MOA的研究。总之,转基因及基因敲除小鼠模型在毒理学中具有广泛的应用前景,是未来毒理学发展的重要领域之一。
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  T14.12 AP-1参与单核巨噬细胞促进煤焦沥青烟气提取物诱导的BEAS-2B细胞在裸鼠体内成瘤和肿瘤转移

  冯斐斐;吴逸明;张巧;吴卫东;吴拥军;姚武;李智涛;赵勇;刘瑜

  2013, 27(S1): 274-275.

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  目的 探讨单核巨噬细胞(THP-1)在煤焦沥青烟气提取物(CTPE)诱导的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)于裸鼠体内成瘤和肿瘤转移中的作用及相关机制。方法 2.4 mg·ml^-1 CTPE间断染毒BEAS-2B细胞72 h,之后细胞常规传代培养;DMSO为溶剂对照。空白对照BEAS-2B细胞,DMSO染毒、20代和30代CTPE染毒BEAS-2B细胞,以及30代CTPE染毒BEAS-2B和THP-1(2:1)混合细胞注入裸鼠后颈部(每组裸鼠n=6),每5 d观察移植瘤发生和生长,并于第30天检测各组移植瘤的重量并观察肿瘤在裸鼠体内的转移情况;HE染色肿瘤切片,观察异型细胞、癌巢和微血管等病理学改变;采用免疫组化法检测裸鼠移植瘤和转移瘤中AP-1(c-Jun)的表达;并采用相关分析探讨c-Jun表达量与癌巢数、微血管数和转移情况的关系。结果 各组细胞注入裸鼠体内30 d后,空白组、DMSO组和20代CTPE染毒BEAS-2B细胞组未见移植瘤形成;而混合细胞组形成的移植瘤生长速度比单独30代CTPE染毒BEAS-2B细胞组快;第30 d,混合细胞组移植瘤重量为(3.774±1.097)g,明显高于单独30代CTPE染毒BEAS-2B细胞组(0.075±0.021)g,P<0.05;并且只有混合细胞组出现肿瘤淋巴结和肝转移。病理学观察发现混合细胞组移植瘤组织切片的10个显微镜视野中癌巢数和微血管数分别为(7.00±0.97)和(20.17±2.64),均明显高于单独30代CTPE染毒BEAS-2B细胞组((3.50±0.56)和(7.00±1.03)),P<0.05;且混合细胞组移植瘤AP-1(c-Jun)蛋白的平均光密度值为(0.350±0.011),高于单独30代CTPE染毒BEAS-2B细胞组(0.276±0.008),亦高于转移的淋巴结(0.267±0.014)和转移的肝(0.303±0.012),P<0.05;此外相关分析显示混合细胞组和30代CTPE染毒BEAS-2B细胞组移植瘤的AP-1(c-Jun)表达量与移植瘤内微血管数(R=0.930, P<0.05)和肿瘤转移情况(R=0.905, P<0.05)呈明显的正相关。结论 单核巨噬细胞不仅促进CTPE诱导BEAS-2B细胞在裸鼠体内形成移植瘤,而且促进肿瘤的生长、血管生成和转移,且转录因子AP-1在此过程中发挥重要作用。
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  T14.13 氯乙烯对大鼠肝细胞周期及G₁/S关卡相关基因mRNA表达的影响

  马宁;张盼红;张文平;高怡;田凤洁;吕懿;仇玉兰

  2013, 27(S1): 275-276.

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  目的 观察氯乙烯(VCM) 染毒大鼠肝细胞周期不同时相的分布及细胞周期G₁/S关卡相关基因mRNA表达的变化,从周期调控的角度,探讨VCM可能的致癌机制。方法 选用健康清洁级SD大鼠64只,按体重随机分为阴性对照组,VCM 5, 25和125 mg·kg^-1染毒组。隔日腹腔注射染毒,连续12周。分别在染毒6周、12周处死动物。用流式细胞仪(FCM)分析肝细胞周期分布的情况;实时荧光定量PCR方法测定细胞周期G₁/S关卡的正性调控相关基因细胞周期蛋白A2(cyclinA2/CCNA2)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1/CCND1)、细胞周期蛋白E1(cyclinE1/CCNE1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和负性调控相关基因p53(TP53)、p21(CDKN1A)、p16(CDKN2A) mRNA的表达。结果 细胞周期分布结果显示,染毒6周,5和25 mg·kg^-1 VCM染毒组大鼠肝细胞G₀/G₁期分布百分比分别为(69.73±10.94)和(74.32±9.29),均高于对照组(56.13±10.65),差异均有统计学意义(P<0.05);25 mg·kg^-1 VCM染毒组S期分布百分比(1.80±2.11)低于对照组(12.82±5.85),差异有统计学意义(P<0.05)。染毒12周,各染毒组大鼠肝细胞G₀/G₁期分布百分比与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);VCM 125 mg·kg^-1染毒组肝细胞S期分布百分比(14.91±4.43)高于对照组(6.68±2.64),差异有统计学意义(P<0.05)。染毒6周,VCM染毒组肝细胞CCND1, CDK4和CDK2基因mRNA的表达均低于对照组,且VCM 125 mg·kg^-1染毒组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。肝细胞TP53, CDKN1A, CDKN2A, CCNA2和CCNE1基因mRNA的表达没有明显的改变,差异无统计学意义(P>0.05)。染毒12周,肝细胞CDKN1A基因mRNA表达随着染毒剂量的增加有升高的趋势,VCM 125 mg·kg^-1染毒组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。肝细胞TP53, CDKN2A, CCNA2, CCND1, CCNE1, CDK2和CDK4基因mRNA的表达没有明显的改变,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 VCM诱导大鼠肝细胞周期阻滞,早期阻滞于G₀/G₁期,晚期阻滞于S期。VCM对G₁期的阻滞主要是通过下调CCND1, CDK4以及CDK2基因的表达。
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  T14.14 NF-κB介导的炎性反应和EMT过程在香烟抽提物所致肺细胞恶性转化中的作用及其分子机制

  赵越;徐媛;罗菲;李远;徐文超;周建伟;王心如;刘起展

  2013, 27(S1): 276-276.

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  目的 研究核转录因子κB(NF-κB)调控炎性反应和上皮-间质转化(EMT)在香烟抽提物(CSE)所致肺支气管上皮(HBE)细胞恶性转化中作用及其分子过程。方法 CSE 20 μg·ml^-1慢性处理HBE细胞40代后,应用软琼脂集落形成实验检测细胞恶性转化程度;应用免疫荧光和Western blot检测细胞E钙黏蛋白, N钙黏蛋白和vimentin水平;并应用Western blot, ELISA, RT-PCR和qRT-PCR观察CSE急性或慢性处理HBE细胞NF-κB p65蛋白和磷酸化水平,炎性因子白介素(IL-6)的表达和分泌水平及mRNA水平,miR-200c水平;并进一步观察应用NF-κB抑制剂Bay11-7082预处理细胞对CSE所致IL-6表达和分泌水平,miR-200c水平等指标改变的影响和对CSE慢性处理所致HBE细胞发生EMT及恶性转化的影响。结果 CSE 20 μg·ml^-1慢性处理HBE细胞后,细胞生长速度加快,其倍增时间缩短,并且恶性转化细胞能在软琼脂培养基上形成细胞集落;恶性转化HBE细胞形态逐渐由上皮样细胞向间质样细胞转化,上皮细胞标志E钙黏蛋白水平显著下降,而间质细胞标志N钙粘蛋白和vimentin水平显著升高;发生了EMT的恶性转化细胞IL-6 分泌水平升高,其mRNA水平也升高;CSE急性处理HBE细胞,p-NF-κB p65和IL-6水平升高,而miR-200c水平则降低;NF-κB抑制剂Bay11-7082可明显阻断CSE 所致细胞IL-6水平升高和miR-200c水平降低;而且IL-6中和抗体阻滞IL-6后可阻断CSE诱导的miR-200c水平降低和恶性转化细胞集落形成。结论 CSE慢性处理HBE细胞,通过激活NF-κB而引起炎性因子IL-6表达和分泌水平升高,从而下调miR-200c水平,诱导EMT发生,最终引起HBE细胞发生恶性转化。
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  T14.15 异戊二烯三种代谢产物在人胚肝L02细胞中的遗传毒性

  李艳;张新宇

  2013, 27(S1): 276-277.

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  目的 研究2-甲基-3,4-环氧-1-丁烯(MEBⅡ)和2-甲基-1,2,3,4-双环氧丁烷(MDEB)的遗传毒性。方法 彗星实验研究MEBⅡ, MDEB和3-甲基-3,4-环氧-1-丁烯(MEBⅠ)的遗传毒性。实验采用人胚肝L02细胞,使用碱性彗星实验作为技术手段评估三种代谢物在5种浓度下(10, 50, 200, 500和1000 μmol·L^-1)引起DNA断裂的能力。暴露时间1 h。MDEB通过异戊二烯环氧化反应合成。结果 三种代谢物均有遗传毒性。MEBⅠ毒性最弱而MEBⅡ最强,MDEB居中。估计MEBⅡ和MDEB的强度大约分别为MEBⅠ的11倍和3.6倍。已经有研究报道了三种代谢物的烷基化能力。MEBⅠ和MEBⅡ的烷基化能力仅为MDEB的1/10至1/20,而烷基化能力的差异被认为是它们致突变性不同的主要原因。结论 MEBⅡ引起DNA断裂的能力与其烷基化能力不符合,这可能说明MEBⅡ不是通过直接与DNA反应,而是通过其他机制引起DNA断裂的。
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  T14.16 1-氯-2-羟基-3-丁烯遗传毒性机制

  刘欣杰;郑金;张新宇

  2013, 27(S1): 277-277.

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  1-氯-2-羟基-3-丁烯(CHB)是致癌物1,3-丁二烯的一种代谢产物。丁二烯是一种主要来源于汽车尾气和燃烧产生的废气(如香烟烟雾)的环境污染物,其致癌性通常被归结为代谢产物3,4-环氧-1-丁烯、3,4-环氧-1,2-丁二醇和1,2,3,4-双环氧丁烷的作用。CHB是丁二烯通过另一条途径而形成的代谢物,并可在乙醇脱氢酶作用下进一步代谢为1-氯-3-丁烯-2-酮(CBO),但目前对CHB和CBO的研究还很少。最近,我们发现CHB和CBO均有细胞毒性和遗传毒性,而CBO比CHB强100倍。在本文中,我们进一步探索了CHB产生遗传毒性的下列可能的原因:(1)被细胞内的乙醇脱氢酶或P450酶转化为CBO;(2)诱导氧化应激;(3)在溶液中转化为其他毒性化合物;(4)直接与DNA碱基反应。CHB按照文献报道的程序进行合成。使用人胚肝L02细胞株及碱性彗星实验作为技术手段。溶液中反应用HPLC监测。结果显示,乙醇脱氢酶抑制剂4-甲基吡唑和P450抑制剂1-苄基咪唑,以及抗氧剂N-乙酰半胱氨酸和抗坏血酸对CHB引起的DNA断裂没有任何影响,故排除了上述(1)和(2)两种可能。CHB在水溶液中不稳定,半衰期为1.9 h(pH 7.4,37℃),转化为两个产物。为检查CHB转化后的产物是否有遗传毒性,将CHB在培养基中预先孵育0.5, 1和4 h后再处理细胞,发现引起的DNA断裂随着孵育时间的增加而增加。另一方面,CHB直接孵育细胞时,引起的DNA断裂随着孵育时间的增加而增加。此外,CHB能够与核苷发生较弱的反应。CHB在细胞上引起的DNA断裂可能是它与DNA碱基直接反应的结果,但同时CHB也可转化为其它毒性更强的化合物引起DNA断裂。需要进一步的研究区分这两种可能性的重要性。
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  T16.2 Toxicokinetic behavior assessment prediction of the ADMEProperties of alkylated naphthalenes by consideration of relevant physicochemical and dystemic toxicity data：Proof of concept

  Ming H KUNG;Christine M PALERMO;Lawrence K LOW

  2013, 27(S1): 288-289.

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  In some cases, it may be possible to predict the toxicokinetic behavior (ADME) of a substance by considering its physicochemical properties as well as relevant toxicity data, such as data from a series of structurally related chemical analogs.This is the approach supported by the European Union's REACH regulation.The present case study aims to validate the toxicokinetic behavior assessment approach via comparison ofthe predicted ADME properties of a substance to theexperimentally-determined ADME properties fromrobust toxicokinetic (TK) studies with the radiolabelled substance.This case study was conducted with an alkylated naphthalene (AN) compound, AN-600, where 600 denotes a molecular weight (MW) of 600 g·mol^-1.Based onits physicochemical properties, including molecular weight, water solubility and octanol/water partition coefficient (LogKow), AN-600 is predicted to have inherently low systemic bioavailability.Thisprediction was consistent with existing results of severaltoxicity studies in which there was no evidence of systemic absorption or toxicity.It was also predicted that among AN structural analogs differing in alkyl chain length and molecular weight, there would be an inverse relationship between molecular weight and bioavailability, consistent with pharmacologic principles.This inverse relationship prediction was supported byTK data from AN analogs,specifically AN-212(MW=212) and AN-379 (MW=379) which had 85% and 10% oral bioavailability, respectively.Furthermore,there were observedtrends of decreasing systemic absorption in repeat-dose dermal studiesof AN-600 analogs with increasing molecular weight and there was no evidence of absorption found in a dermal study with AN-600 itself.Finally, available basic TK data for analogs suggested that any absorbed material would be metabolized by side chain oxidation of the alkyl group, producing sulfate and glucuronide metabolites which would be ultimately excreted in the urine.In total, the above evidence led to a prediction that very little AN-600 could be absorbed by the oral or dermal routes.Exposure by inhalation is not expected due to the high molecular weight and low vapor pressure of AN-600.Subsequent to this prediction,extensive repeated dose, reproductive toxicity and toxicokinetic studies, were carried out on AN-600.In the toxicokinetics studies, systemic oral and dermal absorption was ≤1.3% and ≤0.16%, respectively, and the material that was absorbed had a half-life of 13-24 h, with the remainder of the oral dose quantitatively recovered unabsorbed in the feces after 120 h.The dermal dose was recovered quantitatively unabsorbed at the skin application site.These findings confirmed the prediction that the bioavailability of AN-600 is extremely low;consistent with the prediction that it would not exert systemic toxicity.The predicted lack of toxicity was confirmed through 90-d dermal and two-generation reproductive toxicity studies in which no systemically toxic or reproductive toxic effects were observed.Finally, an assessment of metabolism and excretion indicated that the absorbed dose was excreted in the urine in the form of sulfate and glucuronide metabolites resulting from side chain oxidation and subsequent conjugation, consistent with the prediction based on the known metabolism of related AN analogs.Collectively, the evidence supports the validity of using existing substance information and analog data to inform predictions of the toxicokinetic behavior of a substance.This approach can be used to focus investigations on remaining questions of relevance, or to determine when a TK study is or is not scientifically justified.When justified by existing information, such an approach to predict toxicokinetic properties minimizes unwarranted animal testing and can expedite the conduct of chemical safety assessments associated with new chemical notificationsso that the Chinese consumers benefit from innovative products from advanced chemistry & technology.
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  T16.3 Biological exposure indices of pyrrole adducts inserum and urine for hazard assessment of n-hexane exposure

  YIN Hong-yin;GUO Ying;ZENG Tao;ZHAO Xiu-lan;XIE Ke-qin

  2013, 27(S1): 289-289.

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  OBJECTIVE To investigate the biological exposure limit of pyrrole adducts for hazard assessment of n-hexane.METHODS Male Wistar rats were given daily dose of 500, 1000, 1500, 2000 and 4000 mg·kg^-1 n-hexane by gavage for 24 weeks.The levels of pyrrole adducts in serum and urine were determined at 8 and 24 h postdose once a week.The Biological Exposure Indices was evaluated by neurological evaluation and the levels of pyrrole adducts.The difference in pyrrole adducts formation between humans and rats were estimated by using in vitro test.RESULTS Dose-dependent effects were observed bet ween the doses of n-hexane and pyrrole adducts in serum and urine, and the levels of pyrrole adduct in serum and urine approached a plateau at week 4.There were significantly negative correlation between the time to paralysis and the level of pyrrole adducts in serum and urine, while a positive correlation between gait score and levels of pyrrole adducts in serum and urine was observed.In vitro, pyrrole adducts formed in human serum was about two times more than those in rat serum at the same level of 2,5-HD.CONCLUSION It was concluded that the BEIs of pyrrole adducts in humans were (23.1±5.91)mmol·L^-1 in serum 8 h postdose, (11.7±2.64)mmol·L^-1 in serum 24 h postdose, (253.8±36.3)mmol·L^-1 in urine 8 h postdose and (54.6±15.42)mmol·L^-1 in urine 24 h postdose.
主旨报告
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  食物过敏：一个值得关注的毒理学研究领域

  陈君石

  2013, 27(S1): 1-2.

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  随着生活水平的提高,生物技术的发展,食品的种类越来越丰富,而食物过敏的发生也随之升高。在过去的20年中,过敏性疾病患病人数显著上升,据估计,全球范围内有5%~8%的儿童和1%~2%的成人患有食物过敏症。目前研究发现,约有170种食品可导致食物过敏反应,但对食物过敏的生物学及免疫学机制仍不清晰,食物过敏的诊断缺乏统一标准、治疗手段单一。食物过敏是机体对食物产生的一种不良反应,是人体对食物中抗原物质产生的由IgE介导和非IgE介导的免疫反应,主要表现为呼吸道、皮肤、黏膜及消化系统内或全身性变态反应。根据流行病学调查,近年来食物过敏发病率上升趋势随着城市化发展、环境恶化等因素而增加,不同地区、种族、年龄的食物过敏发生特征及流行现状也有所不同。婴幼儿及儿童食物过敏发病率高于成人。在一项针对欧洲十国8000多名儿童食物过敏的问卷调查显示,2~3岁儿童多发食物过敏,各国儿童食物过敏的发病率从1.7%到11.7%不等,75.7%的食物过敏发病儿童需要就医。在对澳大利亚墨尔本1 岁儿童进行的食物过敏点刺试验调查中,73%参与实验的儿童对不同食物有过敏反应。中国某地区以开放性食物激发试验为诊断依据的研究显示,2岁以下儿童食物过敏发生率为5.3%。但食物过敏发病率随年龄的增长而降低,且在人群中的实际发病率较低。在荷兰和英国成年人食物过敏调查中,自述患病率为12%~19%,经DBPCFC确诊的仅为0.8%~2.4%。中国疾控中心对近4000名青少年食物过敏筛查中自述食物过敏发生率为5.7%,其中仅33.5%皮肤点刺试验阳性。目前食物过敏的诊断方法主要为病史调查、皮肤点刺试验、sIgE检测、DBPCFC。食物过敏诊断的核心为确定致敏原。作为过敏诊断"金标准"的DBPCFC能够明确过敏的食物,并确定过敏食物与临床症状的关系,但这些临床诊断方法都无法确定食物过敏的发病机制。"金标准"还存在费用高、耗时长,在伦理审查方面也存在一定的阻力,因此,很难推广到人群调查或临床应用。sIgA检测是在临床上最常用的体外检测方法,随着现代生物技术的发展,在致敏检测方法上也开发了过敏原蛋白芯片、高通量平行检测芯片、生物共振技术检测、生物传感免疫检测等多种方法,但目前还未应用到临床。避免摄入过敏原是传统的食物过敏治疗方法,绝对避免在日常生活中难以实现,因此在临床上一般采取对症治疗。食物脱敏疗法也是主要的治疗方法之一,但存在诱发严重过敏症状的可能。因此开发新型治疗方法成为研究热点之一。目前的研究主要集中在免疫疗法,包括T细胞肽免疫疗法、过敏原特异性免疫疗法、重组或修饰过敏原蛋白、抗IgE抗体疗法等。过敏原疫苗经皮下、舌下或口服等途径进行免疫治疗虽有一定的优势,但其安全性仍有待提高。研究表明利用氢氧化铝吸附、化学法修饰或对离子结合位点进行突变等方法可以大大降低致敏性,FAST项目已开展了通过以上方法降低水果、鱼类主要致敏原致敏性的研究,前景乐观,下一步将利用毒理学技术对其安全性进行评价。致敏原检测方法的不断更新和提高,可以更加准确、灵敏的检测出极微量的致敏原,为食物过敏预防提供了技术上的保障。 我国虽然对食物过敏性疾病的认识较早,但将食物过敏进行研究和管理却远远落后于其他发达国家。目前中国对食物过敏流行性调查、致敏原鉴定分析、食物过敏的诊断和治疗等方面也存在很大的不足,包括现代生物技术食品的过敏性安全评价、进行高水平的食物过敏流行病学研究、常见致敏原的检测技术、建立有效的食物过敏动物模型、加强过敏成分的标识管理等。将毒理学系统理论和先进技术引入食物过敏研究中将会加速对食物过敏机制的认识,提高致敏原检测鉴定技术,从而有效的降低食物过敏的发生。因此,食物过敏确实是一个值得关注的毒理学领域。
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  环境与遗传因素对男性生殖功能的影响

  王心如;夏彦恺;顾爱华;陆春城;吴炜;杜桂珍;陈敏健;秦玉峰;韩秀梅

  2013, 27(S1): 3-4.

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  精子生成障碍是男性不育的常见病因,也是我国成年男性生殖健康的主要威胁。研究表明,半个多世纪以来,人类精液质量显著下降,精子生成障碍已成为男性不育最常见的病因,也是我国成年男性生殖健康面临的最主要威胁。男性不育的发生是一个多因素、多阶段的过程,是环境危险因素(外因)和个体遗传因素(内因)共同作用的结果,符合多基因病的遗传模式,构成了环境-基因交互作用致男性不育的复杂调控网络。通过构建和完善内分泌干扰物(EDC)筛选和评价系统,对我国常见EDC及其代谢产物(九大类近百种化学物)的拟/抗激素活性、PPAR激动/拮抗活性以及类固醇激素合成干扰效应进行了较为系统、全面的筛检。同时,利用大样本男性不育患者和对照人群及职业暴露人群,进行各类EDC内暴露水平的评价以及与男性生殖功能异常的关联分析,筛选出与男性生殖内分泌功能相关的EDC(如植物雌激素、多环芳烃、酚类、农药等),为男性不育病因学研究提供了重要的流行病学资料。男性特有的Y染色体上无精子因子(AZFc)区及其睾丸特异性表达的多拷贝基因,已被证实在精子生成过程中起重要作用。通过对精子生成障碍患者及对照AZFc区缺失及拷贝数检测,提出完全缺失发生新的模式-分步缺失,随后证明不同部分缺失亚型发展成为完全缺失的易感性不同;通过对拷贝数的检测,提出AZFc区多拷贝基因致精子生成障碍的一种全新作用方式-剂量敏感模型。非梗阻性无精子症(NOA)全基因组关联研究(GWAS)发现3个染色体区的3个SNP与NOA易感性显著相关(1p13.3: rs12097821; 1p36.32: rs2477686; 12p12.1: rs10842262)。采用自主研发含多种参数和非参数检验方法的基因-环境交互作用分析软件GEI^®,研究非职业人群的环境暴露与个体遗传易感之间是否存在交互作用。发现4-t-OP高暴露与CYP酶多态、4-t-OP高暴露与Y染色体O3单倍群、SEC低代谢率与CYP酶多态等交互作用可增加男性不育的发病风险。通过对男性生殖功能的环境、遗传及其交互作用研究,明确男性不育的接触和易感生物标志,阐明其发生的分子机制,为高危人群的筛查和早期诊断提供科学依据,为不育症的分子诊断和靶向治疗提供新的途径和方法。
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  T1.4 全氟烷酸化合物的慢性暴露指示物研究

  刘薇;高倍;金一和

  2013, 27(S1): 12-12.

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  目的 探讨将头发和指甲中全氟烷酸化合物(PFAA)浓度作为人类PFAA暴露指示物的可行性。方法 以典型PFAA为目标污染物,针对头发和指甲样品,建立酸(碱)消化-离子对萃取-乙腈净化的样品前处理方法,利用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱定性定量分析。以大鼠为模型动物研究PFAA在趾甲、毛发中的分布累积与血清、肝等脏器中分布规律的关系,以及与通过粪便、尿液排泄的关系。通过人群样本研究PFAA在毛发、指甲中的分布规律与血清中分布的关系。结果 动物实验结果表明,大鼠指甲和毛发中PFAA浓度与暴露浓度成正相关关系,且PFAA构成比与血清和其他脏器相近。大鼠毛发中PFAA浓度与PFAA通过粪便、尿液的排泄速率成负相关关系。人群头发、指甲和血液中PFAA浓度成正相关,且组成特征相似。指甲中部分PFAA浓度高于血清浓度。结论 头发和指甲中PFAA浓度能够准确反映暴露水平和暴露特征,且能够反映长期暴露情况。
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  T1.7 阿可拉定兔灌胃胚胎-胎仔发育毒性毒代动力学方法学建立

  孟祥;李莹;姜娟;周莉;孙祖越;

  2013, 27(S1): 14-14.

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  目的 建立反相高效液相色谱法检测新西兰兔血浆中阿可拉定浓度的方法,以评价其全身暴露水平,并确定暴露量与给药剂量及给药时间的相互关系以及毒物是否存在体内蓄积性。方法 采用低、中和高剂量共3个组进行新西兰兔灌胃胚胎-胎仔发育毒性毒代动力学试验研究。首次给药与末次给药后,均在给药前、给药后0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12和24 h时间点于耳缘静脉采血1.2 ml,加入含有适量肝素的EP管中,静置1 h后3500 rpm离心10 min,用EP管取血浆分装置-20℃冰箱冻存留样待测。新西兰兔血浆样品经甲醇处理蛋白沉淀后,吸取上清液,DC-12型氮吹仪吹干,200 μl流动相复溶后,冷冻离心,上清液吸入内衬管样品瓶中,50 μl进样分析。色谱分析条件: Agilent1200型高效液相色谱仪,Agilent C₁₈色谱柱(5 μm,150 mm×4.6 mm),流动相:3%甲酸:乙腈=69:31,柱温40℃,流速0.9 ml·min^-1,进样量50 μl,在374 nm波长处检测。结果 新西兰兔血浆中阿可拉定在0.05~5 mg·L^-1浓度范围内线性关系良好, 线性回归方程y=110.17x-0.0995,R值为0.9998。最低检测限(S/N=3)为0.015 mg·L^-1,最低定量限(S/N=10)为0.05 mg·L^-1, 方法回收率为89.679%~115.086%(n=5),日内精密度RSD值为2.543%~5.955%(n=5),日间精密度RSD值为1.825%~14.836%(n=5),反复冻融3次,室温放置4 h和-20℃存储54 d对检测结果无明显影响,数值均在标准范围之内。结论 本方法简便快速、精密度高以及重现性好,可用于阿可拉定兔灌胃胚胎-胎仔发育毒性伴随毒代动力学实验研究。
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  T1.9 代谢酶基因多态性与苯导致的白细胞降低的关系

  张光辉;叶玲丽;张德亭;黄靖雯;陈萍;徐晓文;李军;郑国巧;夏昭林

  2013, 27(S1): 15-15.

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  目的 探讨代谢酶基因多态与苯所致外周血白细胞降低的关系。方法 选取苯作业工人385名为接触组,无职业接触任何有害化学物质的办公室人员102名作为对照组。采集外周血5 ml,进行白细胞计数和DNA提取。利用PCR-RFLP方法,检测与苯的代谢酶通路中较为关键的5个关键基因的8个常见位点的多态(GSTT1 null, GSTM1 null, GSTP1 A >G, CYP2E1 -1019 C > T, CYP2E1 -1293 G > C, CYP2E1 Intro6 T > A, mEH exon3 T>C, mEH exon4 A>G),分析基因多态与苯接触工人外周血白细胞计数的关系。结果 接触组年长者的白细胞值低于年轻组[5.33±1.37)×10⁹ vs ((5.81±1.69)×10⁹],差异具有显著统计学意义(P=0.003)。对照组白细胞值为[(6.65±1.42)×10⁹],接触组白细胞值为[(5.61±1.58)×10⁹],两组比较,差异有统计学意义 (P<0. 01);苯的累计接触剂量值与白细胞降低具有剂量-反应关系。GSTT1缺失, GSTM1缺失, CYP2E1 -1019 C>T, CYP2E1 -1293 G>C这四个遗传多态性均与遗传易感性有关,GSTT1缺失(5.42±1.45 vs 5.81±1.68, P=0.045),GSTM1缺失(5.43±1.45 vs 5.75±1.67, P=0.030), CYP2E1 -1019 C/T(5.35±1.43 vs 5.75±1.63, P=0.020)和CYP2E1 -1293 G/C(5.36±1.30 vs 5.74±1.69, P=0.014)。GSTT1与GSTM1缺失在多重回归调整年龄、性别、吸烟和酒精后仍然具有统计学意义。结论 在苯职业接触人群中,苯累积接触剂量与外周血白细胞降低之间存在剂量-反应关系。GSTT1 缺失和GSTM1缺失可能与苯接触工人白细胞有一定相关性。表明代谢酶基因多态可能在苯诱导的基因毒性中发挥一定作用。
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  T1.15 阿魏酸钠与苦参素联合用药对百草枯引起肺损伤的保护作用

  王伟;裴晓坤;徐萌欣;孙松梅;甄兴兴;穆柯颖;张春雷;刘志峰

  2013, 27(S1): 18-18.

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  目的 研究阿魏酸钠(SF)与苦参素(OMT)联合用药对百草枯(PQ)所致肺损伤的保护作用。方法 大鼠随机分为空白对照组(生理盐水),PQ组(生理盐水),SF组,OMT组和三个复方组SF+OMT (1.6+3.4, 3.1+6.9,6.2+13.8 mg·kg^-1·d^-1)。腹腔注射PQ 20 mg·kg^-1 30 min后皮下注射相应药物, 56 h后取血、分离肺脏,测定生化指标。结果 与PQ组比较,复方高、中剂量组大鼠肺干湿比明显降低,血清和肺组织SOD活性明显增高(血清高、中剂量组分别为46.53和43.08 U·ml^-1模型组36.01 U·ml^-1,P<0.01;肺组织高、中剂量组分别为2.81和2.51 kU·g^-1蛋白模型组1.89 kU·g^-1蛋白,P<0.01),血清和肺组织MDA水平明显降低(血清高、中剂量组分别为3.68和4.82 μmol·L^-1模型组6.64 μmol·L^-1,P<0.01;肺组织高、中剂量组分别为1.96和2.25 μmol·g^-1蛋白模型组2.84 μmol·g^-1蛋白,P<0.05),血清和肺组织CRP水平明显降低(血清高、中剂量组分别为4715.94和5581.07 μg·L^-1 模型组5965.43 μg·L^-1,P<0.05;肺组织高、中剂量组分别为273.23和316.74 μg·g^-1蛋白模型组350.51 μg·g^-1蛋白,P<0.01),血清和肺组织IL-6水平明显降低(血清高、中剂量组分别为222.92和236.45 ng·L^-1模型组306.97 ng·L^-1,P<0.01;肺组织高、中剂量组分别为28.10和29.46 ng·g^-1蛋白模型组39.52 ng·g^-1蛋白, P<0.01),血清和肺组织NF-κB水平明显降低(血清高、中剂量组分别为120.98和148.78 ng·L^-1模型组204.68 ng·L^-1, P<0.05;肺组织高、中剂量组分别为111.44和122.82 ng·g^-1蛋白模型组161.75 ng·g^-1蛋白P<0.01)。结论 阿魏酸钠和苦参素联合用药对百草枯所致的肺损伤有明显的保护作用,其机制可能与其抗氧化和抗炎作用有关。
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  T1.18 何首乌提取物对正常及荷肝癌小鼠的肝功能的影响

  葛珍珍;张超;冯光远;杨红莉;石璐缘;孙震晓

  2013, 27(S1): 20-20.

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  目的 比较何首乌提取物及其R50部位对正常及荷肝癌小鼠肝脏功能的影响。方法 (1) 对正常小鼠肝功能的影响:ICR小鼠分别灌胃给予何首乌总提物溶液1.5 g·kg^-1、R50部位溶液0.5 g·kg^-1,2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(TSG)溶液185 mg·kg^-1,大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷2 mg·kg^-1(均相当何首乌生药量10 g·kg^-1,按成人每日最大用量6 g计算,相当于人临床用药量100倍),每天1次,共给药10 d。(2) 对荷肝癌H22小鼠肝功能的影响:ICR小鼠接种H22腹水癌,设荷瘤对照组,荷瘤R50低浓度组(0.25 g·kg^-1,相当于人临床用药量50倍),荷瘤R50中浓度组(0.5 g·kg^-1,相当于人临床用药量100倍),荷瘤R50高浓度组(1.0 g·kg^-1,相当于人临床用药量200倍),从荷瘤第2天按上述分组每日灌胃给药1次,共10 d。每天观察小鼠被毛、摄食、活动、排便等情况,定期称量小鼠体质量;制备血清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)与天门冬酸氨基转移酶(AST),同时解剖观察各组小鼠各脏器大体情况,取小鼠肝称重,计算各组脏器系数。结果 何首乌水提物及其R50部位、TSG、EG对正常ICR小鼠一般状况均没有明显影响,小鼠血液生化检测发现,各给药组相对于空白对照组转氨酶(ALT和AST)没有显著性增加,肝系数均没有明显变化。对荷肝癌小鼠,何首乌R50部位可引起荷瘤小鼠腹泻,体重减轻,与正常对照组小鼠相比,各荷瘤组小鼠AST和ALT以及肝脏系数均出现显著升高(P<0.05),荷瘤R50中浓度组与高浓度组和荷瘤对照组相比ALT显著升高(P<0.01),荷瘤R50高浓度组和荷瘤对照组相比AST升高(P<0.05)。结论 何首乌水提物、R50部位及其主要成分对正常ICR小鼠没有表现明显的肝毒性,但是同样剂量的R50部位可能加剧荷肝癌小鼠的肝损伤,在一定范围内也有剂量依赖性。
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  T1.20 中国栎树叶中毒研究50年

  史志诚

  2013, 27(S1): 21-21.

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  本文综述了从1962年到2012年的50 年间,中国栎树叶中毒的研究进展,阐述了栎属有毒植物的生物学、生态学、毒理学以及防控技术的研究成果。首次提出了栎丹宁生态毒理系统、栎丹宁生物活化原理、应用生态工程法预防牛栎树叶中毒等新见解;提出并确定了硫代硫酸钠对牛栎树叶中毒的特殊解毒作用;制订了"牛栎树叶中毒诊断标准与防治原则"(陕西地方标准)并在中国发生牛栎树叶中毒的14个省、市、自治区的100多个县区推广应用,使一度严重发生的牛栎树叶中毒在全国范围内得到控制,取得重大经济效益。
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  T1.22 食蟹猴注射ZK4502 14 d反复给药毒性试验及伴随毒代动力学

  赵素微;王江雪;王国辉;于峰;卢晓晨;魏金峰;王爱平;

  2013, 27(S1): 21-22.

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  目的 通过食蟹猴14 d静脉注射ZK4502,同时进行伴随毒代动力学测定,观察给药后动物出现的毒性反应及毒性反应的性质和程度,为临床安全用药的剂量设计和临床毒副反应监测提供参考资料。方法 静脉推注ZK4502 5, 15和40 mg·kg^-1,首次给药后,间隔1 d,之后连续给药,共给药14 d。恢复期4周。检测指标包括动物一般状况,进食量,体重、体温,心电图,血液学、凝血、血清生化、电解质、纤溶指标、尿液指标,毒代动力学和病理组织学检查等。结果 给药组所有动物每次给药后止血时间延长,首次药后1和2 h最为明显,8 h止血时间相对缩短;给药后给药局部出现肿胀或轻微肿胀.。给药第1天低、中、高剂量组动物TT明显高于溶剂对照组。给药结束时低、中、高剂量组TT出现升高趋势,高剂量组结果与溶剂对照组比较具有显著性差异,Fib明显低于溶剂对照组。 TT和Fib降低可能与供试品的药理作用相关。各给药组动物心电图指标未见异常。首次给予ZK4502的全身暴露水平,用C_max和AUC衡量与剂量正相关,C_max呈比例增加,但AUC增加比例小于剂量之比。至第14次给药后,AUC和C_max均大于与首次给药。随剂量和给药次数的增加,药物在食蟹猴体内出现缓慢的蓄积。溶剂对照组与各给药组存活动物给药结束和恢复期结束眼睑、角膜、结膜、虹膜、瞳孔对光反射、眼底等未见异常。给药结束与恢复期结束,给药组动物给药血管病变发病率和发病程度无明显差异,JK4502静脉注射对动物血管无明显刺激性。结论 食蟹猴静脉注射JK4502 14 d反复给药试验其未见明显毒性反应剂量为40 mg·kg^-1。同时伴随毒代分析结果提示该药物在5, 15和40 mg·kg^-1剂量时可能出现缓慢蓄积。
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  T1.25 化妆品动物替代实验的整合应用策略

  程树军;秦瑶;潘芳;黄健聪

  2013, 27(S1): 23-23.

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  目的 根据检测机构服务于产品质量评估和提供技术支撑的特点,尝试建立整合应用策略。方法 采用体外细胞培养、离体器官培养、重建组织工程皮肤模型等多种体外实验系统,采用组织培养、显微呈像、分子生物学、荧光检测等建立体外方法。这些方法包括鸡胚绒毛尿囊膜血管试验(CAMVA)、牛角膜浑浊及通透试验(BCOP)、荧光素漏出实验(FL)、经皮肤电阻(TER)、小鼠淋巴结实验(LLNA)、直接多肽结合实验(DPRA)、人细胞系激活试验(h-CLAT)、中性红摄取光毒性试验(NRUPT)、红细胞光溶血实验(RBC-PT)、鸡胚尿囊膜抗氧化试验(R-CAM)、原代黑素细胞抑制酪氨酸酶实验(MATA)、角质细胞摄取黑素颗粒实验(KIM)、角质细胞P53水平测试(PPK)、基质金属蛋白抑制实验(MFIK)等。结果 眼刺激实验采用CAMVA和BCOP的组合可满足无刺激性到严重刺激性产品的测试;采用FL和BCOP的组合可用于含表面活性剂产品的测试。皮肤刺激实验采用经皮肤电阻(TER)和皮肤模型的组合,或采用CAMVA和皮肤模型的组合。光毒性实验采用NRUPT和RBC-PT组合适用于光毒性原料的预测。皮肤过敏实验采用LLNA方法判定或采用DRPA+h-CLAT的组合方法预测。抗氧化剂的配方开发采用PPK和R-CAM和MFIK的组合,既可用于原料的开发,也可用于成品总体效果的测试,防晒剂的体外测试采用NRUPT和PPK的组合,可实现大样本的快速筛查。美白剂的开发采用MATA和KIM等多种方法的组合可提供与机制相关的可靠依据。结论 整合策略已经应用于化妆品的安全性评价过程,以及应用于原料或产品的功效性宣称评估过程。不同方法的组合应用有效地减少和避免了实验动物的使用,为化妆品出口企业符合欧盟动物实验禁令法规要求提供技术服务,同时了满足了部分企业的研发需求,提高了产品研发效率。
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  T2.6 环境雌激素双酚A对海马神经元树突和突触发育的影响

  张广侠;陆阳;叶银萍;陈蕾;徐晓虹

  2013, 27(S1): 28-29.

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  目的 探讨低剂量环境内分泌干扰物双酚A(BPA)暴露对海马神经元树突和突触发育的影响。方法 新生24 h的SD大鼠海马神经元体外培养5 d,感染携带GFP基因的腺病毒(Adv-EGFP)使神经元显现绿色荧光,激光共聚焦显微镜下观察树突丝的运动性和长度;用特异性结合F-actin的鬼笔环肽荧光染料标记树突的F-actin显现树突丝和棘结构;同时Western blot分析海马神经元相关蛋白表达。结果 激光共聚焦显微镜观察发现,BPA 10~1000 nmol·L^-1暴露30 min可促进树突丝的运动性和长度,同时促进NMDA受体NR2B亚基的磷酸化水平,这些作用可被雌激素受体阻断剂ICI182,780预处理消除,表明BPA急性暴露有可能通过核外雌激素受体激活NMDA受体NR2B亚基而促进树突发育。BPA 10~100 nnmol·L^-1暴露24 h同样可促进树突丝的运动性、长度和密度,并上调树突丝的肌动蛋白F-actin,改变与神经元树突形态密切相关的上游调控因子Rho家族中的RhoA, Rac1和Cdc42,促进Rac1/Cdc42而抑制RhoA表达;同时BPA还可促进海马神经元雌激素β受体表达。这些作用可被雌激素受体阻断剂ICI182,780和MEK1/2抑制剂U0126所阻断。这些结果提示,BPA暴露可能通过雌激素受体介导的ERKs信号通路,改变肌动蛋白细胞骨架的关键调节因子RhoA和Rac1/Cdc42而上调F-actin,最终促进树突的早期发育。然而,BPA处理6d不仅抑制神经元树突丝和树突棘的密度,也抑制突触的发生,使突触密度减小,突触前蛋白SynapsinⅠ和突触后蛋白PSD-95水平下调。雌激素受体阻断剂ICI182,780预处理可消除BPA对树突和突触发育的抑制作用。进一步研究发现BPA暴露6 d可下调ERKs磷酸化水平,而雌激素受体阻断剂预处理抑制其下调作用,提示慢性BPA暴露可经雌激素受体抑制ERKs信号通路而抑制树突和突触的发育。结论 低剂量BPA短时间暴露促进树突发育,而长期暴露抑制树突和突触发育,但无论急、慢性BPA与17β-雌二醇共处理均抑制雌二醇对树突和突触发育的促进作用,提示BPA可能是一种雌激素受体的部分激动剂,虽然短时间的低剂量效应可以促进树突生长,但长期的BPA积累可抑制树突和突触发育,损伤动物的脑和行为发育过程,导致成年后记忆等行为的异常。
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  T2.9 农药暴露对神经退行性疾病发病影响的研究进展

  高慧明

  2013, 27(S1): 30-30.

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  近年来,逐渐增多的证据表明神经退行性疾病,例如帕金森症(PD)、阿尔茨海默病(AD)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)等的发病与农药暴露相关联。今年3月发表在Neurology的对104个已发表的流行病学调查或病例对照研究的meta-analysis (对以往的研究结果进行系统的定量分析)进一步表明PD患病风险与农药暴露、务农和农村生活正相关。特别是农药百草枯或代森锰(maneb)暴露提高PD患病风险两倍。2011年发表在Environmental Health Perspectives的流行病学研究也报道了长期使用农药鱼藤酮和百草枯与PD高发病率存在正相关性。与这些相关性研究(association studies)相互验证的是很多动物实验也表明慢性低剂量鱼藤酮或百草枯暴露能诱导很多类似PD的特征性表现。动物和细胞水平的机制研究表明,线粒体功能受损、氧化应激和炎症反应是这两种农药诱导PD样病变的重要机制。鱼藤酮是线粒体复合体Ⅰ的抑制剂。最早发现脑内免疫细胞小胶质细胞激活参与低剂量鱼藤酮诱导的慢性神经退行死亡,并鉴定了NADPH氧化酶的催化亚基gp91是鱼藤酮的非线粒体作用靶点。无毒或低毒剂量的鱼藤酮和感染源细菌内毒素脂多糖协同性诱导多巴胺神经退行死亡(PD特征性病变)。百草枯是很强的氧化应激诱导剂,小胶质细胞的gp91激活也参与百草枯的诱导神经退行死亡的过程。实验发现提示遗传易感性,特别是能改变农药代谢、转运或损伤线粒体功能或诱导氧化应激的基因变异,会影响农药增加PD患病风险的作用,提示有遗传易感性的个体在PD患病风险上对农药暴露更敏感。在法国和美国进行的两个高质量的前瞻性研究报道了慢性低剂量农药暴露会提升认知功能障碍和AD的患病风险。对9个已发表的流行病学调查研究进行的meta-analysis表明慢性低剂量农药暴露提升ALS患病风险近两倍。另外,一个对美国农民的前瞻性研究表明有机氯杀虫剂与ALS患病相关联。这些发现强调了进一步评估慢性低剂量农药暴露对环境和人类身体健康的影响,尤其是对一些慢性神经系统疾病影响的重要性和急迫性。特别是对以往认为是不污染环境、对人畜毒性低和残效期短的天然杀虫剂鱼藤酮的慢性神经毒性和免疫毒性的重新评估尤为重要。考虑到接触环境毒物的多样性、复杂性和长期性的特点, 确定低剂量长时间的多种农药联合暴露对中枢神经的毒性作用的研究必定会对政策制定、安全使用农药和提升环境与人类健康等有重要指导意义。
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  T3.21 常见雄性的生殖脏器毒性病理变化

  严建燕;李雷;刘向云;孙祖越

  2013, 27(S1): 78-78.

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  雄性生殖器官包括睾丸、附睾、前列腺、精囊等,药物安全性评价实验中常需采集睾丸、前列腺、精囊等主要的生殖脏器制作石蜡切片进行病理变化分析,所得的病理报告常常作为评价药物是否具有生殖毒性的一个重要指标。本文概括了睾丸、附睾、前列腺和精囊常见的毒性病理变化。(1)睾丸常见的毒性病理变化:睾丸的不同细胞群对化学物质的敏感性不同,生精细胞>支持细胞>间质细胞。在安全性评价试验中,药物毒性引发睾丸常见的毒性病理变化有以下几种:睾丸萎缩、生精功能低下、精子成熟障碍、生精细胞脱落和排列紊乱、精子肉芽肿等,临床上很多药物如抗肿瘤药、可塑剂、重金属锰等都可以引起睾丸病理改变,最终导致精子发生障碍和雄激素分泌下降。一些中药如龙葵碱、雷公藤等也报道会引起大鼠睾丸的病理变化。(2)附睾常见的毒性病理变化:检测附睾内精子的形态变化可间接反映睾丸的病理状况,在病理检查之前,必须了解动物的年龄以及生殖器官发育的情况。未到发育期的动物常常会在附睾管内观察到生精细胞,这是正常的自然现象。附睾常见的毒性病理变化有:炎性细胞浸润、精子肉芽肿、上皮细胞空泡变性和附睾管腔内精子密度改变等。(3)前列腺和精囊常见的毒性病理变化:药物引起前列腺和精囊毒性病理变化并不多见,常见的是动物年龄增长自发引起前列腺炎症,前列腺萎缩和精囊萎缩等。雌、雄激素比例变化可引发大鼠前列腺良性增生,长时间高剂量给予非那雄胺可引起精囊和前列腺的萎缩。总结:通过动物睾丸、前列腺和精囊的病理切片观察分析雄性生殖系统功能状况,可以探讨产生毒性病理变化发生机制。另外,了解生殖器官毒性病理变化对于药物是否具有生殖毒性以及临床上相关疾病动物模型的建立成功与否均具有重要意义。
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  T3.23 大剂量纳曲酮对恒河猴心血管系统的影响

  李丽琴;鹿晓晶;徐建富;石童;王陈;张瑞华

  2013, 27(S1): 79-79.

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  目的 了解纳曲酮(NTX)在发挥治疗作用的同时,对心血管系统有无毒性作用,为进行广泛的临床应用提供试验依据。方法 心血管系统测定包括心电参数测定和血压参数测定。猴心电测定采用标准导联,用针头插入四肢皮下,引导Ⅱ导联心电图,以Powerlab生理仪测定给药前猴的心率、各波幅度、各波间期及心律,并观察各波形状等心电参数。猴血压测定采用脉博传感法,以IDC-1型多用生理电信号分析仪("BPRAT"程序)测量血压参数,包括动物收缩压、舒张压和平均动脉血压。各个心电和血压参数测定完毕后,肌内注射给予NTX 5, 10和20 mg·kg^-1测量给药后10, 30, 60和90 min时猴的心电参数及收缩压、舒张压和平均动脉血压。结果 猴肌内注射NTX 5, 10和20 mg·kg^-1组猴的心率、各波幅度、各波间期及心律与给药前相比,未见明显变化(P>0.05)。肌内注射NTX剂量为5 mg·kg^-1时,收缩压、舒张压和平均动脉血压与给药前相比,未见明显变化(P>0.05);肌内注射NTX剂量为10 mg·kg^-1,在给药后10~30 min,收缩压、舒张压和平均动脉血压与给药前相比,稍有提高,但是无显著性差异(P>0.05),至90 min基本恢复正常;肌内注射NTX剂量为20 mg·kg^-1时,在给药后的30~90 min,收缩压、舒张压和平均动脉血压与给药前相比,均有明显提高,其中,收缩压给药前后具有显著性差异(P<0.05)。结论 肌内注射NTX 5 mg·kg^-1以下时对猴的心血管系统无影响,为安全应用剂量,肌内注射NTX的剂量为10 mg·kg^-1以上时,对猴的血压有影响,在一定时间范围内可能引起血压升高,因此,高血压病人应谨慎使用高剂量的NTX。
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  T20.58 竹荪多糖诱导小鼠S180腹水瘤细胞凋亡

  叶建方;罗鹏;肖佳艳

  2013, 27(S1): 389-389.

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  目的 探讨竹多糖对小鼠S180腹水瘤细胞的作用,为竹荪多糖抗肿瘤作用的研究提供参考。方法 分别用竹荪多糖0(对照组)、25、50和100 mg·L^-1染毒小鼠S180腹水瘤细胞24 h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测Bcl-xl, Bax, 胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3等蛋白表达情况。结果 流式细胞术检测0, 25, 50和100 mg·L^-1组细胞凋亡率分别为(5.12±0.11)%, (9.61±0.61)%, (16.39±0.19)%和(17.05±0.13)%,与对照组相比细胞凋亡率增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot法检测Bcl-xl表达随着竹荪多糖计量的增加而逐渐降低,Bax表达呈现一定增长趋势,且Bax/Bcl-xl也呈现一定的增长趋势,胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3都有随着竹荪多糖剂量增加表达增加的趋势。结论 竹荪多糖通过抑制Bcl-xl的表达,促进Bax的表达,继而激活胱天蛋白酶9启动胱天蛋白酶级联反应,诱导细胞凋亡,可能是竹荪多糖诱导小鼠S180腹水瘤细胞凋亡机制之一。
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  T19.8 4个国家污染物释放与转移登记制度介绍

  霍立彬;刘晓建;聂晶磊

  2013, 27(S1): 346-346.

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  污染物排放与转移登记制度(PRTR)作为打破环境介质束缚,针对化学污染物采取信息公开以减少排放的专项制度,被美国、欧盟、日本、加拿大、澳大利亚等30多个国家和地区普遍采用。PRTR三个核心内容是化学污染物清单及申报门槛、估算方法、环境信息公开。政府制订列入清单的技术标准和程序,征求利益相关方的意见后出台化学污染物清单。同时政府需设置申报门槛以集中关注重点企业。企业须向政府报告向环境排放某种化学污染物的年度总量和转移某种化学污染物的年度总量,这些数据主要通过监测法、物料平衡法、排污系数法、工程估算法四种方法来估算,国外一般采取物料平衡法,只有少数企业使用监测法。环境信息公开作为继指令性控制手段和经济手段之后出现的一种新型环境管理手段,不仅监管成本最低,而且保障公众环境知情权,特别是对公众意义重大。而后结合美国、欧盟和日本在实施污染物释放与转移登记制度的演化情况,介绍了我国在建立和实施PRTR制度的进展。美国TRI制度是PRTR制度的先行者,欧盟和日本都先后实行了PRTR制度。我国只有原国家环保总局发布《排放污染物申报登记管理规定》对我国污染物排放进行监督管理,而且污染物排放申报登记后的数据仅与后续的排污收费对接,并不进行数据的社会公开。严格说来,我国没有类似PRTR的完整制度。随着《政府信息公开条例》和《环境信息公开办法(试行)》的出台和实施,为PRTR制度在中国的实施奠定了基础。2012年环境保护部发布《危险化学品环境管理登记办法(试行)》(环保部第22号令)明确提出针对重点环境管理危险化学品的生产使用企业要求其每年1月31日前向县级环境保护主管部门填报重点环境管理危险化学品释放与转移报告表和环境风险防控管理计划。但最终是由企业自己公开数据信息,并不是由政府统一公开所有企业的所有污染物排放信息。我们期待随着22号令的有效实施,中国的环境信息公开能够进入一个新的阶段。
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  T19.9 化学品GHS危害水生环境分类数据源初探

  卢玲;赵小进;孙锦业;读刚;毛岩;葛海虹;于相毅

  2013, 27(S1): 346-347.

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  目的 研究、筛选、推荐适合我国全球化学品统一分类和标签制度(GHS)危害水生环境分类的数据源清单,为我国化学品GHS危害水生环境分类提供指导和参考,促进GHS在我国的全面实施普及。方法 对国内外可用于危害水生环境分类的100余个数据源进行文献调研,比较了国内外数据源的评估和分级情况,结合分类数据实际检索、质量评估和分类结果验证等,在专家判断基础上进行筛选推荐。筛选遵循以下原则:考虑分类指标的相关性,选取危害水生环境分类指标相关性较大的数据源;考虑数据质量和完整性、可信性,选取数据原始来源可查,数据的精准性可得到证实的数据源;考虑数据获取的便利性和费用因素,只选取了中英文版本的数据源,并剔除收费数据源。结果与结论 (1)筛选推荐了31个适合我国GHS危害水生环境分类的数据源清单,列出了各数据源名称、网址和支持单位等。(2)对数据源进行了分级:在综合考虑数据质量、数据源支持机构权威性、数据检索操作方便等因素基础上,将31个推荐数据源分为三级,其中一级数据源13个,二级数据源8个,三级数据源10个。(3)阐述了数据源分级使用原则和使用要求:数据源使用首选一级数据源、其次选择二级数据源,三级数据源仅作参考使用;相同级别数据源不区分优先次序;分类时需对一级数据源中所有可获得的数据进行检索,如果一级数据源不能提供或者不能提供分类所需充分数据,需对二级数据源中所有可获得的数据文件进行查阅,三级数据源为适当时参考使用的数据源,主要用来查找原始文献或者获取有关毒性信息。(4)对部分一级、二级推荐数据源进行了重点介绍,包括数据源的支持单位、涵盖物质数量、物质毒性数据指标等。
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  T15.5 比格犬肝炎性损伤miRNA靶基因的预测和分析

  苏锟楷;朱夏青;项春生;楼宜嘉;李兰娟

  2013, 27(S1): 286-286.

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  目的 取马兜铃酸-Ⅰ(AA-Ⅰ)致比格犬亚急性肝炎性损伤组织,经microRNAs芯片,qRT-PCR分析。对所获6个显著差异表达miRNAs进一步进行邻近靶基因预测,以获取基于microRNA簇的转录后网络调控生物信息,指导进一步分子生物学深入研究。方法 (1)通过对miRBase数据库(http://mirbase.org/)的检索,找出所有跨度小于40 kb的microRNA簇,以与microRNA芯片结果进行比较。除了簇中表达发生变化的microRNAs,其他邻近的microRNAs也经挑选进行qRT-PCR,以验证其差异表达谱。qRT-PCR结果使用不配对Mann Whitney检验法进行统计分析,P<0.05代表差异显著。(2)采用TargetScan (www.targetscan.org)和miRDB(www.mirdb.org)预测不同microRNAs的靶基因,两种软件预测结果相互交叉的部分被导入DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov),以分析其可能影响的KEGG代谢通路(www.genome.jp/kegg)。代谢通路的预测结果由Fisher精确检验进行统计分析,通过对落在代谢通路中的靶基因数目和该代谢通路中已知的基因数目进行检验实现。结果 (1)qRT-PCR结果表明,miRBase数据库所获包含cfa-let-7a-1/cfa-let-7b,cfa-miR-362/cfa-miR-502/cfa-miR-660这两个microRNA簇分别出现表达一致变化。而在另一个microRNA簇中,cfa-miR-27a-cfa-miR-24表达呈上调,但cfa-miR-181d的表达却呈下调,这可能是由于后者位于染色体的另一条链上。(2)预测发现3个microRNA簇与细胞凋亡、免疫信号转导等生物学过程相关。其中MAPK信号通路同时受到cfa-miR-27a和cfa-miR-200c两个microRNA的潜在调控,提示AA-Ⅰ致肝炎症时,参与细胞凋亡、免疫信号转导的重要的途径。结论 经TargetScan和miRDB预测及qRT-PCR论证,确定AA-Ⅰ对比格犬肝炎性损伤靶基因的3个microRNA簇,分别与细胞凋亡及免疫信号转导相关。
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  T20.38 2,4-二氯酚诱导小鼠胚胎成纤维细胞内质网应激和细胞凋亡的分子机制

  张小宁;黄德军;张迎梅

  2013, 27(S1): 378-378.

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  目的 探讨2,4-二氯酚诱导小鼠胚胎成纤维细胞内质网应激及细胞凋亡的分子机理。方法 MTT法检测2,4-二氯酚对小鼠胚胎成纤维细胞活力的影响;2,4-二氯酚0.5, 0.75和1.0 mmol·L^-1处理细胞,qPCR检测氧化应激和内质网应激的分子标志物HO-1(血红素加氧酶1),NRF2(核因子E2相关因子2)和IRE1α(肌醇需求酶1α),Bip(葡萄糖调节蛋白基因78),CHOP(DNA损伤诱导基因),ATF6(激活转录因子6)的mRNA表达;免疫荧光检测NRF2蛋白的核转移和核定位;半定量RT-PCR检测XBP1(X盒结合蛋白1) mRNA的剪切情况;Western blotting检测内质网应激分子蛋白IRE1α,Bip,p-eIF2α(磷酸化真核翻译起始因子2α),ATF6,CHOP的表达;流式细胞术检测活性氧自由基ROS的相对含量和细胞凋亡率。结果 (1)2,4-二氯酚0.5, 0.75和1.0 mmol·L^-1显著诱导了小鼠成纤维细胞ROS的产生,暴露1 h后ROS的含量就明显上升。在2,4-二氯酚暴露12 h后,氧化应激分子标志物HO-1和NRF2 mRNA的表达量成剂量依赖性上调,且NRF2蛋白明显向细胞核内转移。(2)2,4-二氯酚(0.5, 0.75和1.0 mmol·L^-1)暴露显著激活了XBP1s向XBP1u的转化,上调了IRE1α,Bip,CHOP以及ATF6的mRNA(转录水平)和蛋白水平(翻译水平),诱导eIF2α蛋白发生明显的磷酸化修饰(翻译后修饰),且其磷酸化水平在2,4-二氯酚暴露1 h后便明显上升,随后缓慢下降。(3)流式细胞术检测显示,2,4-二氯酚0.5,0.75和1.0 mmol·L^-1暴露12 h后诱导小鼠成纤维细胞发生明显的凋亡,且凋亡率分别为4.93%,10.35%,14.75%(对照组为3.00%)。(4)用ROS清除剂NAC(N-乙酰半胱氨酸,5 mmol·L^-1)与2,4-二氯酚(0.5 mmol·L^-1)联合处理细胞发现,ROS相对含量和HO-1 mRNA的表达量均明显下降,同时CHOP和Bip mRNA的表达量相对于2,4-二氯酚单独处理组也发生了明显的下降。结论 2,4-二氯酚诱导了细胞的氧化应激(NRF2/HO-1通路);激活了内质网应激应答通路(Bip/IRE1α/XBP1,Bip/eIF2α,Bip/ATF6三条通路);导致了细胞凋亡。NAC可部分恢复细胞的氧化应激水平和内质网应激状态,提示ROS参与了细胞的内质网应激通路调控。细胞长时间的处于氧化应激和内质网应激状态可能是2,4-二氯酚诱导细胞凋亡的重要原因。
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  T3.44 Nrf2/ARE信号通路对异烟肼肝毒性的保护效应及机制

  张添光;王以美;赵君;夏明钰;池岛乔;彭双清

  2013, 27(S1): 90-91.

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  WHO统计资料显示,近年结核病发病率在全球范围内呈急剧增加的趋势,死亡率居各类传染病之首。在我国结核病被列为重大传染病之一,2010年全国第五次结核病流行病学现场调查结果显示,15岁及以上人群肺结核的患病率为459/10万。抗结核化疗是目前控制结核病的最强有力的武器,但结核治疗中出现肝功能异常的发生率2%~28%,占抗结核药不良反应的首位。异烟肼(INH)是不可替代的一线抗结核药之一,但其引起的肝损伤严重影响了结核病的系统治疗。因此,在目前尚无有效替代INH的抗结核药物的情况下,防治INH的肝损伤是临床上亟待解决的问题,无论对于临床上提高疗效,还是减轻患者痛苦都有着重要的意义。研究表明,INH引起的肝损伤效应主要是INH经CYP2E1代谢后产生的氧化应激所介导。Nrf2是一种新近发现的核转录因子,它可以启动多种抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的活化,在细胞抵御氧化应激反应的机制中发挥重要作用。生理条件下,Nrf2在细胞质中与其结合蛋白Keap1结合处于非活性状态;当暴露于ROS(或氧化应激状态)或受亲电子物质刺激时,Nrf2与Keap1解离而活化,活化的Nrf2进入细胞核,与抗氧化反应元件(ARE)结合,启动ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白等保护性基因转录和表达,从而减轻ROS和亲核剂介导的细胞损害。因此,Nrf2/ARE是近年新发现的机体抵抗氧化应激等刺激的防御性转导通路。许多研究发现,Nrf2具有保护肝细胞免受毒物损害、减轻肝炎症和纤维化、抑制脂质沉积等作用;研究证明,Nrf2在抵抗乙醇、吡唑等CYP2E1依赖性的氧化性肝损伤中起着重要的作用。如前所述,CYP2E1介导的ROS产生和氧化应激是INH诱导肝损伤的关键途径,这提示:Nrf2/ARE抗氧化信号通路对INH所致CYP2E1介导的肝毒性可能具有保护效应。因此,在国家自然科学基金的资助下,本研究拟采用体内、体外模型,研究不用剂量INH作用后肝细胞Nrf2的表达、核转位及下游靶基因的表达情况及其与INH肝毒性的关系,预期确证Nrf2/ARE信号通路对INH肝毒性的保护效应。在此基础上,在体外肝细胞模型中,采用Nrf2上游MAPK, PI3K/AKT等信号通路特异性抑制剂预处理,阐明INH作用后究竟何种信号途径调控了Nrf2-ARE信号通路。课题初步研究结果表明,在一定作用剂量下,INH能够诱导肝细胞线粒体内ROS的过量生成,并能诱导Nrf2核转位,提示Nrf2对INH所致ROS介导的氧化性肝损伤可能具有保护作用,为下一步深入研究Nrf2的肝保护效应奠定了基础。
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  T3.45 N-乙酰半胱胺酸通过恢复自噬保护黏菌素诱发的小鼠肾毒性

  代重山;张朝明;李继昌;汤树生;肖希龙

  2013, 27(S1): 91-91.

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  目的 探究自噬在黏菌素对小鼠亚急性肾毒性中的角色及N-乙酰半胱胺酸(NAC)对其保护的相关分子机制。方法 30只雌性昆明系小鼠随机分为对照组、黏菌素组、黏菌素+NAC组,黏菌素组小鼠静脉注射硫酸黏菌素15 mg·kg^-1·d^-1,分2次给药(间隔12 h),黏菌素+NAC组在此基础上腹腔注射NAC150 mg·kg^-1,对照组给予等量的生理盐水,连续给药7 d后,试剂盒检测小鼠血清肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)含量变化及小鼠肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量,组织学变化进行半定量评价(SQS),Western蛋白质印迹法测定肾组织中Bcl-2, p53及自噬相关标志物LC3, Beclin1。结果 与对照组相比,模型组小鼠Cre及BUN含量均显著升高(均P<0.01),MDA含量显著升高(P<0.01),SOD活性显著降低(P<0.01),SQS评分显著增加(P<0.01),Bcl-2, LC3-Ⅱ, Beclin1蛋白含量显著降低(P<0.01, 0.05和0.05),p53蛋白表达显著升高(P<0.01);当小鼠联合给予NAC后,与黏菌素组相比,小鼠血清Cre, BUN,肾组织中MDA含量、p53蛋白表达及SQS评分均显著降低(均P<0.01),SOD活性显著升高(P<0.01),LC3, Beclin1蛋白表达显著加(P<0.05)。结论 黏菌素可通过上调小鼠肾组织中p53蛋白,抑制Bcl-2, LC3-Ⅱ, Beclin1蛋白表达,表明自噬活性的下调与凋亡能力的上调参与黏菌素肾毒性调控;NAC可通过上调自噬活性、抑制凋亡保护黏菌素对小鼠的肾毒性作用。
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  T3.15 二苯氯胂、二苯氰胂对家兔联合毒性

  杨廷松;吴方晖;阴忆烽;刘艳丽

  2013, 27(S1): 75-75.

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  目的 制定二苯氯胂(DA)和二苯氰胂(DC)及其混合毒剂的环境质量标准,提供毒理学依据。方法 DA和DC纯度98%以上,无色液体,由防化研究院提供;大耳白家兔,雌雄各半,体重2.0~2.4 kg,普通级,北京市海淀区通利实验动物养殖场;XPS-8CS型显微镜,上海浦东物理光学仪器厂。通过气管染毒(itr),分别测定DA和DC对家兔的急性毒性(LD₅₀),根据DA和DC的LD₅₀,按等毒性比例配制DA和DC的混合物,以DA的1/2 LD₅₀和DC的1/2LD₅₀为中心剂量,测定DA和DC的联合作用LD₅₀,设溶剂对照组。LD₅₀用Bliss法计算。根据联合毒性强度系数K判断(K=预期LD₅₀/实测LD₅₀)联合作用方式。将联合染毒死亡的家兔及时解剖,而存活的家兔饲养28d后处死解剖,观察脏器颜色、大小、硬度和病变,并对主要脏器进行病理学检查。结果 DA和DC联合染毒的主要中毒症状有咳嗽、活动减少、进食少、消瘦、哮喘、呼吸困难、紫绀等,症状严重者多数在1周内死亡。DA对家兔LD₅₀为0.57(0.45~0.71)mg·kg^-1,DC对家兔LD₅₀为0.46(0.35~0.60)mg·kg^-1,DA和DC联合对家兔LD₅₀为0.47(0.36~0.61)mg·kg^-1。联合毒性强度系数K=1.08,联合作用方式属相加作用,联合染毒死亡家兔尸检显示:气管内皮黏膜溃烂,肺水肿伴有出血点,肠胀气、积储,肝呈深紫色。存活28 d后解剖家兔发现:气管内皮黏膜脱落,肠胀气,肺水肿、钙化等仍未恢复。镜检结果见喉部黏膜轻度水肿,气管黏膜坏死,支气管黏膜下充血、水肿,食道黏膜轻度水肿,胃黏膜充血、糜烂,肝细胞大片状坏死,肾小管上皮细胞变性,肺出血、水肿、钙化,支气管间质性肺炎,脾淤血,心肌细胞变性,肠黏膜上皮细胞坏死,膀胱内有血性浆液,这种损害在停止染毒后短时间内仍没有恢复。结论 DA和DC呕吐性刺激剂,对家兔气管染毒联合毒性LD₅₀为0.47(0.36~0.61)mg·kg^-1,属于剧毒性化学物质,两者的联合毒性作用方式为相加作用。DA和DC对家兔联合染毒,可引起气管、支气管、肺、心、肝、肾、胃、脾、肠等不同程度的伤害,这些损坏在停止染毒后短时间内难以康复。
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  T3.92 斑马鱼在药物临床前心血管毒性评价中的应用现状

  朱晓宇;朱桃桃;宋如顺;张勇;李春启

  2013, 27(S1): 116-117.

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  在药物研发早期阶段评价药物心血管毒性最常用的体外检测方法是评价药物对hERG的影响,hERG受影响主要会导致Tdp和QT延长。Tdp和QT延长导致的死亡约占药物诱发的心源性死亡的40%,药物引起的其它心源性死亡约占60%。现有的体外方法在评价药物诱发的除心律不齐以外(心肌损伤、心搏出量异常、出血或诱发血栓等)的心血管毒性方面还存在各种不足。虽然哺乳动物毒性评价实验可以更为全面地用多指标评价药物是否会诱发心血管毒性,但实验周期太长、费用高昂,药物失败的风险和成本都很高。因此,建立快速、高效、经济、可靠的方法从多个指标评价药物是否会诱发心血管毒性就十分重要。斑马鱼是近年来最受欢迎的重要模式生物之一,在药物研发领域的应用也日益广泛。早在1990年代,斑马鱼的心血管系统发育特征就已经被科学家进行了深入研究,研究表明,斑马鱼心血管系统的发育与人高度相似,虽然斑马鱼时单心房单心室,但其心脏结构及功能与人高度保守。同时,由于斑马鱼具有透明易观察等优点,开始被大量应用于心血管疾病研究和药物心血管毒性评价当中。2003年,Langheinrich等首先公开证实临床导致QT间隙延长的药物会引起斑马鱼严重的心率不齐。之后,Milan等用斑马鱼评价了100种小分子化合物的心血管毒性,发现在23种临床会上引起QT间隙延长的药物中,有22均会导致斑马鱼心动过缓和房室传导阻滞,预测准确率超过95%。2006年,Milan等人开创了成年斑马鱼心电图测量方法,并评价了一些已上市药物对斑马鱼心脏复极化的影响。2009年,Chan等首先建立了在斑马鱼上进行无创测量心跳规律的方法。Park等通过比较15种药物对斑马鱼心跳、hERG偏振以及例子内流改变的影响,证实斑马鱼模型能够预测药物引起的与心动过缓相关的毒性。2013年,Dhillo等建立了对斑马鱼幼鱼进行无创心电图测量的方法,并评价5种已知药物对斑马鱼心电图的影响。我们用斑马鱼模型评价了9种已上市药物的心血管毒性,通过6项评价指标的分析(心率、心节律、心包膜水肿、血液循环、出血和血栓形成),证实斑马鱼模型在心血管毒性预测方面你具有非常好的敏感性和特异性。美国FDA和欧洲EMA已经接受用斑马鱼心血管毒性评价数据进行药物临床申报。
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  T4.26 多种葡萄球菌肠毒素检测的二维分子印迹溶胶凝胶阵列式质量传感技术

  刘楠;李晓丽;马新华;欧国荣;高志贤

  2013, 27(S1): 134-135.

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  目的 建立了一种新型葡萄球菌肠毒素检测的二维(2 D)凝胶-溶胶分子印迹阵列式质量传感技术,为样品中多种葡萄球菌肠毒素的快速检测提供了新方法。方法 以葡萄球菌肠毒素A(SEA)和B(SEB)为靶标物,采用自组装溶胶凝胶法,将几种硅烷化试剂与水混合并超声制备合成初始胶;与SEA和SEB模板蛋白分子充分混合制备成印迹溶胶凝胶,采用旋涂法在压电石英晶体微天平(QCM)金电极表面原位合成可识别SEB和SEA的2 D分子印迹薄膜;冲洗掉表面物理吸附的凝胶制备成二维分子印迹凝胶-溶胶分子,以单片阵列式质量传感器件为换能器,结合阵列技术,通过在电极表面原位合成 MIP膜,改善和提高检测灵敏度,并用原子力显微镜和扫描电镜对膜性能及形貌特征进行表征;创建具有识别SEs功能的智能化并可重复使用的 MIP阵列式质量生物传感器。结果 当样品注入反应池后,2D分子印迹膜包被的QCM电极对于靶蛋白的特异性识别和结合可引起石英晶振振荡频率变化(Δf) 的降低,分子印迹膜和包被的石英晶振Δf与蛋白浓度呈正相关;通过曲线方程的拟合,两种葡萄球菌肠毒素的拟合曲线方程分别为:Δf_SEA=22.80C_SEA^0.22(R²=0.9858),Δf_SEB=144.54C_SEB^0.27(R²=0.9797);检测区间:0.1~1.0 mg·L^-1。最低检出限(LDL)分别为7.97 和2.25 μg·L^-1 (S/N=3),工作区间为4个数量级。对多种肠毒素检测的批内和批间检测值之间无显著性差异。在特异性测试方面,SEA-MIP与SEA反应引起的石英晶振Δf远远高于与SEB, SEC₁, BSA, OVA和PBS反应引起的变化,SEB-MIP获得相似的结果。在牛奶中添加不同浓度的SEA和SEB,不进行任何前处理,对SEA检测的回收率在97.00%~104.12%,SEB回收率在93.42%~114.00%。整个检测过程在30 min以内完成。 石英晶振金电极表面微观结构的AFM扫描图也可直观的反应2D分子印迹膜在石英晶振金电极表面的原位合成、模板肠毒素蛋白的捕获和洗脱等表面微观结构形貌和变化。结论 该研究将其应用于生物传感器中作为识别元件,构建一种高通量、低成本、无标记的MIP压电生物传感器,促进食品安全检测技术向着快速、灵敏、特异、简便和低成本的方向发展,可应用于饮水与食品安全、环境监测和生物工程等领域,具有很好的实用价值和广阔的应用前景。
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  T3.17 植物类中药的肝肾毒性研究现状

  田慧;张丹参;王倩;刘靓靓

  2013, 27(S1): 76-76.

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  "毒"或"毒性"作为中药的一种性能概念在我国具有悠久的历史,许多中医药学古籍都有记载。隋·巢元方《诸病源候论·解诸药毒候》云:"凡药物云有毒及大毒者, 皆能变乱, 于人为害, 亦能杀人。"近年来针对植物类中药的肝肾毒性,国内外学者进行了广泛而深入的研究。引起肝肾毒性的药物多含生物碱类、马兜铃酸类、萜与内酯类等。① 生物碱类:有报道称款冬花中的吡咯烷类生物碱具有肝毒性,含有肝毒性生物碱的中药还有紫草、秋水仙、山豆根等。雷公藤主要化学成分为生物碱类,存在着肾毒性和各种不良反应,其中肾毒性可引起肾小管变性、中毒性肾病、坏死、间质性肾炎、急性肾衰竭、肾乳头坏死。② 马兜铃酸类:含有马兜铃酸类植物药多见肾毒性,关于肝脏毒性有待进一步的研究。常见肾毒性的马兜铃酸类植物药有天仙藤、青木香、广防己、寻骨风、细辛等。目前,已知防己、关木通等植物类中药可致急性肾小管坏死。梁琦等报道了广防己、粉防己的肝肾毒性及其差异。③ 萜与内酯类:研究表明,黄药子的肝毒性成分主要是黄毒素(二萜内酯类成分)。王加志等报道黄药子中二萜类内酯对大鼠肝细胞有损伤作用。呋喃三萜类物质川楝素是川楝子主要的药理活性成分,已证明除引起较严重的急性消化道不良反应,还可引起急性中毒性肝炎,致转氨酶升高,出现黄疸等症状。④ 其他:毒蛋白类,毒蛋白主要存在于一些种子类的中药中,如苍耳子、蓖麻子、望江南子等。苍耳子主要毒性成分毒蛋白、苍术苷等,现代临床对苍耳子致肝不良反应的报道较多,多数是单味药汤剂或复方过量引起,一般苍耳子中毒后,肝损伤症状明显肝肿大,伴有谷丙转氨酶和胆红素升高。皂苷类,在致肝损伤的中药中, 地榆、合欢皮、柴胡、商陆、重楼和三七等药物的肝毒性可能与其所含的皂苷有关。黄伟等报道由柴胡提取一定剂量的柴胡总皂苷粗制品可导致大鼠明显的肝毒性损伤甚至死亡,柴胡总皂苷是其产生肝毒性的主要物质基础,且其损伤途径与氧化损伤机制相关。植物类中药占中药的绝大部分,植物类中药的肝肾毒理学研究对于整个中药肝肾毒性研究有着重要的意义。引发植物类中药肝肾毒性有诸多原因,有品种、剂量、炮制、配伍、机体状态等,这就需要我们借鉴多个学科技术,整体、动态、全面地阐述中药毒性,为中药的现代化打好基础。
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  T3.18 砷甲基转移酶As3MT在砷剂治疗急性早幼粒细胞白血病的作用

  徐石;张燕芳;王茜茜;付玉洁;那仁满都拉

  2013, 27(S1): 76-76.

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  目的 研究砷甲基转移酶As3MT在治疗急性早幼粒细胞白血病APL的作用。方法 以病人的NB4细胞为研究对象,暴露三氧化二砷1 μmol·L^-1 iAs^Ⅲ及其活性代谢产物一甲基亚砷酸MMA^Ⅲ和二甲基亚砷酸DMA^Ⅲ的混合物Mix 1 μmol·L^-1(iAs^Ⅲ, MMA^Ⅲ, DMA^Ⅲ按1:1:1混合),对比iAs^Ⅲ和Mix两组对融合蛋白PML-RAR的降解和细胞的毒性;建立共培养体系,以肝HepG2细胞为载体,模拟体内肝代谢,使其过表达As3MT,加入三氧化二砷,检测上层腔室NB4细胞的形态和培养液几细胞内砷剂成分的变化。结果 iAsⅢ组较易引起细胞分化和细胞自噬,在降解PML-RAR方面也更有优势,而Mix有更强的诱导细胞凋亡的作用;过表达As3MT的共培养体系中,加入iAs^Ⅲ后,上层NB4细胞和对照组相比,细胞数量有一定的下降,凋亡的相关蛋白有明显的增加,砷剂的中间代谢产物有明显增多。结论 砷甲基转移酶As3MT在治疗急性早幼粒细胞白血病过程中产生的毒性较大甲基化代谢产物有利于诱导癌细胞凋亡,同时体内过多生成甲基化代谢产物也是导致病人产生毒性反应的重要因素之一。
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  T3.47 阿尔茨海默病复合动物模型的构建

  张秀丽;李春丽;尹雪;徐颖臻;李亚晨

  2013, 27(S1): 92-92.

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  阿尔茨海默病(AD)已成为老年人的常见病和多发病,它是一种原因不明的、进行性的、中枢神经系统的退行性疾病,其特征性病理改变为大脑皮层及脑区的纤维蛋白沉积,即细胞外间隙的β淀粉样蛋白(Aβ)和细胞内多聚Tau蛋白的沉积,两者在病理形态学上分别表现为老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)。本实验拟在D-半乳糖致衰老小鼠的基础上,将Alcl₃/NaNO₂/LPS分别组合注射小鼠体内来建立一个更为理想可靠的AD复合模型。本文在D-半乳糖致衰老动物模型的基础上辅以能引起脑内老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)的化学试剂三氯化铝和亚硝酸钠进行AD动物模型的探索。因为炎症过程在AD的发病机制中起了危险的作用,它能激活胶质细胞和氧化应激反应。因此我们在模型制作过程中加入了脂多糖。实验结果表明,D-半乳糖联合亚硝酸钠、三氯化铝和脂多糖能够模拟AD,利用旷场、跳台和水迷宫实验发现模型组小鼠小鼠探索能力和被动学习能力下降,空间记忆受损。利用HE染色病理分析表明,各模型小鼠海马结构受损,海马细胞疏松,神经元或是死亡消失,说明三种化合物的组合能够损伤神经细胞。各模型组小鼠脑组织SOD和GSH-PX活力下降,MDA水平增高,说明模型小鼠脑组织抗氧化能力下降。RT-PCR结果显示,模型小鼠脑内APP和Tau mRNA水平较正常对照组明显升高,且模型Ⅱ(D-gal+Alcl₃+LPS)和Ⅳ(D-gal+Alcl₃+NaNO₂+LPS)组升高更为显著,说明模型Ⅱ和Ⅳ组更为接近AD病理特征,可用于进行AD病理和治疗药物研究。
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  T3.48 阿魏酸钠与苦参素联合用药急性毒性作用

  徐萌欣;王伟;裴晓坤;孙松梅;孙善月;刘志峰

  2013, 27(S1): 92-93.

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  目的 研究阿魏酸钠(SF)与苦参素(OMT)联合用药的不同摩尔配比对小鼠的急性毒性作用的比较,初步探讨急性毒性致动物死亡的机制。方法 (1)小鼠随机分空白对照组、单方OMT组(250 mg·kg^-1)、配比(固定OMT 250 mg·kg^-1)1组(SF与OMT摩尔比1:0.5)、2组(SF与OMT摩尔比1:1)、3组(SF与OMT摩尔比1:2)、4组(SF与OMT摩尔比1:4)、5组(SF与OMT摩尔比1:8),每组10只,雌雄各半。实验前禁食12 h,尾静脉注射相应药物。(2)SD大鼠随机分为空白对照组、复方(SF:OMT摩尔比1:2)1组(250 mg·kg^-1)、2组(200 mg·kg^-1)、3组(150 mg·kg^-1)、4组(100 mg·kg^-1)、5组(50 mg·kg^-1)、6组(25 mg·kg^-1)、以及相应剂量OMT单独用药对照组,分别于给药前、给药后测量大鼠心电图和呼吸波。结果 (1) 在OMT剂量固定不变(250 mg·kg^-1),SF与OMT的摩尔比分别在1:0.5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8时,各剂量组小鼠死亡率与OMT单独用药组毒性作用相当,组间比较未见显著性差异。(2) 大鼠在50~250 mg·kg^-1剂量范围内心电图分析主要表现为心率减慢,P-R间期延长,呈明显剂量依赖关系,250 mg·kg^-1剂量组有心跳停止导致个别动物死亡外其他动物一般在5 min左右恢复正常;给药后呼吸频率降低和呼吸幅度代偿性增大间歇性出现,有明显的剂量-效应关系,呼吸的改变一般在30 min左右恢复平稳,这些改变与相应剂量的OMT单独给药组基本一致。结论 SF给药剂量在28~446 mg·kg^-1范围内未见对OMT的急性毒性有明显影响,复方用药对小鼠静脉注射的急性毒性主要表现为OMT的毒性,动物死亡的原因与OMT所致大鼠心脏停跳有关。
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  T2.59 呋虫胺对家蚕的急性毒性

  李双;陈亮;张小艳;盛俊杰

  2013, 27(S1): 56-57.

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  目的 参照《化学农药环境安全试验评价准则》(2010,报批稿)第11部分:家蚕急性毒性试验测试指导,以家蚕(菁松×皓月)为试验物种,采用浸叶法评估呋虫胺对家蚕(菁松×皓月)的急性毒性,为进一步的环境毒理研究提供基础毒性数据。方法 正式试验设置暴露浓度为0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2及6.4 ai mg·L^-1,同时设置空白对照组。空白对照组和试验组均设3个平行,每个平行20头家蚕。试验采用浸叶法进行。不同浓度的暴露组采用不同浓度的呋虫胺溶液完全浸渍桑叶,空白对照组利用试验用水浸渍,10 s后取出,晾干后供蚕食用。整个试验期间饲喂处理桑叶,并观察在24, 48和72 h、至三龄起,每个平行中受试家蚕(菁松×皓月)的中毒症状和死亡情况,应用美国环境保护署剂量-反应机率值分析软件(EPA PROBIT ANALYSIS PROGARM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5)计算半致死浓度LC₅₀值。结果 72 h时,实验家蚕达到3龄,试验结束。整个实验期间,空白对照组的家蚕死亡数为0,满足本次测试指导要求的空白对照组的死亡率不超过10%的要求。在24 h,各暴露组的家蚕均没出现死亡;在72 h,3.2和6.4 ai mg·L^-1的暴露组家蚕全部死亡。在本次试验过程中,暴露组家蚕(菁松×皓月)出现了吐水、侧卧、拒食、昂头、身体缩短、扭曲挣扎、摄食减少等中毒症状。根据本次试验中家蚕(菁松×皓月)的死亡数统计分析得出:呋虫胺对家蚕(菁松×皓月)的24 h-LC₅₀ >6.4 ai mg·L^-; 48 h-LC₅₀为1.774 ai mg·L^-1,其95% 置信区间为1.530~2.067 ai mg·L^-1; 72 h-LC₅₀为0.867 ai mg·L^-1,其95% 置信区间为0.783~0.959 ai mg·L^-1。结论 呋虫胺对家蚕(菁松×皓月)的毒性等级为高毒。
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  T2.60 鸟类日粮毒性实验之分析方法验证

  高航;邹品田;马陶钧;陈珊

  2013, 27(S1): 57-57.

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  目的 建立并验证鸟类的日粮毒性实验中样品丁硫克百威的分析方法,以确保该方法适用于后续的分析测试。方法 根据条件摸索,对丁硫克百威的高效液相色谱分析方法的专属性、标准曲线线性、检出限(LOD)和定量限(LOQ)、精密度、准确度、回收率、样品溶液稳定性、全流程日间精密度进行了验证。结果 专属性:空白基质对样品峰无干扰,专属性良好;线性:丁硫克百威样品溶液在10.18~254.50 mg·L^-1的浓度范围线性关系良好,相关系数(r)为0.9999;LOD,LOQ:试验测得10.18 mg·L^-1样品的信噪比s/n=255,计算得到LOD=0.13 mg·L^-1,LOQ=0.43 mg·L^-1。精密度:六针系统精密度重现性样品峰面积的RSD为0.62%,6份方法精密度浓度的RSD为0.32%,均满足要求,表明方法的重现性良好;准确度:试验中各浓度下样品的准确度均满足要求,表明该方法的准确度良好;回收率:试验测得2份浓度为50.50 mg·L^-1饲料有机相萃取样品回收率分别为102.37%和103.38%,满足回收率要求,表明该方法回收率良好;样品溶液稳定性:24 h 后样品溶液的浓度为0 h的102.32%,说明样品溶液24 h内稳定性良好。全流程日间精密度:24 h后 2份浓度为50.45 mg·L^-1实测浓度平均值用计算得到的回收率校正后除以名义浓度得到精密度为98.26%,说明分析方法的全流程日间精密度良好。结论 本实验建立了样品丁硫克百威的超高效液相色谱分析方法,结果表明该方法的各项考查指标均符合要求,适用于后续鸟类日粮毒性实验中样品丁硫克百威的分析。
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  T3.20 SD乳鼠心肌细胞原代培养中消化条件相关问题的探讨

  马爱翠;严建燕;孙祖越

  2013, 27(S1): 77-78.

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  SD乳鼠原代心肌细胞成活率过低一直是有待解决的关键之处,其中消化分离过程对细胞成活率影响很大。因此,对心肌细胞消化分离过程中需注意的关键事项进行探讨。(1) 消化酶:原代培养前常采用消化分离法消化组织,使组织块分散为单个细胞,利于细胞贴壁生长。常用的消化酶包括:胰蛋白酶、胶原酶I或II和透明质酸酶,其中① 胰蛋白酶消化能力作用较强,但对细胞间质中的蛋白成分及肌细胞膜蛋白有很强的破坏作用,容易造成心肌细胞损坏,目前常用浓度为0.05%~0.25%,而且胰蛋白酶与EDTA或其他酶的联合应用,可减小对细胞的损害,具有更好的消化分离效果;② 胶原酶作用较缓和,可消化心肌组织中的胶原纤维,因此适当的应用胶原酶可充分分散成团的心肌细胞,对细胞的损伤小,但由于心肌组织中存在的胶原类型不单一,Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶的联合应用消化效果更佳,同时常与胰蛋白酶的结合,可提高消化效率和细胞活力,但过程较复杂;③ 透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用。(2) 消化时间:消化过度可使肌原纤维出现萎缩,对细胞的存活率有一定影响,或丧失贴壁能力,消化不足细胞聚集成团,难以进行形态学观测,因此每次消化时间须结合消化酶种类及浓度确定。(3) 消化温度: 消化温度过高会增加消化酶的毒性,过低会降低酶的活性,一般适宜温度为35~37℃。(4) 消化次数:消化次数的多少也会很大程度影响细胞的收率,多次消化需经过几次转移,会丢失很多细胞,且多次操作也会影响细胞的活力,但是分次消化可减轻胶原酶或胰蛋白酶对单细胞的破坏作用。若次数过少也会影响组织的消化程度,因此应结合实验条件对消化次数进行一定的摸索。总之,消化酶的种类、浓度、消化时间、温度及次数都会对组织离散效果影响较大,甚至会损伤细胞,导致培养细胞失去贴壁生长能力,增加心肌细胞死亡率,因此对心肌细胞原代培养消化条件的探索应相当的重视。
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  T2.62 基于iTRAQ技术筛选食管鳞状细胞癌相关蛋白质

  彭媛;刘冉;浦跃朴;尹立红

  2013, 27(S1): 58-59.

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  目的 筛选食管鳞状细胞癌(ESCC)血浆相关蛋白质,识别相关标志物用于食管癌的早期发现与诊断。方法 选取病理或内镜诊断明确的原发性ESCC患者血浆样品28例,按1:1配对原则,选取性别相同、年龄相差±5岁、除消化系统疾病以外,同地区非肿瘤人群血浆样品28例作为对照。将血浆样品按样品来源7个一组混合成8例样品,利用安捷伦MARS系统去除样品中的14种高丰度蛋白后,采用GE公司的2-D定量试剂盒对其进行蛋白定量。封闭、酶解后用同位素相对标记与绝对定量(iTRAQ)技术对8例样品进行标记,ESCC组分别标记为113,114,115,116;健康对照组分别标记为117,118,119,121。采用强阳离子交换色谱(SCX色谱)对样品进行分离纯化,液相色谱-串联质谱进行检测分析。运用ProteinPilot软件对数据进行分析处理,对Swiss-Prot protein数据库进行检索查询,对所得肽段进行分析鉴定及相应的统计学分析,利用MS/MS中同一肽段不同报告基团的比值来进行相对定量,从而进行差异蛋白的筛选。对比查询gene ontology数据库和KEGG pathway数据库,对差异蛋白进行GO分析和pathway分析。结果 利用iTRAQ技术与串联质谱相结合的分析方法筛选得到ESCC与健康对照蛋白质共237个,在ESCC组和健康对照组差异表达的蛋白质为19个,其中在ESCC中上调的蛋白质为4个,分别为细胞外基质蛋白1、抗凝血酶因子3、软骨寡聚基质蛋白、白蛋白;在ESCC中下调的蛋白质为15个,分别为人类补体因子H相关蛋白1、间-胰蛋白酶抑制因子重链H4、C4补体结合蛋白、丛生蛋白、基膜聚糖、载脂蛋白2、果糖二磷酸醛缩酶及IGHA2、IGLC2、IGHA1、IGKC、Ig heavy chain Ⅴ-Ⅲ region BRO、Ig kappa chain Ⅴ-Ⅱ region TEW、Ig kappa chain Ⅴ-Ⅰ region Walke、Ig heavy chain Ⅴ-Ⅰ region V35等。GO分析与PATHWAY分析结果提示,19个差异表达蛋白质主要参与免疫、细胞粘附、代谢、应激反应、细胞凋亡等过程。其中COMP, ECM-1和LUM这三个细胞外基质蛋白被多项研究证实其与肿瘤的发生发展进程及预后关系密切,本研究发现ESCC患者血浆中这些蛋白表达异常,可能通过参与粘着斑通路、TGF-β信号通路、ECM受体通路等过程的调控参与食管癌的发生发展。结论 利用蛋白质组学技术初步获得食管鳞状细胞癌血浆相关蛋白质谱,可能成为候选蛋白标志物用于食管癌的早期发现与诊断。
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  T2.63 Tebuconazole 430 g·L^-1 SC的鱼类生物富集性

  邵孝露;陈珊;叶红阑;张小艳

  2013, 27(S1): 59-59.

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  目的 本实验以生物富集系数(BCF)的大小评价供试农药的生物富集性。方法 实验选用斑马鱼作为实验物种,在与实验相同的条件下驯养1周后进行正式实验。正式实验设计浓度为0.087和0.87 ai mg·L^-1两个浓度处理组以及一个空白对照组。每个实验组设置2个平行,每个平行放置30尾实验鱼。实验周期为192 h,采用半静态暴露方法,每96 h更换一次实验液。实验条件为14 h光照:10 h黑暗的光照周期,保持水温在21~25 ℃,pH在6.0~8.5范围,溶解氧浓度不低于5 mg·L^-1,实验期间实验鱼每天观察及喂食1次,喂食量约为实验鱼体质量的1%。在实验暴露开始后0, 24, 48, 96, 144和192 h分别从各实验组取鱼样与水样,使用气质联用仪分析测定鱼样与水样中的供试农药浓度,用空白对照组实验液中农药浓度校正处理组中的农药浓度,计算实验结束达到平衡时鱼体内及实验液中的农药浓度之比得生物富集系数(BCF)。结果 实验期间实验液水温控制在22.0~24.9 ℃,pH和溶解氧浓度分别在6.29~7.88和5.16~7.88 mg·L^-1范围内。实验期间实验鱼生长正常,累计死亡率为0%,无异常行为现象。鱼体对供试农药在实验开始后24, 48, 96, 144及192 h时的BCF在低浓度处理组中分别为11.248,12.103,13.678,12.500,10.262;在高浓度处理组中分别为12.477,12.459,17.851,12.328,13.581。结论 供试农药Tebuconazole 430 g·L^-1 SC的生物富集系数(BCF8d)在低浓度及高浓度处理组中分别为10.262和13.581,根据农药生物富集性等级评价标准,Tebuconazole 430 g·L^-1 SC为中等生物富集性。
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  T2.65 呋虫胺挥发性试验

  陈亮

  2013, 27(S1): 60-60.

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  目的 研究呋虫胺在玻璃表面(空气)的挥发性,为进一步的环境行为研究提供基础数据。方法 分别称取0.000426, 0.000438, 0.000427 g供试品于9 cm直径培养皿中,置于气流式密闭系统中。在室温条件下,空气以500 ml·min^-1的流速通过密闭装置中的培养皿表面,使挥发出来的供试品随气流通过三级的吸收管,截留在吸收液中,24 h后,将三个吸收管中的吸收液收集在同一个容量瓶中,并定容至500 ml,测定吸收液中供试品含量,即为供试品的挥发量。同时将培养皿中的供试品用实验用水溶解后定容至50 ml,测定残留的供试品含量,即为供试品的残留量,实验过程中设置3个平行。同时设置两个对照组,一个为供试品加入量为0.000428 g的不经气流对照组,另一个为不加供试品(CK0)的对照组。最后通过测定吸收液及介质中供试品的含量,评价供试品的挥发性。结果 呋虫胺在空气中的挥发率为0%。挥发性试验回收率范围为108.0%~109.5%,满足回收率不低于70%的测试有效性要求。结论 供试品呋虫胺在玻璃表面(空气)的挥发性等级划分为"难挥发"。
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  T2.66 某地区水环境遗传毒性监测和风险评估

  潘丽波;张金良

  2013, 27(S1): 60-61.

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  目的 通过某区域内水环境样品的人外周血淋巴细胞微核和umu的测定监测,探索开展水环境环境遗传毒性及其致癌风险水平的评价,为流域环境污染及风险评价提供科学依据。方法 在项目规定的行政区域内,沿境内主要河流选择若干乡镇,自上游开始沿河采集地表水样和地下水样,选择远离河流,且癌症死亡率低的乡镇为对照。2011年在9个乡镇共采集地表水样7个,地下水样41个;每个水样采样量为2L,使用HLB固相萃取柱浓缩,丙酮洗脱后DMSO定容,采用人外周血淋巴细胞微核试验(胞质分裂阻断法)检测水样的微核千分率(MN‰),并计算污染指数值(PI)值,评价水质污染程度;采用SOS/umu试验测试水样导致的β-半乳糖活性酶生成量,并计算遗传毒性强度R值、TEQ4-NQO值及致癌风险水平。结果研究结果显示, 研究区域内地表水和地下水均具有一定遗传毒性,研究取得的成果结果如下:(1)2011年研究地区地表水环境样品的MN‰为(22.3±2.81)‰,PI为4.36±0.41,总体水质为重度污染;沿岸浅层地下水的MN‰为(9.6±3.56)‰,PI值为2.04±0.33,总体水质为轻度污染;近岸浅层地下水的MN‰和PI值为(11.9±2.74)‰和2.63±0.13,分别是远岸浅层地下水的1.46倍和1.45倍。(2)在不加体外代谢活化系统条件下,umu检测结果显示,2011年研究地区地表水样品的β-半乳糖苷酶活性值(IU值)为367.08±93.89,R值为2.69±0.69,结果显示为阳性效应;浅层地下水的IU值为243.24±61.97,R值为1.52±0.40,结果显示阴性效应,其中测试结果为阳性的样本量约占总样本量的20%。近岸浅层地下水的IU值为262.55±107.07,是远岸(202.45±46.12)的1.3倍;R值为1.81±0.51,是远岸(1.32±0.30)的1.4倍。(3)umu监测而结果还显示,地表水样品的TEQ4-NQO值为0.410±0.185,浅层地下水的TEQ4-NQO值为0.054±0.033。;近岸浅层地下水TEQ4-NQO值的为0.049±0.036;是远岸浅层地下水(的为0.025±0.023)的,近岸浅层地下水的TEQ4-NQO值是远岸的2倍。地表水样品的致癌风险水平为3.62E-06±1.32E-06,浅层地下水的为3.99E-07±3.93E-07,;近岸浅层地下水的致癌风险为3.54E-07±1.28E-07,远岸浅层地下水的为2.50E-07±1.04E-07,近岸浅层地下水的致癌风险水平是远岸的1.4倍。(5)人外周血淋巴细胞微核率和umu的监测结果具有良好的相关性,2011年浅层地下水的PI值与R值相关性系数为0.8551,两年的PI均值与R值的相关性系数为0.907。2011年浅层地下水的PI值与TEQ4-NQO值相关性系数为0.938,2012年的为0.878。结论 地表水的遗传毒性和致癌风险水平大于浅层地下水,远大于深层地下水;浅层地下水的遗传毒性和致癌风险水平随着距离河岸的距离增大呈递减趋势。
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  T3.14 注射用伏立康唑大鼠静脉给药3个月长期毒性

  周波;顾蕾蕾;乔红群;白文霞;刘晶

  2013, 27(S1): 74-74.

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  目的 观察静脉给予3个月注射用伏立康唑对大鼠所产生的毒性反应其严重程度,为临床更安全的用药以及不良反应的监控提供参考信息。方法 SD 大鼠150 只, 雌雄各半,随机分为高(50 mg·kg^-1·d^-1)、中(25 mg·kg^-1·d^-1)、低剂量组 (12.5 mg·kg^-1·d^-1)、空白辅料组(含助溶剂硫代丁基醚-β-环糊精钠)和5%葡萄糖溶媒对照组。每天1次, 每周6 d,连续13周,停药后观察14 d。给药及恢复期结束后, 进行血液和血生化检测, 剖检进行组织病理学检查。结果 高剂量1只雌性大鼠在第10周死亡。高剂量组从第4周开始出现不同程度的中枢神经系统症状,如呼吸加深,步态不稳、共济失调等,1~2 min后逐渐缓解。高剂量雌性大鼠体重在第4, 6, 12和13周增长缓慢。各给药组对大鼠摄食量均无明显影响。各给药组对大鼠血液学指标均无明显影响。空白辅料组肌酐值升高(P<0.01)。各剂量组和空白辅料组甘油三酯均降低(P<0.01)。恢复2周后低剂量组和空白辅料组TG值较低(P<0.05)。各剂量组的肝系数较高(P<0.01)。各剂量组和空白辅料组肾系数均较高(P<0.01)。恢复2周后高剂量和空白辅料组的肾系数仍较高(P<0.01)。各剂量组和空白辅料组的肺泡腔内均见泡沫细胞,肝均见肝细胞点状坏死伴/或纤维细胞增生;中、低剂量组肺泡沫细胞数量较少,肝病变程度也较轻;各剂量组和空白辅料组肾小管上皮细胞明显空泡变,严重者核消失,但基底膜完整。恢复期的病理结果显示,肺泡腔内泡沫细胞数除高剂量组个别例外,各剂量组和空白辅料组均明显减少。而肾的病变性质和程度,各给药组和空白辅料组未见恢复。肝未见明显病理改变。结论 建议在临床应用伏立康唑时重点注意观察患者肝、肾以及肺功能以及形态结构方面的变化;同时应注意观察对患者中枢神经系统方面的影响。
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  T4.5 基于脂运载蛋白骨架的抗体库构建与农兽药残留抗体的筛选

  宁保安;刘建青;范献军;赵丽;彭媛;白家磊;高志贤

  2013, 27(S1): 123-124.

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  目的 利用核糖体展示技术筛选农兽药特异模拟抗体,为农兽药的快速现场检测提供高特异性检测抗体。方法 PCR法全基因合成优化后的BBP基因,设计包含16个随机突变位点的引物,重叠引物延伸法合成基于脂运载蛋白骨架的模拟抗体库,同时采用重叠PCR技术将核糖体展示所必需的全部组件进行拼接,构建核糖体展示脂运载蛋白模拟抗体库。采用大肠杆菌体外转录翻译系统对将构建的模拟抗体文库进行体外转录和体外翻译后,产生了模拟抗体-核糖体-mRNA三联复合体文库。分别以农药久效磷、百草枯和兽药地西泮、雌二醇和为靶标,固相亲和方法和固液相交叉亲和筛选特异结合模拟抗体。通过改变Mg²⁺浓度将筛选得到的模拟抗体-核糖体-mRNA三联体解离,得到模拟抗体对应的mRNA,经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库并重新引入核糖体展示元件进行下一轮淘筛。通过多轮生物淘筛,抗原阳性的模拟抗体得到富集,最终获得高特异性模拟抗体。将该抗体序列在大肠杆菌中进行高效表达,经Western blot验证是否为目标抗体。竞争ELSIA方法测定模拟的抗体对靶标的特异结合活性、检测限与检测范围,表面等离子共振分析测定模拟抗体的亲和常数。结果 成功构建了核糖体展示脂运载蛋白随机突变模拟抗体库,该文库可以进行体外转录和翻译,在此基础上通过多轮生物淘筛,获得了百草枯、久效磷和雌二醇、地西泮等农兽药的特异性模拟抗体4种,在大肠杆菌中实现了模拟抗体高效表达,SDS-PAGE分析表明,抗体在大肠杆菌中主要以可溶性形式存在,目的蛋白占菌体破碎后上清的15%~25%,经金属螯合层析纯化,获得了模拟抗体纯化制品,纯度≥95%,直接ELISA检测结果表明,抗体仅与相应的小分子特异结合,与结构和功能类似物交叉反应率低于10%,竞争ELISA结果表明,模拟抗体对靶标的检测限在ppm-ppb级,检测范围2~3个数量级,模拟抗体的亲和力至少达到μmol级。结论 构建了以脂运载蛋白为骨架蛋白的核糖体展示模拟抗体库,利用该模拟抗体库成功筛选了四种农兽药残留物的模拟抗体,因为该模拟抗体库本身具有的通用性,理论上可以以任意抗原为靶标筛选其亲和抗体,这就为利用核糖体展示技术从模拟抗体库中筛选多种抗原特别是小分子半抗原的特异性模拟抗体奠定了基础。
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  T16.4 应用RNA干扰技术研究人支气管上皮细胞中5-脂氧合酶介导4-氨基联苯氧化活化与DNA损伤

  武越;朱宏翔;黄云;王静;胡建安

  2013, 27(S1): 289-290.

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  目的 采用RNA干扰技术研究人支气管上皮(HBE)细胞中5-脂氧合酶(5-LOX)介导4-氨基联苯(4-ABP)氧化活化与DNA损伤,进一步为LOX作为介导前致癌物氧化活化的代谢途径提供更有效证据,并为利用LOX siRNA沉默LOX发挥防治间接致癌物的致癌作用提供新线索。方法 用4-ABP分别染毒正常HBE细胞、载体对照(NC)细胞和经5-LOXshRNA处理细胞24 h,通过MTT实验检测4-ABP对各组细胞存活率的影响;用Western blot检测各组细胞5-LOX蛋白表达;用单细胞凝胶电泳实验检测各组的DNA损伤情况。比较4-ABP染毒对5-LOXshRNA细胞组与经特异性5-LOX抑制剂AA861处理组的细胞毒性和DNA损伤情况。结果 正常HBE组、NC组经4-ABP染毒24 h后,每组随着4-ABP浓度的增加,吸光度逐渐下降,细胞存活率降低,各浓度组间差异有统计学意义(P<0.05);相同染毒浓度下5-LOXshRNA处理组比NC组的细胞存活率高,特异性5-LOX抑制剂AA861组比阴性对照组细胞存活率高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4-ABP染毒均可以使正常HBE组、NC组和5-LOXshRNA处理组的5-LOX蛋白表达增加;加入AA861对5-LOX蛋白表达基本没有影响。经4-ABP染毒后彗星细胞阳性率增加,彗星图像尾部长度增长,尾距变大;正常HBE组经shRNA处理或加入抑制剂AA861后,彗星细胞阳性率下降,彗尾长度变短,且shRNA处理组变化更明显。结论 5-LOXshRNA和特异性5-LOX抑制剂AA861均可以抑制4-ABP引起的细胞毒性和DNA损伤,5-LOXshRNA抑制效果更为显著,更有效表明5-LOX参与了HBE细胞中4-ABP的氧化活化,可能与后者的致癌作用有关,提示LOX siRNA沉默LOXRNA干扰技术可能有利于作为4-ABP致癌作用防治的线索。
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  T16.5 小鼠甲醛暴露的免疫毒性及尿液小分子代谢物的生物标志

  韦海燕;孙蓉丽;陈悦;谈柯宏;尹立红;张娟;浦跃朴

  2013, 27(S1): 290-290.

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  目的 近年来,随着室内装修的日益普遍化,甲醛已成为现代室内空气污染的主要成分之一。甲醛因为代谢迅速,且有内源性甲醛的存在,目前甲醛暴露尚缺乏特异性生物标志物。免疫毒性在甲醛暴露时较早出现,同时也是导致机体组织器官结构、功能损伤的一个重要诱发因素。代谢组学通过分析生物体液中内源性代谢产物浓度的特征性变化,可为发现毒性相关的生物标志及作用机制研究提供科学依据。本实验以甲醛对小鼠的免疫毒性为特征毒性,探讨甲醛暴露及甲醛毒性相关的小分子代谢标志物,为甲醛的防护及毒性作用机制研究提供理论参考。材料和方法:选择健康清洁级BALB/C小鼠18只,随机分为3组,即对照组(0 mg·m^-3)、低剂量组(4 mg·m^-3)、高剂量组(8 mg·m^-3)。采用动式染毒柜对小鼠进行甲醛吸入染毒,每天染毒6 h,连续染毒7 d。收集小鼠染毒7 d时的尿样。检测血常规指标,计算脾脏系数、胸腺系数,脾T淋巴细胞增殖反应,并测定脾脏活性氧(ROS)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活力。采用液相色谱-飞行时间质谱(LC/TOF-MS)检测尿样中的小分子代谢物,Mass Hunter Qualitative Analysis软件采集提取数据,通过Mass profiler professional(MPP)软件进行主成分分析获得小鼠尿液的代谢特征,筛选出可能的生物标志物。结果:甲醛吸入染毒可引起小鼠脾脏系数、胸腺系数降低。脾T淋巴细胞增殖水平随染毒剂量增加而逐渐降低,并存在剂量-效应关系。甲醛吸入染毒可引起脾细胞ROS水平增加、SOD活性降低,除低剂量组ROS水平外,其余与对照组比较均有统计学差异(P<0.05)。对尿样小分子代谢物分析共找到12个差异代谢物,其中经LC/TOF-MS鉴定出马尿酸和甘氨酸两种代谢物。结论 甲醛可通过引起小鼠脾脏脂质过氧化损伤而导致免疫功能受抑制,脂质过氧化损伤可能是甲醛引起小鼠免疫损伤的机制之一。基于LC/TOF-MS的尿样小分子代谢物分析可筛检出甲醛暴露的生物标志物;马尿酸和甘氨酸代谢异常,提示甲醛暴露可能通过影响氨基酸代谢通路而引起毒性作用。
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  T16.16 大鼠体内香兰素衍生物的血药浓度测定及其药代动力学

  关华;王晓楠;;宋曼;王豫;蔡耘;钱小红;;周平坤

  2013, 27(S1): 296-296.

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  目的 建立测定大鼠血浆中香兰素衍生物浓度的高效液相色谱法,并应用于药代动力学研究。方法 雄性SD大鼠灌胃给予香兰素衍生物70 mg·kg^-1。采用高效液相色谱法测定香兰素衍生物的血药浓度,以香草醛为内标,流动相为甲酸-水溶液(0.1:100,V/V),色谱柱为安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus C₁₈柱(2.1 mm×50 mm,5 μm);进样量为10 μl,流速为40 μl·min^-1,样品洗脱时间为4 min,色谱柱平衡时间为5 min,柱温为室温。并按照药代动力学定量分析的要求对方法的特异性、精密度、基质效应、回收率及稳定性等进行了考察。结果 香兰素衍生物血药浓度线性范围是2~2000 μg·L^-1(r=0.9999),定量下限为2 μg·L^-1。丁香醛定量准确率在(91.2~110.7)%,低、中、高3个质量浓度的回收率为分别是(227.6±11.5)%,(119.2±0.5)%,(148.9±1.8)%,日内、日间精密度的RSD均小于15%。大鼠灌胃给予槲皮素70 mg·kg^-1后的最大血药浓度为(1435.4±881.7)μg·ml^-1,t_1/2为(78.0±44.6)min,AUC_0-∞药时曲线下面积为(18309.8±11063.7)μg·min^-1·L^-1。结论 方法专属性高,准确、灵敏,可为今后香兰素衍生物的药代动力学研究提供方法学依据。
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  T16.17 UPLC测定C57BL/6小鼠血浆中雷公藤内酯醇浓度及药动学

  吴娜;刘星雨;王笃军;刘彩娟;罗盼;魏渊

  2013, 27(S1): 297-297.

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  目的 建立测定C57BL/6小鼠血浆中雷公藤内酯醇浓度的UPLC法,探讨雷公藤内酯醇在该小鼠体内的药物代谢动力学过程。方法 血浆样品经盐酸酸化后,用乙酸乙酯萃取进行UPLC分析,流动相为乙腈:水(30:70),流速为0.2 ml·min^-1,检测波长为218 nm。C57BL/6小鼠分别单次灌胃给雷公藤内酯醇0.5,1.0和1.5 mg·kg^-1,测定血浆中不同时间点雷公藤内酯醇的浓度,并用DAS软件拟合并计算主要药动学参数。结果 血浆中雷公藤内酯醇在0.02~1.0 μg·ml^-1浓度范围内线性关系良好,提取回收率大于85%,日内和日间差异RSD均小于10%,符合生物样品分析要求 。小鼠灌胃给药三个剂量后,血浆中雷公藤内酯醇的药时曲线呈二室开放模型,低、中、高三个剂量的分布相半衰期(T_1/2α)分别为11.27, 7.84和6.78 min,消除半衰期(T_1/2β)分别为693.41,122.34和92.04 min。结论 采用UPLC法测定C57BL/6小鼠血浆中雷公藤内酯醇浓度操作方便、线性良好、灵敏度高的检测方法,并通过监测小鼠单次口服雷公藤内酯醇后血药浓度的变化, 对其药代动力学过程进行研究。
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  T16.18 Quantitative determination of four Sudan dyes in rat plasma with solid-phase extraction and UFLC-MS/MS analysis：Application to a pharmacokinetic study

  ZHU Hao;HUANG Kun-yu;CHEN Xiao-hong;ZHOU Lix-in;JIN Mi-cong;

  2013, 27(S1): 297-298.

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  OBJECTIVE To develop and validate for the simultaneous determination of four Sudan dyes (Sudan Ⅰ, Sudan Ⅱ, Sudan Ⅲ, and Sudan Ⅳ) in rat plasma for the first time, based on the ultrafast liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UFLC-MS/MS) method coupled with solid-phase extraction (SPE) procedure in order to reduce the complex matrix interferences and enrich the analytes.METHODS 30 rats were randomly assigned to five groups (blank edible oil group, Sudan Ⅰ group, Sudan Ⅱ group, Sudan Ⅲ group, and Sudan Ⅳ group) with six rats (3 males and 3 females) each.Sudan dyes (Sudan Ⅰ, Sudan Ⅱ, Sudan Ⅲ, and Sudan Ⅳ) were separately dissolved in 10 mg·ml^-1 edible oil and administered via a single oral (po) dose of 50.0 mg·kg^-1 to Sprague-Dawley (SD) rats.Approximately 20.0 μl of the rat blood sample (at 10.0, 20.0, 30.0, and 40.0 min and 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 and 24.0 h post-dosing for SudanⅠ and SudanⅡ;whereas 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 9.0, 11.0, 15.0, 20.0, 32.0 and 48.0 h post-dosing for SudanⅢ and SudanⅣ) was collected immediately centrifuged and cleaned using Cleanert C₁₈ mixed-mode polymeric sorbent.Quantification was performed by an electrospray ionization source in the positive multiple reaction monitoring mode using D₅-SudanⅠ as the internal standard compensated for any matrix effect variability, including extraction and ionization variations.RESULTS The pharmacokinetic results demonstrate that SudanⅠ, SudanⅡ, SudanⅢ, and SudanⅣ reached the maximum point in the plasma drug concentration of rats at about 0.6046, 1.362, 4.196 and 4.341 h after oral administration, respectively.The concentration decreased gradually with an elimination half-life (t_1/2) of 0.8374, 1.8102, 2.3909 and 2.364 h for Sudan Ⅰ, Sudan Ⅱ, Sudan Ⅲ, and Sudan Ⅳ, respectively.The absorption rate constants (k_a) of Sudan Ⅰ, Sudan Ⅱ, Sudan Ⅲ, and Sudan Ⅳ were 3.996, 1.393, 0.4368 and 0.4395 1/h, which were significantly greater than their elimination rate constants (k_e) of 0.8277, 0.3829, 0.2899, and 0.2932 1/h, respectively.The four Sudan dyes were easily absorbed and quickly accessible to the loop body of the SD rats.The phenomenon of rapid absorption possibly involves the specific and lipophilic chemical properties of the four Sudan dyes.Given the double phospholipid compositions of the cell membrane of the rat, the lipophilic Sudan dyes successfully and rapidly accessed the organic body.These results were in accordance with the maximum blood concentrations achieved at 630.91, 696.26, 349.39 and 1304.61 μg·L^-1 for Sudan Ⅰ, Sudan Ⅱ, Sudan Ⅲ, and Sudan Ⅳ, respectively.The areas under the concentration-time curve (AUC_0-∞) of Sudan Ⅰ, Sudan Ⅱ, Sudan Ⅲ, and Sudan Ⅳ were 1150.03, 2966.66, 2706.37 and 10 013.91 μg·h^-1·L^-1, which also indicated the high bioavailability of the four analytes.CONCLUSION The successful application of the UFLC-MS/MS method to the pharmacokinetic study of four Sudan dyes suggested its suitability and sufficiency for use in pharmacokinetic studies.
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  T17.14 化妆品原材料与终产品的动物眼刺激实验替代策略

  杨军;宋健

  2013, 27(S1): 307-307.

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  眼部刺激在化妆品原材料以及终产品毒理评估中是不可或缺的一个毒理学终点。眼刺激的实验是基于在眼部暴露化学物质后对结膜,角膜以及虹膜反应的综合评价研究。Draize实验于20世纪40年代被提出,被认为是研究眼刺激的较好的体内动物模型。尽管Draize兔眼刺激实验存在评分主观性强,实验室间差异性大等缺点,其现在依然是各国法规机构认可的主要方法,但随着欧盟对化妆品动物实验禁令的发布,全球领域内用于替代动物眼刺激实验的体外眼刺激实验被广泛的关注并得到了快速的发展。在过去的数十年中,一系列动物替代实验涌现而出,如离体组织型的牛眼角膜浑浊度及通透性试验(BCOP),离体鸡眼试验(ICE)和鸡胚绒毛尿囊膜试验(HET-CAM)等,细胞培养型的荧光素渗漏试验(Fluorescein Leakage)和细胞传感器微生理仪试验(Cytosensor Microphysiometer)等,以及重构人类组织模型的EpiOcular EIT和SkinEthic HCE 实验等,其中一些实验已被经济合作与发展组织(OECD)认证并在欧美等国家应用。这些实验对不同眼刺激水平的预测,刺激作用模式以及与测试物的物理化学性质兼容方面都有着相互互补之处。当前较为合理的动物实验替代方案是首先通过物理化学特性预判物质的刺激性程度,而后采用多步体外实验"自下而上(首先进行非刺激性试验)"方式准确识别非刺激物,采用"自上而下(首先进行刺激性试验)"方式准确识别严重刺激物。本文通过综述目前已被欧美接受的眼刺激替代实验方法并与动物学实验评估方法进行比较为化妆品原材料与终产品眼刺激替代方案提供思路与建议。
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  T17.1 Predictive and alternative methods for the safety assessment of cosmetic products：commitments & ach ievements

  JoséCOTOVIO

  2013, 27(S1): 298-299.

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  In Europe,the 7th Amendment to the European Cosmetic Directive has imposed a ban on animal testing for all toxicological endpoints(March 2013).This major change,due to increased societal concerns for animal welfare and current legislation constraints,implied a shift to alternative ways of assessing the safety of cosmetic ingredients.Anticipating this issue,a sustained and strong investment in the R&D for Alternative and predictive safety can be acknowledged from several sectors including academics,industries,trade associations and regulatory bodies in Europe and worldwide.Most refinements of current in vitro predictive and alternative methods for safety assessment resulted in scientific progresses that nevertheless remain driven in an industry perspective with the objective of perpetuating and insuring the consumer safety in the regulatory frame of the 7th amendment to the Cosmetic Directive.As a consequence,the industry entered a new phase for its innovation and R&D processes.One of the challenges is to move from a descriptive to a predictive(mechanistically-based)toxicology,focusing on the anticipation of the risk to human.As such,the emergence of new technologies and biological approaches are thought to offer great promise for filling in current toxicity data gaps with a sound scientific rationale.This will result in the availability of new tools and areas of research as:mathematical modeling,computational chemistry,biological profiling with novel-omic technologies combined with systems biology.Multidisciplinary teams have worked together to develop new safety evaluation paradigm.Strengthened efforts went through a stepwise process including:1)Evaluation of the performances of the predictive methods available on a significant number of cosmetic ingredients;2)Identification of the applicability domains of these methods in order to fit the chemical diversity that the cosmetic industry is facing;3) Definition of predictive approaches that integrate different types of data and information(read across,in silico models,physical-chemical characterization and in vitro methods)into the decision-making process;4)Implementation of these tools for routine safety assessment of new ingredients. Based on these principles,L'Oréal has developed test methods to screen substances and eliminate those showing potential adverse effects in the very early stage of the selection process.We have focused initially on approaches for skin tolerance(irritation and corrosion)using 3-D human epidermis models.After the R&D steps defining the predictive capabilities and applicability domains,the tests methods entered formal ECVAM validation processes resulting in the validation and implementation of the EpiSkinTM and SkinEthic RHE models test methods in the DECD guidelines.In addition,ongoing improvements allowed by using High-Performance Liquid Chromatography(HPLC)to expand applicability domain for interfering coloured chemicals.To strengthen the selection process,computational approaches using automated workflow algorithm were developed to predict molecule"s potential for skin irritancy based on existing in vitro Draize data. Moreover, specific refinement on data analysis,showed the usefulness of both validated EpiSkinTM and SkinEthic RHE test methods to identify skin corrosive subcategories,thus differentiating UN GHS 1 A from 1 B/1 C.Key steps of the approach will be presented.The practical approaches developed by L Oreal in the areas of eye irritation(3-D human corneal epithelium SkinEthic HCE),phototoxicity and genotoxicity(comet and micronucleus assays)will be also described. Recent work reinforcing the skin sensitization MUSST assay(method modelling the dendritic cell activation upon exposure to sensitizers)showed the ability of the test method to classify substances as Sensitizers or Non Sensitizers.However, it should be considered as part of integrated testing strategies using stepwise approaches for hazard characterization(CLP).Acute systemic toxicity evaluation is a prerequisite to eliminate strong toxics in early selection processes.A pragmatic approach based on the combination of data generated for multiple endpoints provided very promising results.Thus,applied to a set of 76 non-proprietary compounds,considerations of cell-death data,pharmacological profiles and physico-chemical properties resulted in a significant performance improvement when targeting a LDSO threshold of 500 mg·kg^-1,the sensitivity and specificity values were 85% and 89% respectively.However, efforts are still required to expand the applicability domain of the model and anticipate the complexity and diversity of ingredients in terms of chemical reactivity and classes of solubility profiles.Overall,the dissemination of advances on predictive alternative methods represents a step forward to promote innovative approaches to testing that could allow a safe development of new products without recourse to animal.
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  T17.2 The European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing

  Maurice WHELAN

  2013, 27(S1): 299-300.

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  The European Union is strongly committed to the Replacement, Reduction and Refinement of testing on animals (the "Three Rs" principle).The EU Directive 2010/63 on the protection of animals used for scientific purposes came into force in November 2010 and takes full effect from January 2013.It represents a significant increase in animal welfare with respect to previous legislation (e.g.Directive 86/609/EEC) and establishes a level playing field in the EU with regard to animals used in industry and academia.The Directive actively promotes and implements the principle of the Three Rs and establishes a clear legal requirement for the development, validation and use of alternative-to-animal approaches and methods.The European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing-EURL ECVAM, previously known as the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM, established in 1991) has a long and proud track record in the development and validation of in vitro methods for safety and efficacy testing of chemical substances and biological agents (e.g.vaccines) used in different sectors, whether for regulatory or research purposes.Under the new Directive, the mandate of EURL ECVAM has been broadened and strengthened and now includes "(a) coordinating and promoting the development and use of alternatives to procedures including in the areas of basic and applied research and regulatory testing;(b) coordinating the validation of alternative approaches at Union level;(c) acting as a focal point for the exchange of information on the development of alternative approaches;(d) setting up, maintaining and managing public databases and information systems on alternative approaches and their state of development;and (e) promoting dialogue between legislators, regulators, and all relevant stakeholders, in particular, industry, biomedical scientists, consumer organisations and animal-welfare groups, with a view to the development, validation, regulatory acceptance, international recognition, and application of alternative approaches."Concerning the development of novel alternative methods and approaches, EURL ECVAM is heavily involved in the research and coordination activities of SEURAT-1 (Safety Evaluation Ultimately Replacing Animal Testing-see www.seurat-1.eu), a major EU research programme aiming to fundamentally change the way we assess the safety of chemicals.The drive of SEURAT-1 is to move away from traditional animal experiments to embrace a safety assessment paradigm based on using mechanistic understanding of toxicology to intelligently integrate the latest computational and in vitro tools into predictive systems.SEURAT-1 was launched in 2011, and its 50 million Euro funded is provided equally by the European Commission's Directorate General for Research and Innovation and Cosmetics Europe, the industry personal care association.Research activities include microfluidic bioreactors with integrated sensors for cultivating liver tissue, toxicity assays based on human induced pluripotent stem cells, and computational models for in vivo to in vitro extrapolation and for predicting safety thresholds.Facilitating its coordination of validation activities within the EU, EURL ECVAM recently established the European Union Network of Laboratories for the Validation of Alternative Methods, or EU-NETVAL.Its mission is to provide support for EURL ECVAM validation projects and other activities including aspects of training and dissemination and the identification of methods that have a potential to replace, reduce or refine the use of animals for scientific purposes.EU-NETVAL also contributes to the development of guidance documents, procedures, training materials and collaboration tools that facilitate the development, validation, uptake and acceptance of alternative methods.Currently there are a total of 14 members of EU-NETVAL, including 13 test facilities from EU Member States plus the European Commission's own in vitro GLP test facility operated by EURL ECVAM, which coordinates the network. EURL ECVAM maintains the Database Service on Alternative Methods-DB-ALM (see http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu), an advanced information system to facilitate the dissemination and promotion of alternative (primarily in vitro) test methods. DB-ALM includes Method Descriptions which summarise information such as the scientific basis of a method and its intended purpose and application.DB-ALM also provides Protocols that detail the technical steps to implement a method to allow its transfer to end-user laboratories.The EURL ECVAM Search Guide (free from http://bookshop.europa.eu/en/the-eurl-ecvam-search-guide-pbLBN124391) provides search principles and procedures and practical user guidance to enable inexperienced database-users to find high quality information on alternative methods.EURL ECVAM is continually seeking collaboration with international institutions committed to the Three Rs and is an active partner in the International Cooperation on Alternative Test Methods (ICATM).It's our belief that only through coordinated global effort can the considerable advances being made in biomedical research and toxicological science be translated into effective and convincing methods and approaches that serve the needs of science, regulation and society but which avoid the use of animals.
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  T17.3 化妆品原料眼刺激体外替代试验检测策略的建立与评价

  杨颖;童珑;薛金玉;杨杏芬;黄俊明;谢晓萍;郑穗生;古梅英

  2013, 27(S1): 300-301.

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  目的 应用5种眼刺激性体外替代方法(包括鸡胚绒毛膜尿囊膜试验、绒毛膜尿囊膜-台盼蓝染色试验、荧光素漏出试验、BALB/c 3T3-中性红摄取细胞毒性试验和红细胞溶血试验),通过适用性及预测能力评价,建立化妆品原料眼刺激性替代方法应用程序,并对应用程序的适用性和有效性进行初步验证和评估。方法 选用5类29种已知眼刺激性分级的化妆品原料分别进行BALBc/3T3-中性红摄取细胞毒性试验、红细胞溶血试验、鸡胚绒毛膜尿囊膜试验、绒毛膜尿囊膜-台盼蓝染色试验和荧光素漏出 试验,同步进行传统的动物眼刺激性试验,用SPSS(ver13.0)统计软件对所得结果进行统计分析,建立化妆品原料眼刺激性评价的逐步检测策略并进行检测策略验证研究。结果 1.6种替代方法预测能力比较:以Draize试验结果为参照标准,计算6种眼刺激性替代方法试验分级结果的预测能力,分别得出区分无/轻刺激与刺激/腐蚀性的能力排序和腐蚀性与非腐蚀性的能力排序。2.预测模型的建立与评估:综合考虑6种替代方法对不同眼刺激级别日用化学品原料的预测能力和避免出现"假阴性"预测结果的原则,采用判别分析分别建立了相应的预测模型,根据预测模型的分级一致率和可操作性等因素,确定最佳日用化学品原料眼刺激性预测模型。3.检测策略的建立与评估:依据预测模型纳入的眼刺激性替代方法,结合各替代方法对不同刺激级别日用化学品原料的预测能力,确定化妆品原料眼刺激性评价的逐步检测策略流程图。将5类29种已知眼刺激性分级的化妆品原料回代入检测策略,对应用程序预测结果进行统计学分析发现:回代评估结果显示检测策略与动物实验的结果检测一致率为89.29%,检测策略与动物实验结果差异无统计学意义,两者存在等级相关性和分级一致性。结论 首次提出针对化妆品原料眼刺激性评价的逐步检测策略流程图;初步验证结果显示该策略与传统的急性眼刺激性/腐蚀性试验的检测结果接近,认为可用于洗发护发类、染发类化妆品的眼刺激性评价。
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  T17.4 国际合作下对人类重组3D皮肤微核试验模型的验证

  张洁;Stefan PFUHLER

  2013, 27(S1): 301-302.

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  目前对体外遗传毒理试验阳性结果的进一步验证主要为体内动物实验如骨髓微核试验等,然而,欧盟化妆品法第七次修正案规定自2009年3月后不再允许对化妆品成分进行体内动物实验,因此只能依靠体外毒理学判断,但是,传统的体外实验尽管对致癌物的检测有很高的灵敏度,但经体内试验证实也具有较高的假阳性率;因此单纯依靠传统体外遗传毒理学实验严重阻碍了一些本身安全却在体外试验中得到假阳性结果的新产品的问世。为了克服这一难题,宝洁公司与其他机构共同研发了基于EpiDermTM 3D人类重组皮肤的微核试验模型(RSMN),旨在寻求针对化妆品以及经皮暴露化合物的遗传毒理替代方法,而这也正是由欧洲化妆品协会和欧洲替代方法验证中心所资助的体内动物实验替代方法全球验证项目的一部分。课题分为三期,Ⅰ期验证RSMN模型的可转运性、优化条件及实验室内的重复性;Ⅱ期验证模型的实验室间的重复性;Ⅲ期验证模型的预测性及进一步评估重复性。Ⅰ期:首先三个美国不同实验室(宝洁、IIVS及 MatTek)运用模型对丝裂霉素C和硫酸长春碱两个遗传毒物测试,得到一致性结果后模型被转运至欧洲两实验室(德国Henkel 及法国 L'Oréal)再次对上述物质测试,一致性的剂量依赖的阳性结果证实了模型的可转运性以及重复性;Ⅱ期:宝洁、IIVS以及L'Oréal三家实验室对3个编码化学物(非遗传致癌物:环己酮以及两遗传致癌物:乙基亚硝基脲和丝裂霉素C)测试,三家实验室均一致正确的预测了三种化学物的遗传毒性,初步证实了实验室内/间的可重复性;Ⅲ期:现已完成对29个编码化学物(8个真阳性、11个假阳性和10个真阴性)的检测,结果表明模型具有较高的预测性(>85%)及特异性;目前正通过对更多化合物的检测来评估模型的灵敏度。以上研究表明RSMN模型对不需代谢活化的化合物具有良好的应用前景,因此宝洁公司已扩展探寻此种基于重组皮肤的模型对于若经口暴露需代谢活化的物质的遗传毒性的预测性。在对6种此类化合物测试中(4-亚基硝氧喹啉、环磷酰胺、二甲基苯蒽、苯并[a]芘、二甲基亚硝胺和二苯并蒽)显示可以正确预测前4种物质,从而推论RSMN模型可正确预测大部分(但不是全部)需代谢活化的遗传毒物。因此RSMN模型不仅是经皮暴露遗传毒性体外预测的一个很有价值的新方法,而且为在传统体外实验中显示为阳性或难以定论的物质提供了重要的验证方法,这无疑对无法进行动物实验的化合物(如化妆品)的评估起到重要作用。
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  T20.40 雌二醇和4-羟基雌二醇对雌性大鼠脂肪和胆固醇代谢的影响

  王攀;伍一军

  2013, 27(S1): 379-379.

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  目的 了解雌激素对脂肪及胆固醇代谢的影响是否由雌激素受体介导。方法 使用去除卵巢的雌性SD大鼠作为绝经女性的动物模型,通过灌胃连续7 d给予雌二醇(E₂)或4-羟基雌二醇(4-OH-E₂),以及雌激素受体拮抗剂ICI 182,780,并检测实验鼠脂肪及胆固醇代谢水平的变化。使用实时定量PCR方法,检测瘦素、细胞色素P450代谢酶7A1、肝脏X受体以及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)基因的表达。结果 发现E₂或者4-OH-E₂处理大鼠的子宫重量增加,这一已知的雌激素受体激活所介导的效应可以被共同给予的雌激素受体拮抗剂所抑制。而与此相反,E₂或者4-OH-E₂处理导致大鼠体重、脂肪组织重量及血清中的胆固醇水平降低,与E₂相比,4-OH-E₂的这一效应更显著,但E₂或者4-OH-E₂的这一效应并不能够被雌激素受体拮抗剂所抑制,说明这些作用并非由雌激素受体所介导。在给予E₂或4-OH-E₂的大鼠肝中,一些与脂肪和胆固醇代谢有关的基因,包括瘦素、细胞色素P450代谢酶7A1、肝X受体以及PPARγ的基因表达均上调。推测这些基因表达上调导致了大鼠脂肪及胆固醇合成的抑制及降解的增强,从而介导了雌激素对心血管系统的保护功能。结论 4-OH-E₂相较E₂有更强的降低脂肪和胆固醇水平的作用,并且这种作用不是由雌激素受体激活所介导,而与肝中与脂肪和胆固醇代谢相关基因的表达改变有关。
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  T17.5 Alternatives to animal testing includes much more than in vitro alternatives

  Esther PATRICK

  2013, 27(S1): 302-302.

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  The EU marketing ban on use of ingredients tested in acute animal studies after March 9, 2009 and tested in repeated dose animal studies after March 13, 2013 is now in effect.This presents unique challenges to cosmetic safety assessors because fully validated in vitro alternatives are not available for all safety endpoints.At the same time companies doing business in China must provide safety data to satisfy "new to China" regulations for cosmetic ingredients.Thus, for a global company like Amway, whom tends to place products in multiple markets including EU and China, strategies that may be useful for meeting both requirements from EU and China are possible.The present article summarizes the methods used by Amway global safety group during the safety assessment of cosmetics.All of the methods are alternatives to animal testing, while at the same time, could effectively ensure the safety requirements of a product.For example, we would determine the acceptable exposure level of an ingredient by investigating its manufacturing process and its historical human exposure for food or medicine.We would also apply "read through" principle, which is adopted by chemical inventory safety initiatives like HPV, OECD SIDS, and EU Reach, to cosmetic ingredients to fill data gaps.Toxicity is determined by dose, applying threshold principles routinely used for food additives is warranted in some cases.In addition, in many cases the data mining strategies discussed in combination with in vitro alternatives and human clinical studies can adequately cover all safety endpoints with no new animal studies.
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  T17.6 联合利华21世纪毒理安全及替代方法开发战略

  李津;Carl WESTMORELAND;Paul CARMICHEAL;Ian MALCOMBER;Gavin MMAXWELL;Oliver PRICE;Julia FENTERM

  2013, 27(S1): 302-303.

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  联合利华安全与环境保障中心不断寻求将科学的新理念和新发展带入联合利华的产品成分的安全性和环境影响风险评估之中。目前支撑风险评估的毒理学以及生态毒理学不断迅速发展进步,2007年发布的美国国家科学院报告"21世纪毒性测试[TT21C]:愿景和战略"代表这样的一个里程碑,提出了可实现的安全评估革命性的理念:"不远的未来,几乎所有的常规测试将应用人体体外细胞或细胞株进行"。这个框架发布以来,美国,欧洲和中国都一致认同这一战略,并优先考虑实现这一愿景所需的研究项目,并付之实施。例如,经济合作与发展组织已经启动一个大型研究工作项目:"不良效应后果通路"[Adverse Outcome Pathway(AOP)],此项目涉及到环境毒性评估,因而又衍生"从源至效应后果途径"[Source to Outcome Pathway (S2OP)]风险评估新概念。联合利华与其扁布全球的科学合作伙伴一起积极推动这一科学新领域的拓展,并且集思广益开发新方法和新手段来实现基于TT21C/AOP 的消费者和环境安全的风险评估策略。我们的最终目标是在消费产品内化学品的安全科学决策中不再依赖基于动物毒理终端的信息结果,而是充分运用相关最新颖的科学研究成就和方法。自我们从2004年开展非动物替代方法以来,我们越来越强烈地体会到,跨学科的团队相互学习,交流,并紧密合作是成功的关键。研究中,我们针对风险评估的需求,提出尖锐的有针对性的实际关键问题,运用信息技术,结合数据建模的方法来实现。几个重点学科(包括机理化学,暴露学科学,数学建模和与生物相关信息和临床学科)变得越来越重要。目前,我们正在开展一些具体案例探索研究(www.tt21c.org):(1) 皮肤过敏的风险评估 目前正在探索基于AOP,由共价蛋白质结合引起皮肤致敏的风险评估方法的研究,这一方案已经经合组织讨论审议过。(2) 线粒体毒性风险评估 与中国军事医学院合作开展线粒体毒理通路的研究。项目探讨经由PGC-1a and Nrf2介导的造成线粒体功能丧失,引发心脏疾病及肝脏受损的化学物风险评估新方法。(3) 全身系统毒性风险评估(DNA损伤) 与美国哈姆纳研究院合作开展基于p53毒理通路介导的DNA损伤效应的研究。虽然一个毒理通路不能回答针对存在于身体中化学物的所有相关安全问题,但是,这样的研究却可以让我们有机会去探索如何将基于TT21C风险评估的各个相关因素综合地考虑并运用。这些毒理通路案例研究(以及其他有关人类健康和环境安全的研究)正使我们刚刚开始了解如何把基于毒理通路的非动物风险评估的方方面面信息汇集在一起,最终让我们有能力运用这些资料来完成针对消费者及环境安全决策。
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  T18.5 低水平职业性铅接触人群生物标志物间的关系

  杨红;张恒东;周倩倩;龚伟;朱宝立;李文超;周洋;王丽

  2013, 27(S1): 336-336.

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  目的 通过测定分析铅接触生物标志物、效应标志物及易感性标志物的关系,探讨铅毒性生物标志物用于评价低水平职业性接触铅人群健康危害的可行性、敏感性和特异性。方法 应用职业卫生检测的方法,测定江苏省某中型铅酸蓄电池生产企业作业场所铅烟与铅尘浓度,以及该企业233名职业性铅接触工人和76名非职业性铅接触工人的血铅(Pb-B)、尿铅(Pb-U)、锌原卟啉(ZPP)、血δ-氨基乙酰酮戊酸脱水酶(ALAD)、尿δ-氨基乙酰丙酸(ALA-U)、ALAD基因多态性,多元线性回归法分析其相关关系。结果铅烟接触岗位18个检测点浓度为0.002~0.019 mg·m^-3,铅尘接触岗位30个检测点浓度为0.004~0.013 mg·m^-3;多元线性回归分析结果显示,233名职业性铅接触工人Pb-B与ALAD, Pb-U, ZPP相关;Pb-U与Pb-B, ALA-U, ZPP相关,≤70μg·L^-1的218人(93.6%)中,15人(6.9%)Pb-B≥400μg·L^-1;ZPP与Pb-B, ALAD, Pb-U相关,ALA-U仅与Pb-U相关,ALAD与Pb-B, ZPP相关;Pb-B<190 μg·L^-1时,Pb-B与ZPP不相关(r=0.18,P=0.068),与ALAD呈负相关(r=-0.81,P<0.01),Pb-B≥190 μg·L^-1时,Pb-B与ZPP呈正相关(r=0.36,P<0.01),与ALAD呈负相关(r=-0.65,P<0.01);Pb-B<400 μg·L^-1者,ALAD水平的95%参考值为26.57μmol·min^-1·L^-1;ALAD1, ALAD2等位基因频率分别为97.9%和2.1%;ALAD_1-2基因型工人Pb-B平均水平高于ALAD_1-1基因型工人,差异无统计学意义(P>0.05);ALAD1-2基因型工人ZPP水平、ALAD活性低于ALAD_1-1基因型工人,差异无统计学意义(P>0.05);ALAD_1-2基因型工人Pb-B≥300 μg·L^-1及Pb-B≥400 μg·L^-1比例高于ALAD_1-1基因型,两者差异无统计学意义(P>0.05);76名非接触铅工人中,ALAD_1-2基因型工人ALAD活性低于ALAD_1-1基因型工人(P<0.01),ALAD_1-2基因型工人Pb-B和ZPP平均水平高于ALAD_1-1基因型工人(P<0.01)。结论 低水平职业性铅接触人群中,Pb-B是较Pb-U更敏感的职业性铅接触生物标志物;ZPP和ALAD是较ALA-U铅更敏感的铅毒性效应标志物;ZPP与Pb-B相关的阈值为190 μg·L^-1,ALAD可作为较低血铅水平时毒作用的效应指标;ALAD基因多态性可影响非职业性铅接触人群Pb-B水平和其毒性效应。
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  T20.4 砷及其中间代谢产物对急性早幼粒细胞性白血病NB4细胞的作用

  那仁满都拉;张燕芳;张敏;周欣毅;孙天孚;孙无悔

  2013, 27(S1): 357-358.

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  目的 以急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4为研究对象,探讨亚砷酸钠(iAs^Ⅲ)及其中间活性代谢产物单甲基亚砷酸 (MMA^Ⅲ)、二甲基亚砷酸 (DMA^Ⅲ)对NB4细胞的作用,进一步研究其作用机制。方法 常规培养NB4细胞,暴露不同浓度的三种砷化合物,MTT法测定细胞存活率。瑞氏姬姆萨染色法、流式细胞术、Western blot和免疫荧光方法检测不同砷化合物对NB4细胞的分化和凋亡作用。结果 MTT结果提示对细胞毒性依次为DMA^Ⅲ>MMA^Ⅲ>iAs^Ⅲ。瑞氏-姬姆萨染色和流式检测CD11b实验提示iAs^Ⅲ可显著诱导NB4细胞分化,而其代谢产物MMA^Ⅲ和DMA^Ⅲ对细胞无分化作用。Western blot结果显示,iAs^Ⅲ有很强降解PML-RAR融合蛋白的作用,而MMA^Ⅲ和DMA^Ⅲ对其无降解作用。在诱导细胞凋亡试验中,Annexin/PI结果显示,对照组细胞凋亡率为13%;iAs^Ⅲ处理NB4细胞24 h,细胞凋亡率无显著增加(14%);MMA^Ⅲ和DMA^Ⅲ凋亡率分别为40%和50%。MMA^Ⅲ和DMA^Ⅲ诱导胱天蛋白酶3和PARP活化呈时间依赖性和剂量依赖性,Bcl-2显著下调,而促凋亡蛋白Bax从胞浆转移至线粒体,诱导大量细胞色素c释放,iAs^Ⅲ则无明显的变化。另外,发现MMA^Ⅲ与PML锌指蛋白结合亲和力远高于iAs^Ⅲ,但没有发现MMA^Ⅲ(或DMA^Ⅲ)能够降解PML-RARa融合蛋白。进一步发现,MMA^Ⅲ和DMA^Ⅲ同时不具备诱导PML核小体形成和SUMOylation。结论 iAs^Ⅲ主要起诱导NB4细胞分化的作用,提高iAs^Ⅲ作用浓度及时间亦可引起细胞凋亡, 而MMA^Ⅲ及DMA^Ⅲ主要以诱导细胞凋亡为主,并且二者诱导细胞凋亡机制不同,MMA^Ⅲ直接作用于线粒体,通过对线粒体的毒性引起细胞凋亡,DMA^Ⅲ则通过内质网应激通路引起细胞凋亡。同时还发现砷活性代谢产物无诱导NB4细胞分化、SUMOylation及降解PML-RARa融合蛋白作用。
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  T20.5 GSH和MRP1调节铅在睾丸支持细胞中的排出

  黄邵鑫;余君;周郎环;金珊珊;陈莉;王红;汪春红

  2013, 27(S1): 358-358.

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  目的 本研究利用TM4细胞(小鼠睾丸支持细胞株)探索铅在睾丸细胞中的蓄积与排出,以及铅的排出是否与MRP1(多重耐药蛋白1)和GSH有关。方法 在TM4细胞培养基中分别加入不同浓度的醋酸铅、MK571、BSO、EA处理24 h,CCK-8检测各实验组TM4细胞的活力;经典酶法检测各组细胞内还原型GSH含量和GSTs活力;酶标仪测定细胞内荧光阴离子蓄积量的方式确定TM4细胞MRP1的转运活性(荧光底物为calcein-AM);以0~100 μmol·L^-1的醋酸铅分别处理12和24 h后检测细胞内铅蓄积量;为了解TM4细胞排铅情况,用醋酸铅20 μmol·L^-1培养TM4细胞24 h后,换为分别加有能量代谢抑制剂叠氮化钠,GSH生物合成抑制剂BSO和MRP1转运活性抑制剂MK571的无铅培养基继续培养,再分别收集1, 3, 6, 9和12 h各时点细胞,石墨炉原子吸收法检测细胞内铅含量运,以BCA法测各自总蛋白含量进行标化。用qRT-PCR法 检测细胞中MRP1基因mRNA表达。结果 (1)随着醋酸铅处理浓度增加,TM4细胞活性呈先增高后降低的趋势,且当醋酸铅处理浓度达到100 μmol·L^-1,细胞活性降低至对照组的 54%(P<0.05);抑制剂MK571, EA和BSO的剂量低于50 μmol·L^-1时,TM4细胞的活性与对照组比差异无显著性(P>0.05)。(2)随加入醋酸铅的浓度的增加,还原型GSH的含量呈先增高后降低的趋势,细胞内GST活性则呈持续上升的趋势;同时加入醋酸铅和BSO组的GSH含量显著低于单加醋酸铅组(P<0.05)。(3)TM4细胞转运活性随MK571浓度的增加而降低,随醋酸铅浓度的增高而增加。(4)随加入醋酸铅浓度的增加,细胞内铅含量明显增加(P<0.05),且相同醋酸铅浓度处理下,12 h时点细胞中的铅含量显著高于24 h(P<0.05)。(5)铅处理TM4细胞24 h后换为分别加有抑制剂叠氮钠、MK571和 BSO的培养基继续培养1~12 h不等,检测显示换无铅培养基3, 6, 9和12 h各时点细胞内铅残留量显著高于对照组(P<0.05),即抑制剂延缓细胞内铅的排出。(6)qRT- PCR结果显示,加入0, 5, 10, 20 μmol·L^-1的醋酸铅处理TM4细胞6和12 h,MRP1基因表达变化差异无显著性(P>0.05);当醋酸铅处理时间达24 h,MRP1 mRNA表达随醋酸铅浓度的增高而显著上调(P<0.05)。结论 铅能够在TM4细胞中蓄积,细胞内铅的排出依赖于还原型GSH以及消耗ATP的外排泵-多重耐药蛋白MRP1。
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  T17.17 一种新型的在体外皮肤过敏检测方法(KeratinoSens)的验证和应用

  Hans RAABE;Nicole BARNES;Allison HILBERER;Andreas NATSCH;Kimberly NORMAN;Nathan WILT;ZHANG Quan-shun

  2013, 27(S1): 308-309.

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  确定个别化学品和产品成分诱发过敏性接触性皮炎(皮肤过敏)的潜在可能性是筛选用于消费品和工业产品的新成分的关键的毒理学终点。虽然已经存在用于评价化学品的皮肤过敏的可能性的活体动物检测方法,但利用人源的细胞系,来预测人体皮肤过敏原的体外非动物试验方法业已开发成功。发展以人源细胞为基础的体外检测系统的目的:应对在产品研发过程中禁止使用动物的国际监管要求,同时以满足主动选择在安全测试中使用非动物试验的企业的需求。KeratinoSens检测方法是由Givaudan公司开发的。最近在国际上经过了多个实验室的验证评估。KeratinoSens检测方法是一种基于人源的可长期培养的角质细胞的报告基因的检测方法, 用于鉴定可能诱发人类皮肤过敏的化学物质。所有化学过敏原的一个特点是其固有的亲电性(或其转化为亲电性的化学产品的潜力),当其与皮肤的蛋白质反应后形成半抗原复合物。从机理上讲,胞间的Nrf--2-亲电子感应通路能感应皮肤致敏原。 其组成包括阻遏蛋白Keap1,转录因子Nrf2和抗氧化反应元件(ARE)。在KeratinoSens检测中,报道基因荧光素酶基因,在抗氧化反应元件(来自于人类基因AKR1C2基因)的控制下,其诱导的程度通过测量处理后的细胞的相对光输出量来确定。同时,用MTT法确定处理后的细胞的活性。在多中心的验证过程中,28种化学品(19种具有不同的致敏能力的致敏原,和9种非致敏原在5个实验室进行了验证,其中每种化学品至少进行了3次验证实验。验证试验中发现该检测方法的预测能力,在实验室与实验室之间非常接近,范围从85.7%至96.4%。随后通过进一步的检测更多的化学品,化学品的混合物,工业溶剂,和复杂的产品介质等进一步确定了该方法的适用性和预测能力。到目前为止,使用KeratinoSens检测方法已经评估了超过150种化学品,表明其具有较好的预测能力(79.5%)。结果表明,KeratinoSens方法可能是一种可用于评估范围广泛的各种材料的致敏能力的相关的和可靠的检测方法,。该报告将告诉大家我们从多中心验证试验中发现的该检测方法的突出表现以及我们从中吸取的经验教训。
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  T17.18 两种体外评价皮肤刺激性/腐蚀性试验方法的比较

  梁志明;;杨颖;邓文锴;杨杏芬;黄俊明;谢晓萍;郑穗生;古梅英

  2013, 27(S1): 309-309.

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  目的 建立体外皮肤刺激性/腐蚀性评价替代试验方法大鼠经皮电阻试验(TER)和小鼠皮肤功能完整性试验(SIFT),并初步评价两种试验方法在皮肤刺激性/腐蚀性评价中的应用价值。方法 采用10种化学物初步建立TER试验,并用36种化学物进行TER试验,统计分析TER试验结果与动物试验结果的一致性,探索TER试验的适用性;献选用12种不同化学物初步建立SIFT试验,并选用36 种化学物进行SIFT试验,统计分析SIFT试验结果与动物试验结果的一致性。结果 1.TER试验对化学物的腐蚀性判别结果:TER试验对36种化学物的腐蚀性判别结果与动物试验的结果具有较高的一致性(Kappa=0.823, P=0.000),差别无统计学意义(McNemar-Bowker, P=0.070)。2.SIFT试验对化学物的刺激性判别结果:SIFT试验对36种化学物的刺激性判别结果与动物试验的结果具有较高的一致性(Kappa=0.858, P=0.00),差异无统计学意义(McNemar-Bowker,P=0.453)。3.化学物SIFT试验与TER试验方法一致性分析:比较36种化学物的SIFT试验结果与TER试验结果,显示SIFT试验结果与TER实验结果有较好的一致性(Kappa=0.804,P=0.000),两种实验结果的差别无统计学意义。SIFT在检测腐蚀性化学物中假阳性率较高(88.9%),对腐蚀性化学物预测性较差。SIFT试验对刺激性化学物的预测能力(灵敏度为90.0%,特异度为91.6%。ROC曲线下面积为0.850,P=0.112)高于TER方法(TER试验方法对刺激性化学物的预测灵敏度为62.5%,特异度为75.9%。ROC曲线下面积为0.492,P=0.007)。结论 1.TER试验方法和SIFT方法稳定,可作为评价化学物的皮肤刺激性/腐蚀性的体外替代试验。2.SIFT试验方法对化学物皮肤刺激性的预测能力优于TER方法;TER方法对化学物皮肤腐蚀性的预测能力优于SIFT试验方法。SIFT试验方法与TER方法共同应用作为皮肤刺激性/腐蚀性评价的初筛试验有良好的应用价值。
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  T17.19 组合CAMVA和BCOP方法预测个人护理品的眼刺激性

  秦瑶;黄健聪;程树军

  2013, 27(S1): 309-310.

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  目的 组合两种体外方法鸡胚绒毛尿囊膜血管试验(CAMVA)和牛角膜浑浊及通透试验(BCOP)评价个人护理品的眼刺激,为个人护理用品的眼刺激性的体外评价提供数据支持。方法 分别采用CAMVA、BCOP和Draize兔眼试验对45种个人护理产品进行测试,并预测眼刺激分类。CAMVA实验:将SPF级白莱航鸡胚孵育至第4天,吸取约3 ml蛋清后继续培养至第14天。开壳暴露CAM膜放置O形环,取40 μl(固体40 mg)不同浓度受试物直接加于环内,37℃孵育30 min后观察血管变化,观察阳性反应(充血、鬼影血管、出血等)鸡胚数,计算RC50(使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度)。以RC50>3预测产品无眼刺激性,RC50<3预测可能眼刺激性。BCOP实验:从屠宰场获得新鲜牛眼,放入冰冷HBSS运回实验室。分离并选取完好角膜装配于支架中。培养箱平衡1 h,移除前室培养基后加入750 μl受试样品,培养箱孵育10 min,去除受试物,后孵育2 h。读取角膜浊度。加入荧光素钠溶液,孵育90 min后收集后室液体,490 nm波长下读取吸光度值。计算体外评分(IVIS)=浊度值+15×吸光度值。如IVIS≤25,预测无/弱刺激性;2555,预测严重刺激性/腐蚀性。结果 采用CAMVA法可以全部区分33种无刺激性样品,采用BCOP法可全部区分12种刺激性样品,其中CAMVA与体内实验区分无刺激性样品的一致性为(84.8%),BCOP与Draize试验区分刺激性样品的一致性为83.3%。CAMVA和BCOP组合可对全部样品的眼刺激性正确分类,准确性达到100%。结论 CAMVA实验模拟结膜的损伤,对于检测化合物的从无刺激性到中度眼刺激性效果较好,适合作为个人护理用品配方、醇类物质和表面活性剂的筛选。BCOP实验适用于检测中度、重度和极重度眼刺激性物质,但对区分轻度到轻微水平的刺激物不太敏感。组合BCOP与CAMVA的整合试验策略可用于个人护理品的眼刺激评价,其预测范围可覆盖无刺激性到严重刺激性。
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  T20.60 基于iTRAQ的OPIDN相关蛋白筛选

  朱丽;伍一军

  2013, 27(S1): 390-390.

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  目的 以TOCP诱发的成年鸡迟发性神经毒性为中毒模型,通过iTRAQ技术筛选神经组织中有机磷引发的迟发性神经毒性(OPIDN)的相关差异表达蛋白,为进一步揭示OPIDN的机制奠定基础。方法 实验鸡随机分为3组:对照组,TOCP组,PMSF+TOCP组。TOCP组经灌胃一次给予TOCP 750 mg·kg^-1;PMSF+TOCP组皮下注射PMSF 60 mg·kg^-1,24 h后给予TOCP。每日观察实验鸡的症状。染毒后分别于2和7 d 取样,通过免疫荧光染色检查神经损伤情况,通过iTRAQ技术对神经组织的差异表达蛋白进行筛选,并运用生物信息学分析软件进行信息学分析。依据蛋白质的丰度水平,当差异倍数达到1.5倍以上,P<0.05为有意义的差异蛋白。结果 TOCP组实验鸡在第7天时出现轻微的共济失调,对照组及PMSF+TOCP组实验鸡行为正常。免疫荧光染色结果表明,TOCP染毒后出现轴突变性及脱髓鞘等损伤,而对照组及PMSF+TOCP组未见明显损伤。iTRAQ共鉴定出3090个蛋白,与对照组相比,染毒2 d的鸡共检测出39个差异蛋白,其中上调蛋白14个,下调蛋白25个;PMSF+TOCP组与TOCP组相比,共有129个差异蛋白,上调蛋白71个,下调蛋白58个;染毒7 d则有154个差异蛋白,其中上调蛋白77个,下调蛋白77个,而PMSF+TOCP组与单独TOCP组相比,共有39个差异蛋白,上调28个蛋白,下调11个蛋白。结论 筛选出与OPIDN相关的蛋白,在此基础上将进一步研究OPIDN的发生机制。
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  T20.61 U0126对肺动脉平滑肌细胞容量激活性氯离子通道表达的影响

  黎关龙

  2013, 27(S1): 390-391.

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  目的 观察ERK1/2通路抑制剂U0126对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)容量激活性氯离子通道(ClC₃)表达的影响,探讨ERK1/2对PASMC容量激活性氯离子通道的作用和机制。方法 麻醉处死,在无菌条件下分离雄性SD大鼠肺动脉平滑肌,采用分次酶消化法获取大鼠PASMC进行原代培养。取第2代细胞采用小鼠抗大鼠SM α肌动蛋白免疫荧光细胞化学法进行细胞鉴定。取第4至5代细胞,用无血清培养基培养24 h去血清同步化后随机分成3组:对照组、DMSO组、U0126组。继续在常氧(37℃、5%CO₂, 21%O₂)条件下孵育48 h之后收集细胞,采用免疫印迹法检测ClC₃蛋白和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)蛋白的表达,半定量逆转录-聚合酶链反应技术检测ClC₃ mRNA和细胞外信号调节激酶1(ERK1) mRNA的表达的表达。结果 与对照组比较, DMSO组ClC₃ mRNA和蛋白的表达量轻微上调,pERK及ERK1 mRNA的含量也略微增加,但两组差异无统计学意义;U0126组ClC₃蛋白表达量显著上调(P<0.05),ClC₃ mRNA表达量显著上调(P<0.01),pERK及ERK1 mRNA含量明显低于对照组(P<0.05)。结论 U0126能降低容量激活性氯离子通道的表达,其机制可能与ERK信号途径受抑制有关。
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  T17.20 一种用于体外测试的中国汉族人表皮替代模型

  卢永波;张荣芳;许珊珊;张艳云;李潇;罗惠娴;张勇杰;金岩;

  2013, 27(S1): 310-310.

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  2003年,欧盟化妆品规范第七次修订禁止了所有急性毒理学动物实验,促进人体皮肤体外模型的验证。目前已有三种体外皮肤模型得到了ECVAM科学顾问委员会的认证:SkinEthic^TM,EpiDerm^TM和EpiSkin^TM。然而,不同种族人群间的急性皮肤刺激反应的差异还尚不明确。本研究成功构建了中国汉族人体外皮肤模型(EpiKutis),并对其用于化妆品安全性、功效性测试进行了研究。EpiKutis采用12岁以下汉族儿童包皮组织分离的角质形成细胞为种子细胞,利用组织工程专利技术培养而成,通过组织学、免疫组织化学、透射电镜技术及脂质分析对其进行模型表征评价,并通过Triton X-100 ET₅₀评估模型屏障功能,从而建立测试的参数。EpiKutis的组织学结构与天然皮肤高度一致,具有基底层、棘层、颗粒层及角质层的复层化结构。免疫组织化学染色结果显示,CK14, Ki67, Integrin-beta1在基底层表达,表皮分化标记蛋白如CK10、外壳蛋白、丝聚蛋白在基底层上各层呈现阳性,与天然皮肤有着一致的分化模式。透射电镜下可见角质透明颗粒、被膜颗粒及半桥粒等结构。EpiKutis与中国汉族人的天然皮肤有着相似的脂质组成成分,说明模型具有与天然皮肤相似的脂质屏障。Triton X-100 ET₅₀表明该模型具有合适的皮肤屏障功能,能够阻碍测试化学品的快速渗透。参考OECD TG439指导原则,我们对20种标准化学品进行皮肤刺激性实验的预评估,测试结果表明EpiKutis模型的皮肤刺激性预测准确率达到85%。此外,我们还就化妆品配方进行ET₅₀的测试,结果同临床测试结果进行相关性分析,说明EpiKutis体外测试的结果与临床结果具有较高的一致性。除了对化学品、化妆品的皮肤刺激性测试之外,我们还利用EpiKutis作为紫外损伤研究模型。模型通过UVA/B的辐照作用,检测TNF-alpha,IL-1,IL-6,IL-8等促炎因子说明辐照保护剂具有抗炎,保护模型屏障的功能。该模型也可以发展衍生成为3D的光毒性测试模型等方法。EpiKutis与天然皮肤有着相似的结构和屏障功能,对于化学品刺激性的预测结果准确度高,与临床结果相关性好。不同种族人群对于不同的化学品可能会存在不同的测试结果,其机制有待更深入的研究。除应用于安全性评价之外,EpiKutis也可广泛应用于化妆品原料或成品的功效检测及其他皮肤病研究。
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  T17.21 利用干细胞建立发育神经毒性筛选实验

  黄健聪;秦瑶;谈伟君;程树军

  2013, 27(S1): 311-311.

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  目的 现行化学物发育神经实验的标准有美国环保署(EPA)颁布的OPPTS 870.6300及国际经合组织(OCED)颁布的TG426,这些实验均采用活体哺乳动物进行研究,费用高、耗时长,且难以满足当前新化合物神经发育毒性检测需求。由于多能干细胞(PSC)拥有独特的自我更新及定向分化能力,可分化为不同类型的神经细胞,适用于神经发育毒性(DNT)的研究。已验证的发育毒性试验小鼠胚胎干细胞试验(EST)无法完全满足DNT筛选要求。因此需建立基于干细胞的DNT筛选试验。方法 选择小鼠胚胎干细胞系,体外培养扩增,以成体神经干细胞(如大鼠神经干细胞、海马干细胞)和神经细胞为对照。体外诱导PSC向神经细胞方向分化,从可用的诱导方法(如"4-/4+法"、"五步法"、单层细胞分化法、默认模式介导方式、基质细胞诱导法和遗传工程介导法等)中,本研究选择基质细胞诱导法。经神经元特异性标志物或电生理鉴定后,疑似神经发育毒性化合物暴露,选择阳性对照(甲基汞、镉、纳曲酮等)和阴性对照(青霉素G)。选择的检测终点包含一个或多个神经发育的关键事件,如细胞增殖和凋亡、胚胎干细胞分化、神经细胞迁移、轴突树突生长和突触发生、神经胶质细胞分化和髓鞘形成、神经递质合成与功能等。综合应用分子、基因、蛋白、形态、功能等检测技术,观察和分析神经细胞的变化。结果 基于细胞的测试系统优点在于高通量、敏感度高。本研究建立的胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞的方法,以及由此建立的发育神经毒性研究,可用于神经发育毒性物质的检测。而且针对神经发育的不同时期,不同暴露时间,对特定毒性效应进行研究,通过多个检测终点的调整,可以满足化合物不同作用机制的研究。干细胞的三维培养可提供更接近与体内的环境,克服成体永生细胞系(如PC12、神经瘤细胞)等细胞类型的不足。结论 采用干细胞诱导神经分化建立高通量神经发育毒物筛选方法有效可行,可以满足对大量化学物快速筛选的要求,同时符合3R原则和基于毒性通路的现代毒理学发展趋势。
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  T17.22 镉和DDT的联合肝细胞毒性

  曹庆娟;许明圆;伍一军

  2013, 27(S1): 311-312.

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  目的 探讨镉与DDT共同存在时对肝脏的毒性是否会发生变化,以及导致这些联合毒性的可能的分子机制。方法 以人的肝癌细胞系HepG2为细胞模型,分别用高、中、低不同剂量的氯化镉和DDT染毒48 h,用MTT法来检测镉和DDT的混合物对肝细胞活力的影响;用溶酶体染料(Lyso-Tracker red)和中性红吸收法来检测溶酶体的形态和功能变化;用分子探针DCFH-DA来检测细胞内活性氧的产生水平;通过测定细胞内多种抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶)的活性或抗氧化物质(谷胱甘肽)的含量来监测细胞内氧化应激水平;用硫代巴比妥酸来检测细胞内膜脂的过氧化状况。用Marking相加指数法来评价镉和DDT之间的相互作用。结果 与各自的单独毒性相比,镉和DDT的联合作用能轻度降低细胞活力,使溶酶体体积增大,数量增多,降低溶酶体的功能;使细胞内活性氧水平升高,但需要更长时间或更高剂量;对细胞内超氧化物歧化酶的活性没有影响,而高剂量的镉却能降低其酶活性;使细胞内脂质过氧化水平随时间升高,而升高水平低于镉和DDT单独作用的水平之和;高剂量的镉和DDT联合染毒对细胞内过氧化氢的活性没有影响,但能使谷胱甘肽还原酶活性增高,谷胱甘肽的含量也升高。结论 镉和DDT对肝细胞的毒性存在较弱的拮抗作用,这种拮抗作用可能是由于镉和DDT共同作用时降低了细胞内的氧化应激水平所致。
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  T20.17 原花青素对递增负荷运动大鼠NADPH氧化酶亚基p67phox及细胞凋亡的影响

  李海山;刘威;赵鑫;谢文平;艾文超;陈会明

  2013, 27(S1): 366-366.

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  目的 通过在递增负荷运动过程中补充外源性抗氧化剂原花青素(OPC),观察对NADPH氧化酶亚基p67phox及Bax, Bcl-2表达的影响。方法 SPF级雄性SD大鼠72只,随机分为9组:2周安静对照组(C2)、2周单纯运动组(S2)、2周补充OPC+运动组(OS2);4周安静对照组(C4)、4周单纯运动组(S4)、4周补充OPC+运动组(OS4);6周安静对照组(C6)、6周单纯运动组(S6)、6周补充OPC+运动组(OS6)。运动组和运动+OPC组采用递增负荷游泳运动。运动+OPC组每天运动即刻后灌服OPC溶液,剂量为40 mg·kg^-1。观察运动后各组大鼠腓肠肌中NADPH氧化酶亚基p67^phox, Bax, Bcl-2蛋白表达以及Bcl-2/Bax比值的变化。结果 p67^phox蛋白表达:S4, OS4相比C4均升高,且S4与C4出现显著差异(P<0.05);S6相比C6极显著上升(P<0.01),OS6相比C6升高,且有显著差异(P<0.05),相比S6显著降低(P<0.05)。Bax蛋白表达:OS6相对于C6显著降低(P<0.05),相对于S6极显著降低(P<0.01),其余各组无差异。Bcl-2蛋白表达:OS6相对于C6 与S6均极显著升高(P<0.01),其余各组无差异。Bcl-2/Bax比值变化:S6与C6相比显著下降(P<0.05);OS6相对于C6与S6极显著上升(P<0.01),其余各组无差异。结论 递增负荷过程中补充外源性抗氧化剂原花青素,可以有效抑制p67^phox的过度表达,防止NADPH氧化酶的非正常激活,并通过减少凋亡基因Bax,增强抗凋亡基因Bcl-2来提高细胞的抗凋亡水平。且对于Bcl-2的影响更为明显。
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  T20.18 miR-218-1与其宿主基因SLIT2在食管癌中甲基化状态

  杨淼;刘冉;尹立红

  2013, 27(S1): 366-366.

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  目的 探讨DNA甲基化对miRNA表达水平的影响,以及与食管癌发病间的联系,以寻找可用于食管癌早期诊断、治疗以及判断预后的分子标志物。方法 提取手术切除的20例食管癌组织及其相应癌旁组织中的总RNA和总DNA,将提取出的DNA进行亚硫酸盐修饰及纯化,再利用巢式甲基化特异PCR方法检测miR-218-1启动子区的DNA甲基化状态。提取的总RNA利用实时荧光PCR的方法检测20例癌组织和相应癌旁组织中miR-218表达水平。结果 两株食管癌细胞株(EC9706,EC109)表现出了完全甲基化。20例食管癌组织中总体甲基化率为80%(16/20),对应癌旁组织中总体甲基化率为35%(7/20)。两者之间的差异有统计学意义(P<0.05)。而20对食管癌组织样本miR-218的表达水平明显低于其相应癌旁组织(P<0.05)。于此同时甲基化的组织中miR-218的表达水平明显低于未甲基化组织(9.98±1.78 vs 8.80±1.82,P<0.05)。结论 食管癌中miR-218-1的高甲基化是频发事件,可能是miR-218低表达的重要原因,因而是食管癌的发生、发展的潜在标志物。
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  T17.23 皮肤致敏性危害识别中替代方法的发展

  高原;Petra KERN;Cindy A RYAN;Leslie FOERTSCH;Joanna JAWORSKA;Frank GERBERICK

  2013, 27(S1): 312-312.

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  在化妆品成分的安全评估中,对皮肤致敏性的评估是一个重要部分,尤其是在化妆品成分具有显著皮肤暴露的情况下。识别化学物质的皮肤致敏性危害的传统方法是豚鼠试验,例如Magnusson & Kligman试验和Buehler试验。近年来,更先进的小鼠局部淋巴结试验(LLNA)被用来替代传统的豚鼠试验。LLNA仍然是体内试验,但它与豚鼠试验相比具有许多优势,例如能够提供定量的、更加客观的试验结果读数,减少动物使用量,以及缩短试验所需时间等。LLNA经过了深入的评估和审查,对大多数试验物质类型广泛适用。LLNA作为经合组织技术指南429号在2002年发布,并得到了世界许多地区的监管机构认可(如欧盟和美国)。目前LLNA仍是技术最为完善的首选体内试验方法。然而近年来,研究者们致力于开发替代试验方法,以满足世界各地的动物实验禁令要求。这些试验方法都旨在阐明皮肤过敏的生物信号通路中的一个或多个步骤。其中一些试验处于早期研发阶段,而另一些已在欧洲进入预验证的最终阶段。目前处于预验证最终阶段的替代方法有:直接肽反应性分析(DPRA,由宝洁公司研发),人细胞系活化试验(h-Clat),粒细胞皮肤致敏性试验(MUSST)以及KeratinoSens^TM试验。其中DPRA和KeratinoSens^TM试验已通过欧洲替代方法验证中心的审核并在等待最终审批。此外,还有许多产业界或学术界研发的新替代方法在欧洲化妆品协会或Sens-it-iv项目中处于开发阶段。欧洲化妆品协会为一项广泛的研究项目、方法发展和评估提供资金,旨在深入理解各关键途径如何在皮肤过敏的诱导中发挥作用,并开发体外试验方法。将一系列模拟关键途径的体外试验方法的数据进行整合,可精确地表征化学物质的皮肤致敏潜力。目前,已对几种数据整合的方法进行了研究,其中一种是宝洁公司发展的贝叶斯网络整合试验策略。该策略综合了计算机模拟,化学结构预测,以及有关化学反应活性、树突状细胞活化等的体外数据来预测皮肤致敏性危害。与传统动物实验相比,替代方法在动物福利之外还具有许多优势:替代方法基于机理,能够在结果预测与外推方面提供更好的指导。并且,替代方法提供了在产品研发早期阶段做出决定的可能性,优化评估流程,进而提高风险评估的效率。
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  T17.24 眼刺激性体外替代方法STE试验有效性

  张姝;许睿;安保孝幸;額田祐子;坂口斉

  2013, 27(S1): 312-313.

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  短时间暴露试验(STE试验)是一种使用SIRC细胞(兔眼角膜细胞),以一定浓度下受试物暴露后的细胞生存率作为毒性终点,来评估眼刺激性的体外替代试验。STE试验不仅能方便快速的做出评估,并且具有使用油溶性化学物质的溶剂评估非水溶性化学物质的优点。本研究对STE试验对眼刺激性试验的有效性进行了验证。为了验证STE试验对于眼刺激性评估的有效性,我们对STE试验和动物实验(Draize试验)数据的一致性进行了验证。在本次验证中,利用以Draize试验结果为依据的GHS分类方法,对STE试验的非刺激性物质和GHS不分类物质的一致性,及STE试验的强刺激性物质与GHS眼刺激性类别分类为 第1类物质的一致行进行了对比。结果表明STE试验对GHS不分类物质的预测性达到85%(84/99),对GHS第1类物质的预测性达到87%(83/95)。同时,将高挥发性物质等特定的化学物质类别设定为适用限界后,我们发现STE试验对非刺激性的预测性达到92.2%(71/76),假阴性的物质数由设定适用限界前的9种减少至1种。另外,我们对日美欧三处的试验机构进行了STE试验的技术指导与转移。并对3种水溶性物质及2种油溶性物质,共5种物质进行了技术转移的确认。结果表明,在上述所有的试验机构得到了和背景数据一致的鉴定结果。此外,我们以20种护肤产品为对象,进行了机构间的数据重复性验证实验,其中对于非刺激性区分的鉴定结果,达到了90%~100%的高度一致性。我们还对其中的一家机构,进行了另外34种化妆品个人护理品的进一步的验证。结果表明,STE试验的鉴定结果与开发机构的鉴定结果达到了完全一致。综上所述,STE试验是不仅具有良好的眼刺激性预测性,并且具有良好实验室间易转让性及高数据重复性的体外替代试验法。
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  T17.25 化妆品安全评价中替代方法的应用

  宋健

  2013, 27(S1): 313-313.

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  化妆品在上市之前应经过严格的安全评价以保证消费者在正常和可预见的使用条件的安全。这是企业的责任,也是各国监管部门的要求。化妆品的安全评价包括原料的评价和成品的评价两个主要部分。原料的安全评价与其他化学品评价一样,需要对所有的毒理学终点包括急性毒,慢(亚慢性)毒性,刺激性,致敏性,致突变性,致癌性等等进行评价。对成品的安全评价是在原料安全的基础上主要是对其局部耐受性包括皮肤及眼部刺激性和皮肤致敏性进行评价。 对化妆品的安全性评价,传统上沿用世界经济合作和发展组织(OECD)推荐的化学物质毒理学实验原则进行,这些方法基本上是动物实验。但由于动物实验的伦理问题,以及国际上对动物福利的日益关注,发展新的体外实验方法,减少、优化和替代(即3R)动物实验成为大势所趋。在技术进一步成熟的条件下,2003年,欧盟委员会通过了关于76/768/EEC的第七次修订,即2003/15/EC指令,明确了取消动物实验的时间表。指令明确规定自2009年3月11日起禁止使用动物进行化妆品急性毒性、眼刺激和过敏试验。2013年3月全面禁止化妆品动物实验,也不允许成员国从外国进口和销售违反上述禁令的化妆品。经过过去的数十年对替代方法研究,目前已有一系列成熟的动物替代实验可以用于化妆品的安全评价。这些方法主要集中在对局部耐受性的检测。体外重组皮肤模型EpiSkin和SkinEthic通过了欧盟验证,并于2010年7月最终被OECD TG439采纳用来代替家兔Draize法来进行皮肤刺激实验,目前可用于对化妆品的原料及成品的皮肤刺激性的检测。该方法改进后还可用于对原料和成品的光毒性进行检测。对光毒性的检测,OECD已认证了体外NRU 3T3细胞方法, 该方法只适用于可溶性原料的光毒性检测。对于眼刺激实验目前常用的有离体组织型的牛眼角膜浑浊度及通透性试验(BCOP),离体鸡眼试验(ICE)和鸡胚绒毛尿囊膜试验(HET-CAM)等, 其中一些实验已被OECD认证并在一些化妆品公司应用。并均可用于原料及成品的刺激性检测。这些实验对不同眼刺激水平的预测,刺激作用模式以及与测试物的物理化学性质兼容方面都有着相互互补之处。对于皮肤致敏实验,小鼠局部淋巴分析试验(LLNA)尽管一定程度上符合3R原则,并在2010年正式承认其作为替代方法可以替代豚鼠试验,但是该实验由于仍然需要动物而不能用于化妆品致敏性检测。目前OECD还没有发布认证的体外的致敏方法。根据皮肤致敏的机制而设计的一些离体试验,包括直接肽反应试验(DPRA), KeratinoSens分析实验,人体细胞株激活试验 (h-CLAT)以及骨髓U937皮肤致敏试验(MUSST)等。可组合应用,在一定程度上可以鉴别出皮肤致敏性。需要指出的是体外实验替代方法与动物实验一样只是预测受试无对人体使用的安全,产品的最终安全还需通过临床实验,乃至上市后的不良反应监测来进一步的保障。
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  T17.26 发育毒性检测策略新进展

  郑明岚;陆亮;潘晓靓;常艳

  2013, 27(S1): 314-314.

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  发育毒性评价涉及生殖周期中不同靶细胞/器官,毒作用模式多样化以及内分泌依赖性,因此毒理学筛选和鉴定化合物的发育毒性及作用机制是化合物安全性评价过程中面临最主要的科学挑战。目前列入OECD指南的几项标准化发育毒性试验均为动物实验,通过观察靶器官的受损,来分析判断化合物的发育毒性。发育毒性试验通常需要大量的实验动物和较长的实验周期,不仅费用昂贵,而且提供的毒性作用机制的信息有限。因此,建立替代实验来快速和可靠地鉴定化合物的发育毒性已经迫在眉睫。哺乳动物复杂的生殖系统特点,要求对毒性作用的生殖周期的多个方面进行分析,如致畸性、内分泌干扰、生殖细胞变异、损伤授精能力等。为了测试化合物对生殖周期中不同靶细胞/器官的毒性作用,目前经欧洲替代方法研究中心(ECVAM)验证的替代试验有3个,即体外全胚胎培养试验(WEC)、胚胎细胞微团培养试验(MM)和胚胎干细胞试验(EST)作为体外筛选的首选方法。尽管WEC, MM和EST方法用于检测化合物的胚胎毒性,显示出良好的预测能力,但仍存在局限性。胚胎毒性的体外试验只能检测结构改变,不能检测功能改变;单独的体外试验不可能模拟整个生殖周期来检测化合物的胚胎生殖发育过程中的毒性,每项测试仅能作为有限的检测窗口;体外细胞、组织、器官以及胚胎的代谢能力有限,体内、体外药代动力学参数不完全一致。计算毒理学已经成为了研究化合物毒性的一个很重要的辅助手段。它整合了包括毒理学、生物统计学、系统生物学、计算机科学和一些其他的相关学科,整合了从分子到器官水平所有信息。美国EPA进行的ToxCast研究计划的一个重要目标是建立计算机模型来预测化合物对人体健康可能的毒性,例如虚拟胚胎和虚拟肝脏项目。最终取代动物实验安全评估法(SEURT)研究计划的目的就在使用新型分子生物学与系统生物学数据。这些项目的目的将体外实验的单个毒理学终点与机制研究相结合,提高危险度识别能力以及危险度预测水平。由于毒性机制本身复杂多样以及毒性数据来源的广泛性和准确性限制,当前计算预测模型的发展还不能很好的运用于化合物安全性评价的过程中。以"3R"为中心原则的保护试验用动物指令 2010/63/EU和替代试验的验证,为发育毒性检测策略提供新方向。即组合体外测试、体内测试、计算机毒理学方法及其他替代方法和工具在内的联合检测体系,正确判断候选化合物的毒副作用,描述化学物完整的毒性特征谱及毒性作用机制,生殖发育毒性研究将得到新的发展和突破。
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  T17.27 组合STE试验、EpiOcular^TM试验和BCOP试验评估眼刺激性

  许睿;张姝;安保孝幸;額田祐子;坂口斉

  2013, 27(S1): 314-315.

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  检测化学物质眼刺激性的传统试验是Draize等提出的兔眼实验,Draize实验作为测定眼刺激性的国际标准被长久使用到现在。近年来,随着对动物保护呼声越来越高,一些国际组织和国家也在不断的鼓励发展替代(体外)试验。迄今为止,还没有单一的体外试验可完全替代Draize实验,因此将不同性质的多个体外试验方法组合,分阶段的检测眼刺激性是非常有效的。在本研究中,我们利用以Draize试验结果为依据的GHS分类作为对照,验证了使用由花王开发的兔眼角膜细胞的Short Time Exposure Test短时暴露试验(以下STE试验),人角膜上皮模型的EpiOcular试验(以下EpiOcular^TM试验)以及牛角膜混浊渗透性实验(以下BCOP试验)的组合试验体系的有效性。为了验证本试验组合对于眼刺激性评估的有效性,我们选择了113种不同化学物质进行了验证。我们以STE试验中5%受试物五分钟暴露后的细胞生存率,以及EpiOcular^TM试验中未稀释受试物暴露后的细胞生存率为指标,对所有化学物的非刺激性和刺激性进行区分,以此作为第一阶段试验。另外,在第二阶段试验以BCOP实验中牛眼角膜的混浊性和渗透性为指标,对被测化学物的强刺激性和非强刺激性进行区分。在本组合试验体系中,首先将可溶解于STE溶剂中的受试物应用STE试验,非溶解受试物应用EpiOcular^TM试验来区分受试物刺激性和非刺激性。其次,对被区分为刺激性物质的化学物进行BCOP试验,来区分其是否为强刺激性物质。同时,明确STE试验的适用边界,对于STE适用范围外的化学物质应用EpiOcular^TM试验进行鉴定。结果表明,STE适用范围外的13种化学物质中,有11种物质利用EpiOcular^TM试验得到了正确分类。最终,对于113种化学物质的GHS眼刺激性 3种分类的预测性达到74%,过小评估率8.0%, 过大评估率为17.7%。综上所述,利用STE试验、EpiOcular^TM试验以及BCOP试验的3种体外试验法进行阶段性的组合试验,不仅可以对广泛范围的化学物质进行评估、并且是预测GHS的眼刺激性区分的有效手段。
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  T17.28 中国皮肤刺激性体外替代测试的多中心研究：基于EpiSkin表皮模型的皮肤刺激性体外测试方法的验证

  王超;苏宁;程树军;曾静;邱璐;郑洪艳;李小林;李楠;EZHAO;JoséCOTOVIO;CAI Zhen-zi;Jean-FrançoisNADAUD

  2013, 27(S1): 315-315.

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  目的 根据OECD(经合组织)测试指南439规定的方法,验证使用EpiSkin表皮模型(中国生产)的皮肤刺激性体外测试方法的可实施性和结果的可靠性。国家质检总局的四个直属单位:中国检科院、北京局、上海局和广东局,以及欧莱雅中国研发和创新中心共同参与了此次验证研究项目,为在中国建立皮肤刺激性体外替代测试方法的相关标准提供科学的依据和认证的数据基础。方法 此次研究采用的测试方法是根据ECVAM (欧洲体外替代方法验证中心) SIVS 2007和OECD测试指南439制定的化学物EpiSkin皮肤刺激性体外测试方法(15 min加样/42 h培养)。测试终点是MTT法测定的细胞活性,并以细胞活性是否超过50%来分类刺激性和非刺激性的化学物。参照OECD测试指南439的规定,此次研究中对10种皮肤刺激性和10种皮肤非刺激性的化学物(UN GHS分类)的体外测试结果进行了分类。这20种标准化学物不但涵盖了广泛的物理特性,而且是用Draize兔皮肤刺激性测试方法分类的化学物的典型代表。结果 所有参加实验室所测得的阴性和阳性对照值均符合验证程序可接受的质量标准;化学物测试结果符合差异标准,所有实验室中每个化学物至少有3次有效轮次,且每轮次测试值的标准偏差SD≤18%。 基于20种标准化学物的中值分类法得出的结果,实验室内一致性均达到或超过90%;总体实验室间的结果再现率是95%。这表明该测试方法具有实验室内和实验室间的高度可靠性,总体预测能力的特异性(非刺激性)、灵敏性(刺激性)和准确性分别达到了70%, 94%和82%。结论 此次研究结果不仅符合ECVAM测试方法验证的要求规范,而且和OECD测试指南439中相关验证参考方法 (VRM) 的数据有很好的一致性。总体结果表明:利用EpiSkin表皮模型(中国生产)的皮肤刺激性体外测试方法,作为一种可全面替代传统Draize兔皮肤刺激性测试的体外测试方法,已经具备在中国进一步推广使用的技术基础。这是首次在中国按照国际替代方法的验证标准所进行的预测皮肤刺激性动物替代方法的科学研究,其研究成果为将来在中国建立起皮肤刺激性体外测试方法的相关测试指南以及相关标准提供了科学依据,并培养了现代毒理学和动物替代领域的相关技术力量。
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  T17.29 药物光遗传毒性的评价模型

  涂宏刚;欧红梅;黄鹏程;周长慧;王征;常艳

  2013, 27(S1): 316-316.

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  药物光遗传毒性评价模型分为两大类,体外模型和体内模型。体外评价模型由于操作简单,试验条件容易控制,一般作为药物光遗传毒性评价的常用方法。药物体外光遗传毒性评模型主要有光Ames试验(Photo-Ames)、光基因突变试验(Photo-HPRT/Photo-MLA)、体外光染色体畸变试验(Photo-CA)、体外光微核试验(Photo-MN)和体外光彗星试验(Photo-Comet)。1)Photo-Ames试验:目前应用最广泛的光遗传毒性评价模型,大部分药物的光遗传毒性数据都来自于该模型。该模型有2种模式,一种模式药物与细菌、琼脂混合后再经紫外照射,另一种模式是药物经紫外照射后再与细菌共同作用。2种模式没有标准的紫外照射剂量,一般根据细菌的照射剂量反应曲线确定。2)Photo-HPRT/Photo-MLA试验:一般选用V79和CHO细胞,在药物进行处理的过程中进行紫外照射。3)Photo-CA试验:可选用多种细胞,不同的细胞选用不同的照射光源/照射谱,一般根据细胞的照射剂量反应曲线确定。4)Photo-MN试验:目前的研究主要选用V79细胞,其对药物的光遗传毒性检测结果与Photo-CA试验一致,可以作为其替代试验。5)Photo-Comet试验:由Ostling和Johanson等建立,在药物进行处理的过程中进行紫外照射,是一个敏感的检测系统。药物体内光遗传毒性评模型主要有体内光彗星试验(Photo-Comet)和体内光微核试验(Photo-MN)。1)体内Photo-Comet试验:目前在SKH-1小鼠和SD大鼠上进行,动物经药物处理,经紫外照射后,取表皮细胞组织、角膜或视网膜进行彗星试验。2)体内Photo-MN试验:动物经药物处理,经紫外照射后,一般取皮肤组织进行微核检测。目前虽然国内外建立了很多药物光遗传毒性的评价模型,但由于没有统一的标准,且试验容易受到很多因素的影响,其在药物光遗传毒性评价上的应用还需进一步的验证和标准化。
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  T17.30 科学知识的国际共享与法定测试方法的调整

  ZHANG Quan-shun;Rodger CURREN;Hans RAABE;Erin HILL;Sandra COECK;Simon WEBB

  2013, 27(S1): 316-317.

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  在世界各地,研发和利用能更好地预测不良反应,而同时能减少或消除使用动物的毒理学试验方法,已成为越来越多的科学家的共同目标。其结果导致了在计算机毒理学,体外细胞培养,系统生物学,毒性途径分析,人体组织结构重建等领域的巨大进步。然而,仅仅一套新的工具本身的存在并不能改变进行毒理学试验的方式。为了实现从当前的以动物实验为基础的监管法规向基于影响人类生物学机理的认识的21世纪的先进法规的过渡,这需要来自学术界,工业界和监管界的科学家的沟通与承诺,甚至于政府间的政治合作。这种合作如何发生的一个很好的典范就是欧洲动物实验替代方法合作伙伴组织(EPAA)。 EPAA形成的目的就是促进法定的测试方法的转变。EPAA是由欧盟委员会,欧洲贸易协会,和来自于7个行业的公司组成的自愿性的合作组织。为了促进实现监管测试中动物使用的替代,减少和优化的3R原则,其合作伙伴成员承落致力于汇集知识和资源,加速动物替代实验方法的研发,验证和接受。尽管EPAA的主要合作伙伴是在欧洲,但该组织认识到监管法规的改变不仅涉及到国际科学界也涉及到各个政治团体。事实上,其主要任务之一是:"在国家,欧洲和国际上加强动物替代测试方法的验收,协调与相互承认"。为此EPAA在世界各地的许多国家,包括中国,俄罗斯和巴西,支持替代毒理学方法的科学教育和培训活动。特别是在中国,EPAA与总部设在美国的体外科学研究院(IIVS)合作,提供一些经合组织(OECD)认证过的在体外试验指导方法的讲座,培训和支持材料。在中国的其他培训项目,在需求与应用变得明显时也可以考虑设立。
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  T17.50 Systems biology of the liver-combining in silico and in vitro methods to understand mechanisms of hepatotoxicit

  Kas SUBRAMANIAN

  2013, 27(S1): 333-333.

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  Drug-induced liver injury is a major problem in drug development, both at preclinical stages as well as during clinical trials. Several methods have been developed to predict DILI with varying degrees of accuracy and applicability. However they are all only partially useful because this problem is inherently challenging. One of the challenges of understanding toxicity in the liver and other organ systems is the innate ability of biological systems to adapt. This adaptation can take many forms-feedback compensation;where the perturbation is sensed by the biological system and similar pathways are up-regulated to compensate for the inhibitory function, redundancy;where multiple pathways perform the same function, substrate or product inhibition, etc. These mechanisms make a biological system extremely robust to perturbation and paradoxically, extremely difficult to understand quantitatively. Systems Biology, where one mathematically models a biological system as a whole, using non-linear ordinary differential equations is an approach to understand complex adaptive mechanisms in a rational manner. We have used systems biology to map the pathways that underlie the major forms of liver injury observed in the clinic. A kinetics-based mathematical model of the essential pathways in the liver was then developed. This model accurately represents energy and anti-oxidant metabolism and is able to reproduce liver homeostasis and injury upon energy or anti-oxidant depleting stresses. It also replicates liver and whole system behaviour on induction of stresses that restrict bile flow. In addition, the model evolves to demonstrate fatty liver as a response to mitochondrial dysfunction as well as disturbances in fatty acid uptake. Thus the model is appropriately tuned to address all major forms of liver toxicity, namely, hepatocellular necrosis, cholestasis and steatosis. We used the insights gained from the modelling to design in vitro assays that measure key perturbations in liver pathways, including several enzymes and transporter systems involved in liver metabolism. We now combine the two approaches to assess hepatotoxic risk in the liver due to the presence of a drug or a chemical. We treat cells (either HepG2 or primary hepatocytes) with different concentrations of drugs or chemicals and measure their effects on enzyme or transporter activity as a function of dose and time. The activity is measured both as a direct effect, ie the effect of the chemical on the pathway and the adaptive effect, i.e. the adaptive response of the system to the perturbation. When the combined effects are fed into the systems model as an input, we can run simulations to study the effect of the perturbations on the liver as a whole. We will use several case studies to demonstrate the power and utility of this approach-to study combinatorial or synergistic effects of chemicals, to identify key perturbations, to study how the liver adapts to the perturbation and finally to assess "safe" and "toxic" ranges of exposure. We can combine this model with pharmacokinetic data and run virtual toxicity studies. We can study population-type effects;a major advantage of this system is that one can create virtual individuals that have different genetic, environmental exposures or disease phenotypes. One can study whether certain levels of exposure of chemicals pose risk to not just normal individuals but to individuals on a particular diet, or ones with a certain genotype or a disease background such as diabetes or metabolic syndrome. We will show that this combined in vitro systems biology approach has the potential to uncover insights into chemical-induced liver injury, identify concentration ranges that pose risk and uncover mechanisms, pathways and processes that are most vulnerable. This information can be used by the industry to design more effective and safe drugs and chemical products.
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  T17.31 SIFT试验方法的建立及在皮肤刺激性评价中的应用

  邓文锴;杨颖;杨杏芬;梁志明;黄俊明;谢晓萍;郑穗生;古梅英

  2013, 27(S1): 317-317.

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  目的 建立体外皮肤刺激性替代试验的新方法小鼠皮肤功能完整性试验(SIFT),并初步评价该方法在皮肤刺激性评价中的应用价值。方法 制作离体皮肤固定装置,用正常大鼠皮片固定于装置后的TER值及TEWL值变化及病理组织学变化来评价其可行性。选用12种不同化学物初步建立SIFT试验,并选用36种化学物进行SIFT试验,采用SPSS(ver16.0)统计软件对实验结果进行统计分析,评价SIFT方法的重复性、可靠性以及对化学物皮肤刺激性的预测能力。结果 1.SIFT试验方法的建立1 离体皮肤固定装置对皮片稳定性作用的评价:表皮无破损的离体小鼠皮片置于固定装置中32 h内,电阻值(ER)和皮肤水分流失速率值(TEWL)保持相对稳定,TEWL与ER变化曲线重复性一致,满足SIFT试验的要求。2 染毒体积的确定:分别以20, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225和250 μl作为染毒剂量对12种不同受试化学物进行试验,将各染毒体积组的ER与TEWL变化率分别与阴性对照组的变化率做t检验,评价不同染毒体积对化学物刺激性的预测能力。结果显示染毒体积在150μL以上的各组化学物的刺激性预测有较高的敏感度和特异度,预测能力较好。因此,选择150 μl作为SIFT试验的染毒体积。3 皮肤刺激性判断的界定值的确定:选取12种受试化学物进行SIFT试验,分析试验结果,比较不同的界定值对刺激性的预测能力,结果显示选择ER与TEWL变化率3.5作为判定皮肤刺激性的界定值的评价结果与刺激性数据库的一致性和预测能力要高于单独以TEWL或ER变化率作为指标。4 SIFT试验染毒时间的确定:染毒时间为4, 12和21 h的SIFT实验结果分别与化学物刺激性数据库进行Pearson χ²检验、McNemar-Bowker检验和Kappa检验,并分别计算灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率和ROC线下面积,结果显示21 h为SIFT试验方法的最佳染毒时间。2.SIFT试验应用于化学物刺激性检测的结果分析1 SIFT试验重复试验结果:36种受试化学物3次重复试验结果差异无统计学意义(χ²=0.039,P=0.851)。2 SIFT试验与化学物刺激性结果一致性分析:36种化学物的SIFT试验结果与已知的数据库结果进行Pearson χ²检验、McNemar-Bowker检验和Kappa检验。结果显示SIFT试验结果与已知的刺激性数据具有较高的一致性(Kappa=0.794, P=0.00),差异无统计学意义(McNemar-Bowker,P=0.185)。3 SIFT试验方法对化学物刺激性的预测能力分析:SIFT试验方法对刺激性化学物的预测灵敏度为90.0%,特异度为91.6%。ROC曲线下面积为0.850,P=0.112。结论 首次在我国建立了小鼠皮肤功能完整性试验方法,通过对化学物和化妆品成品的应用性研究,认为SIFT方法稳定,且有较好的皮肤刺激性预测能力。
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  T17.32 体外微核实验方法的建立及遗传毒性的测试应用

  杨颖;杨杏芬;李庆;黄俊明;陈美芬;李欣;陈秀娟;梁扬盛

  2013, 27(S1): 317-318.

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  目的 探讨采用自动图像分析系统建立体外微核实验方法,并应用于化学物质遗传毒性检测的研究。方法 选用12种已知遗传毒性的化学物质对中国仓鼠肺细胞进行染毒,在全自动图像分析系统中观察计算双核、多核细胞的复制指数(RI)和细胞毒性,确定体外微核实验的实验条件;同步进行小鼠骨髓微核实验方法、体外CHL细胞染色体实验,采用SPSS (ver16.0) 统计软件对体外微核试验与小鼠骨髓微核实验、体外CHL细胞染色体实验的遗传毒性结果评价分级结果的相关性和一致性、体外微核试验的可靠性以及预测能力。结果 1.体外微核试验的建立 分别对受试物进行1, 2, 3, 5和12 h染毒时间的处理,确定3 h作为正式试验的受试物处理时间;通过对5种染毒剂量浓度的化学物质进行染毒,结果显示体外微核试验存在明显的剂量-效应关系(F= 412.407,P<0.001)。2.体外微核试验结果及其分析 体外微核试验预测遗传毒性的灵敏度为100%、特异度为93.9%;和骨髓微核试验结果比较具有较高的等级相关性(Spearman R=0.943, P=0.000;Gamma=1.000, P=0.000)及分级一致性(Kappa=0.799, P=0.000);和体外哺乳动物细胞染色体试验结果比较具有较高的等级相关性(Spearman R=0.699, P=0.000;Gamma=0.893, P=0.000)及分级一致性(Kappa=0.553, P=0.001);12种化学物三次体外微核试验检测显示差别无统计学意义(F=0.439, P=0.646),说明体外微核试验具有良好的可重复性和稳定性。结论 通过对受试物处理时间、剂量反应关系等试验条件进行探索,在我国率先应用全自动图像分析系统建立了体外微核试验方法。体外微核试验与骨髓微核试验、体外哺乳动物细胞染色体试验结果具有较高的相关性和一致性,体外微核试验对受试物的眼刺激性具有较高的预测能力,试验方法较为稳定,结果可重复性和可靠性良好,是一种比较有潜力的遗传毒性试验方法。
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  T17.33 细胞毒性体外替代方法检测化学物质急性毒性

  曾丽海;赵敏;杨杏芬;杨颖;谭剑斌;黄俊明

  2013, 27(S1): 318-319.

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  目的 评价HepG2细胞中性红摄取实验、MTT实验、总蛋白含量实验预测急性毒性的能力,探讨这三种方法替代急性经口毒性实验的可行性。方法 分别采用HepG2细胞中性红摄取实验、MTT实验、总蛋白含量实验检测50种化学物质的细胞毒性,将IC₅₀结果与急性经口毒性实验LD₅₀值进行分析比较;IC₅₀值代入RC预测模型获得急性毒性LD₅₀预测值,并进行GHS急性毒性分级,将分级结果与急性经口毒性实验分级结果进行比较。结果 HepG2细胞中性红摄取实验IC₅₀值与急性经口毒性实验LD₅₀值存在相关性(r=0.778, P<0.01);分级结果与急性经口毒性实验分级结果具有等级相关性(r=0.712, P<0.01;Gamma=0.928, P<0.01)和分级一致性(Kappa=0.477, P<0.01),二者分级一致率为68.0%(34/50, McNemar-Bowker W=9.455, P=0.009);HepG2细胞MTT实验IC₅₀值与急性经口毒性实验LD₅₀值存在相关性(r=0.768, P<0.01);分级结果与急性经口毒性实验分级结果具有等级相关性(r=0.636, P<0.01;Gamma=0.824, P<0.01)和分级一致性(Kappa=0.444, P<0.01),二者分级一致率为66.0%(33/50, McNemar-Bowker W=5.267, P=0.153);HepG2细胞总蛋白含量实验IC₅₀值与急性经口毒性实验LD₅₀值存在相关性(r=0.726, P<0.01);分级结果与急性经口毒性实验分级结果具有等级相关性(r=0.673, P<0.01;Gamma=0.828, P<0.01)和分级一致性(Kappa=0.503, P<0.01),二者分级一致率为70.0%(35/50, McNemar-Bowker W=8.444, P=0.038)。单独分析4级和5级化学物质,三种方法的分级一致率分别为82.5%, 80.0%和87.8%。结论 HepG2细胞中性红摄取实验、MTT实验、总蛋白含量实验均可较好地预测化学物质的急性毒性,特别是对急性毒性较低的(4级和5级)化学物质预测能力较高,是有效的体外快速筛查急性毒性的方法;可为后续的动物实验的起始剂量提供参考,可望用于化学物质急性毒性分级的初步判断。
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  T17.34 BrdU-ELISA检测皮肤过敏方法的建立及其机制

  王智琴;杨微;陈聪;王捷

  2013, 27(S1): 319-319.

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  目的 通过ELISA法、荧光定量PCR法、流式细胞术观察致敏诱导期小鼠血清生化指标、脾脏中致敏基因以及引流淋巴结淋巴细胞中细胞表面分子的变化情况,探讨在致敏诱导期检测致敏性的机制。方法 建立LLNA:BrdU-ELISA方法:根据指导原则,(选择动物类型),选择丁子香酚与α-已基肉桂醛作为阳性致敏物,建立试验方法,并通过致敏性质已知的化学品验证试验证明该方法的稳定性和可重复性。验证试验分别选择2,4-二硝基氯苯、2-巯基苯并噻唑、戊二醛作为致敏阳性物,甘油、氯化钾、乙醇作为致敏阴性物。采用ELISA法检测测试动物血清中组胺、IL-2, IL-4的水平。应用荧光定量PCR方法,检测测试动物脾脏致敏相关基因T-bet, CTLA4和foxp3的差异表达,应用流式细胞术,检测小鼠淋巴细胞悬液中的淋巴细胞亚群以及与致敏相关的细胞表面分子变化情况。结果 成功建立了LLNA:BrdU-ELISA法,该方法重复性良好,可以稳定、快速、敏感的检测化学品致敏性。ELISA法检测小鼠的血液生化指标结果显示,各致敏阳性组小鼠血清中的His和IL-4水平均增加,IL-2无明显变化,其中IL-4水平显著变化。小鼠脾脏中三种致敏相关基因的差异表达研究结果显示,致敏阳性组小鼠脾中T-bet基因表达量升高,其中丁子香酚组、α-己基肉桂醛组、DNCB组的增加量与溶剂对照组相比差异性显著。但其他两种基因的表达量无明显变化。小鼠淋巴结中CD4阳性T细胞数量比例与溶剂对照组相比显著增多。CD28的表达量均增多,其中戊二醛组与2-巯基苯并噻唑组与溶剂对照组相比差异性显著。结论 成功在本实验室建立LLNA:BrdU-ELISA方法,可以选用ELISA试剂盒检测血清中IL-4水平为辅助指标。小鼠脾中T-bet基因表达量升高、小鼠淋巴结淋巴中T细胞数量与CD4阳性T细胞数量比例增多,表明皮肤过敏反应是由T细胞介导的迟发型变态反应。
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  T17.35 斑马鱼快速检测化学品(药物)类过敏反应方法的建立及其应用

  劳乔聪;俞航萍;徐懿乔;夏波;李春启

  2013, 27(S1): 319-320.

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  目的 利用斑马鱼,建立一种体内类过敏快速检测模型,并利用此模型,检测药用辅料Tween-80及其杂质(氯乙醇、乙二醇和双氧水)的致敏性。方法 选择野生型AB品系斑马鱼幼鱼进行实验。优化检测用斑马鱼的发育阶段与数量、检测底物N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)的浓度和阳性对照化合物Compound 48/80的浓度,建立基于微孔板分析的斑马鱼类过敏反应快速检测模型。该模型以肥大细胞脱颗粒后释放的代表性物质类胰蛋白酶的诱导产生水平为检测标准,评价药物是否会诱发类过敏反应。利用此模型,定量分析10个不同批次的Tween-80的致敏性。结果 通过优化建模条件实验,成功建立了斑马鱼类过敏反应快速检测模型,同时用已知的会诱发类过敏反应的化学品验证了该模型检测化学品(药物)是否会诱发类过敏反应的可靠性和特异性。实验数据显示,Tryptase作为肥大细胞脱颗粒后的代表性产物,能够作为评价是否出现肥大细胞脱颗粒现象;而且能够特异性地检测出由类过敏反应诱发的肥大细胞脱颗粒。对10个不同批次的Tween-80的评价结果显示,不同批次Tween-80的致敏性不同,其致敏性呈浓度依赖性,其中3个批次的Tween-80能诱导斑马鱼类过敏反应,有明显的致敏性;其余7个批次的Tween-80不诱导斑马鱼类过敏反应;实验结果与在Beagle犬上进行的实验结果具有很好的一致性。此外,利用该模型,我们还评价了一种中药注射剂及其杂质的致敏性,结果与预期相符。结论 斑马鱼类过敏反应快速检测模型能可靠快速地评价中药注射剂及辅料的致敏性。由于具有快速、高效、可靠、成本低以及能够进行体内定量评价等优势,相信斑马鱼类过敏反应快速检测模型非常有希望成为中药注射剂和药物辅料类过敏反应检测的一种生物学质量控制标准。
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  T17.37 The application of chemical grouping approaches in toxicology——preparing an analogue justification report

  Caroline CURRID

  2013, 27(S1): 320-322.

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  Progress in the use of non-testing methods in chemical risk assessment has accelerated in recent years as global chemical legislations have been updated to highlight the principles of animal welfare and the 3 Rs (Replacement, Reduction, Refinement). Chemical agencies have either adopted specific programmes to facilitate grouping of chemicals (e.g. OECD Existing Chemicals Database, US EPA HPV Challenge Programme) or are in the process of reviewing category or analogue chemical grouping approaches (e.g. European Chemicals Agency (ECHA) EU REACH dossier submissions for 2010 and 2013). It is clear that systematic grouping approaches (e.g. read-across in chemical categories or between chemical analogues) are expected to be applied more regularly in filling data gaps and the submission of a high quality robust read-across report will underpin an alternative non-testing strategy. As there are no specific guidelines available from the CRC-MEP in China for submission of a chemical grouping apprach report, we propose a template based on experience in submitting read-across reports from technical guidance provided from ECHA and the European Chemicals Ecotoxicology and Toxicology Centre (ECETOC). The template will focus on preparing a quantitative read-across report for a chemical analogue for human health endpoints. The report should consist of 4 main sections: (i)Hypothesis for the analogue approach The hypothesis is the most critical part of the justification, as it is the basis for why the read-across may be performed. The hypothesis should explain how the target and source substance(s) have molecular structure similarities as well as describing any other evidence that may support the read-across e.g. similar mode of action, toxicokinetics. All functional groups need to be identified and any possible effects of any disparate groups should be discussed. The hypothesis should also clearly state which endpoint the read-across approach applies to as each endpoint has a specific set of complexities that should be addressed. (ii) Substance identity and similarity of target and source substance(s) The target and source substance(s) should be identified clearly with names, chemical structures and chemical identifier numbers provided. The composition and purity/impurity profiles should be detailed, particularly in cases where either the target and source substance(s) are multi-constituents or UVCBs (unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials), as these substances pose further challenges for read-across based on their complex characteristics. The form or phase of the target and source substance(s) should be clearly stated, as this may affect which hazards the substances may pose. The structural similarities (e.g. functional groups) between the target and source substance(s) should be discussed in detail;if there are any relevant QSAR profilers that may provide an insight into the mechanistic activity of the substances (e.g. DNA or protein binding in the OECD QSAR Toolbox), they can be referred to here as supporting data. It is also beneficial to consider any common breakdown products here though this point can be further elaborated on in the description of the toxicokinetic profiles. (iii) Analogue approach justification The physicochemical and toxicokinetic profiles of the target and source substance(s) can be used to strengthen the read-across hypothesis. If specific toxicokinetic studies are not available, the absorption, distribution, metabolism and excretion may be assessed based on physicochemical properties and toxicity data. Predicted data derived from QSAR profilers may also be acceptable to use as supporting information (e.g. metabolic profilers in the OECD QSAR Toolbox). If reliable toxicokinetic studies are available, they should be submitted as it may provide substantial evidence to justify/support the read-across hypothesis. The endpoint-specific data (e.g. specific study results and dose descriptor) should then be discussed in detail to demonstrate how the results from the source substance(s) suggest a similar systemic and local toxicity profile to the target substance. The effect of structural differences betweenthe target and source substance(s) should also be discussed as they may contribute to a difference in the toxicity profiles.It is also recommended to consider how the uncertainty in the read-across prediction may influence the overall conclusion of the endpoint. A robust consideration of the impact of uncertainty and steps taken to account for it (e.g. use of appropriate assessment factors in DNEL derivation) may be included in a qualitative uncertainty assessment and will strengthen the read-across hypothesis. The current classification and labelling of the target and source substance(s), as well as the results of the PBT assessment should also be included in the justification. Overall, the analogue approach justification will clearly indicate that the hypothesis is supported by data available and that the read-across approach will not lead to an underestimation of the hazards of the target substance. (iv) Data matrix The data matrix should report the available study results for the target and source substance(s). The target and source substance(s) are the columns in the matrix and the endpoints are the rows in the matrix. Each cell in the matrix should contain the study result type e.g. key experimental study result, reliable predicted data (e.g. QSAR), read-across from supporting substance. Typically the data matrix should report the physicochemical, mammalian toxicity, ecotoxicological and environmental fate data. The source of all data listed in the matrix should also be included, with a list of comprehensive references provided. Any issues relating to data ownership/sharing here should also be considered, as the data is supporting the read-across justification and therefore data access must be considered. In conclusion, we believe the template described is a useful starting point to generate a robust hypothesis-driven comprehensive report that may be used to fill data gaps using a chemical grouping analogue method.
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  T17.38 Comparisons of prevalence of sensitive skin in populations from United States and China

  Xuejun J YIN;CHEN Wei;CHEN Jie;Josh A. LAUDRILLE;Alphonsus H. DANG;JIANG Yi-hong;Cristi GOMEZ

  2013, 27(S1): 322-323.

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  OBJECTIVE This study evaluates prevalence and characteristics of sensitive skin in the United States and China, compares data collected from the two countries and two methods, and examine possible factors that may be associated with sensitive skin. METHODS A self-assessed questionnaire was answered by each of 1626 women and 165 men from the United States and 649 women and 143 men from China, randomly selected, who were over the age of 18 years old and lived in Greater Dallas area, TX, USA and Shanghai, China, respectively. The US subjects consisted of 22.5% African Americans, 7.1% Asians, 57.3% Caucasians, 10.9% Hispanic, and 2.1% "Others" which was defined by unknown or unreported ethnicity. The survey required subjects to identify whether or not they perceived their skin to be sensitive. Then a diagnostic test was performed on all selected subjects with 10% aqueous lactic acid at two test facilities (Richardson, TX and Shanghai, China). Positive results of the test are an indication for clinically-diagnosed sensitive skin. RESULTS Twenty nine percent of the US subjects including 29% of women and 25% of men described themselves as having sensitive skin. Asians had the highest incidence of self-perceived sensitive skin (48%), followed by African Americans (30%, P<0.01), Caucasians (28%, P<0.01), "Others" (26%, P<0.01), and Hispanic (20%, P<0.01). The 30 s and 40 s age groups reported slightly heightened incidences of sensitive skin compared to other age clusters (30%-31% vs. 24%-28%). Subjects with light and dark skin reported a similar incidence of sensitive skin (35% and 36%) and both were significantly higher than that for medium skin tone subjects (P<0.01). Incidence of self-perceived sensitive was reported the highest in dry skin subjects (53%) and lowest in normal skin subjects (23%). Results of the lactic acid test indicated that 57% of the US subjects had clinically diagnosed sensitive skin. Prevalence of sensitive skin in women was slightly but significantly higher than that in men (57% vs. 55%, P<0.01). Asians and Caucasians had the same and highest (63%) prevalence of sensitive skin, followed by "Others"(52%), African Americans (47%), and Hispanic (47%). Light skin subjects showed the highest prevalence of sensitive skin (64%) and dark skin subjects had the lowest (52%) (P<0.01). Medium skin tone subjects showed a medium prevalence of sensitive skin in between, which was significantly lower than that of light skin subjects (64% vs. 55%, P<0.01). Differences among age and skin type groups were slight and insignificant. In the 792 Chinese subjects tested, 62% (488) were clinically diagnosed with sensitive skin. Women had a higher prevalence of sensitive skin than men (63% vs. 57%, P<0.05). Compared to the US subjects, either Chinese women or Chinese subjects in total showed significantly higher prevalence of sensitive skin than their US counterparts (63% vs. 57%, 63% vs. 57%, P<0.05). When compared to Asian or Caucasian group of the US subjects, the Chinese subjects showed a very similar prevalence of sensitive skin (62% vs. 63%, P>0.05). The 30s and 40s age groups showed the highest prevalence of sensitive skin (68%, 70%), which were significantly higher than either younger (less than 30) or older groups (50-59 years, 60 or greater, P<0.05). Comparisons between data collected from the two diagnostic methods showed that 68% of the US subjects with self-perceived sensitive skin were clinically diagnosed to have sensitive skin, while 30% of them failed clinical diagnosis. The results also showed 42% of self-perceived non-sensitive skin subjects were clinically certified, though 53% of them were clinically diagnosed to have sensitive skin. Overall, 20% of the US subjects were both self- and clinically-diagnosed to have sensitive skin, accounting for 34% of the subjects who were diagnosed clinically alone. CONCLUSION This study, based on two samples of different populations and two different diagnostic methods, reveals a high prevalence of sensitive skin in the US and China. Ethnicity, sex, skin tone and skin type, and age may be factors associated with sensitive skin. Although self-perceived sensitive skin subjects were more likely to be diagnosed clinically than self-perceived non-sensitive skin subjects, the two diagnostic methods did not correlate well. Therefore, it is recommended to test a product designed for sensitive skin consumers utilizing panelists who are both self- and clinically-diagnosed as having sensitive skin.
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  T17.39 Application of the KeratinoSens assay to prediction of dermal sensitization hazard for botanical cosmetic ingredients

  David GAN;Kimberly NORMAN;Nicole BARNES;Hans A. RAABE;Cristi GOMEZ;Xuejun J. YIN;John HARBELL

  2013, 27(S1): 323-323.

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  OBJECTIVE The goal of the study was to determine the potential for the KeratinoSens assay to identify electrophile allergens within a botanical extract matrix. METHODS In the KeratinoSens assay, the induction of a luciferase gene under the control of the antioxidant response element (ARE) derived from the human gene AKR1C2 gene is quantified. In parallel, cytotoxicity is assessed by both Neutral Red Uptake (NRU) and MTT assays. Test samples included gluteraldehyde (GA), dimethyl maleate (DM) and cinnamic aldehyde (CA) spiked into four different botanical extracts (including different excipient solvent systems). Test concentrations ranged up to 1 g·L^-1 (of complete extract) and a test concentration was considered positive if the relative viability was ≥70% and the fold induction of luciferase was 1.5x relative to the solvent controls. Activity was measured relative to the EC1.5 of the neat sensitizer as a function of sensitizer concentration and extract composition. Three independent trials were performed on each test material. RESULTS No appreciable cytotoxicity was observed with any of the samples. Sensitizers spiked at 1% to 2% were sufficient to induce a positive up regulation of the ARE below the maximum test material concentration of up to 1 g·L^-1. These responses occurred at cell survivals well in excess of 70%. The botanical matrix impacted recovery for both gluteraldehyde and dimethyl maleate sensitizers. The recovery of the GA spike required at least a -3 fold increase in concentration relative to the chemical alone and botanical extract #3 reduced the activity below detection. The DM and CA showed activity at about the same effective concentrations as the neat chemical although the DM showed reduced activity in botanical extract #3 as well. CONCLUSION These data suggest that the KeratinoSens assay has the potential to identify electrophile allergens within a botanical extract matrix.
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  T18.2 hsa-miR-21-3p通过抑制TRAF4影响食管癌细胞的增殖和凋亡

  石亚娟;刘辉;刘冉

  2013, 27(S1): 334-335.

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  目的 探讨hsa-miR-21-3p对食管癌鳞状细胞生物学功能的影响及其在食管癌发生发展中的潜在作用。方法 应用寡核苷酸hsa-miR-21-3p拟似物(miR-21-3p mimics)和阴性对照转染食管癌鳞状细胞Eca9706细胞后,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染后细胞株中hsa-miR-21的表达水平,并利用流式细胞术和EdU 增殖实验分别观察hsa-miR-21过表达对Eca9706细胞株的凋亡和增殖能力的影响。利用表达谱芯片技术,分析在食管癌Eca9706 细胞中hsa-miR-21直接及间接调控的基因差异表达谱。通过GO功能聚类分析和通路富集分析对hsa-miR-21过表达引起的差异表达基因在食管癌细胞中发挥的生物学功能进行初步研究,同时结合miRNA 靶基因预测数据库(miRanda和miRWalk)寻找hsa-miR-21可能作用的靶基因。通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹杂交技术和双荧光素酶报告基因进一步验证hsa-miR-21的靶基因。结果 hsa-miR-21mimics转染组细胞中hsa-miR-21表达水平升高是对照组的213.45 倍,转染48h 后hsa-miR-21mimics组细胞增殖率是对照组的2.10 倍(P<0.05),同时细胞凋亡率显著下调,仅为对照组的84%(P<0.05),表明miR-21-3p过表达能够促进Eca9706 细胞的增殖同时抑制其凋亡。芯片结果显示,hsa-miR-21可直接或间接上调(2倍及2倍以上)mRNA 基因118 个,下调(2倍及2倍以下)mRNA基因63 个,生物信息学分析表明部分基因参与了Notch, MAPK和Wnt等信号通路,通过调控氧化还原酶、水解酶、连接酶的活性以及DNA的代谢和结合过程,从而影响肿瘤细胞的生长、凋亡以及生物学行为。通过芯片数据的分析并结合靶基因预测软件预测hsa-miR-21的候选靶基因TRAF4,qRT-PCR结果显示,TRAF4在hsa-miR-21过表达的细胞中的表达水平是对照组的19.2%(P<0.05),同时Western blot 结果也显示其蛋白表达量在hsa-miR-21过表达的细胞中较对照组降低了48%(P<0.05),表明TRAF4 在hsa-miR-21过表达细胞中的mRNA 和蛋白水平均被抑制。双荧光素酶报告基因系统分析结果显示,TRAF4 3'UTR/hsa-miR-21较对照组的hRluc/hLuc比值(海肾荧光素酶活性/萤火虫荧光素酶活性)降低了35.71%(P<0.05),证实hsa-miR-21对TRAF4 的调控作用是通过3'UTR区的特异性结合实现的。结论 hsa-miR-21通过抑制TRAF4 的转录后过程,促进食管癌细胞的增殖,抑制其凋亡能力,表明其在肿瘤的发生发展过程发挥着癌基因样的作用,提示hsa-miR-21有可能成为食管癌早期诊断的标志物和分子治疗的新靶标。
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  T15.7 基于系统毒理学的离子辐射的剂量反应关系

  赵郁超

  2013, 27(S1): 287-287.

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  目的 研究离子辐射剂量反应关系的种种可能性。方法 本研究利用系统毒理学的方法,建立细胞周期停滞模型,并与干扰模型与两步的癌症克隆增长模型相连接,模拟出了J型剂量反应曲线存在的可能性。具体方法是首先将模型模块化,分为系统模块、干扰模块以及病理模块。系统模块描述了细胞周期关卡控制传导途径。干扰模块描述了离子辐射引起的细胞周期关卡停滞。病理模块利用了两步的癌症克隆增长模型。各模块的数学模拟方式是利用系统动力学的方法,将传导途径中的各分子浓度变化建立微分方程组,并利用细胞周期是细胞分裂率的倒数而将系统模块/干扰模块与病理模块相连接,模拟出由不同剂量的离子辐射引起的癌症变异率。模型中的各参数依照已有的数学模型来定义,并用敏感性分析验证了模型参数的选取对于模拟结果影响不大。结果 此方法模拟出了直线型以及J型剂量反应关系的存在。结论J型剂量反应关系存在的内在原因是由离子辐射引起的细胞周期关卡停滞时间随着离子辐射剂量的增加而趋于饱和。
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  T19.11 关注毒理学阈值在风险评估中的应用

  朱婷婷;Susan P. FELTER;Heike SCHEFFLER;Michael LAUFERSWEILER

  2013, 27(S1): 347-348.

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  风险识别是风险定量评估的一个关键步骤,评估者经常要面对的问题是在产品中的低含量成分没有或者缺乏足够的毒理学数据,难以完成全面的评估。在缺乏特别化学数据的情况下,关注毒理学阈值(TTC)提供了一种保守的估计方法,使慢性长期暴露量低于极低风险可能性。TTC概念是通过概率的方法,对某化学物建立人体暴露水平低于对人体健康无明显风险可能性的一种准则。TTC依赖于多种化学类别物质的现有数据,从而预测毒性不明物质的潜在毒性。并根据化学结构特点决定潜在毒性,对不同毒理关注类型的化学物进行分组。多层TTC方法有6个层次,覆盖4个数量级。低层的潜在致癌性来自超过700种化学物的致癌数据分析。高层的非致癌性来自超过600种化学物的分析以及根据化学结构的决策树分组。作为一种务实的风险评估手段,TTC的使用已经被相当多地区的法规监管机构确立和接纳,例如间接食品添加剂、调味化学品以及药品中的基因毒性杂质。TTC使用的主要优势已经被欧洲非食品安全委员会(包括消费品安全科学委员会)接受,并于2012年被欧洲食品安全局最后确认。TTC的概念从食品安全延伸到化妆品和个人消费品领域,得到了积极的评价。科学委员会认为,对于极低暴露的化学品的系统毒性,一般来说,TTC方法在人类健康风险评估中被认为科学。本文概述了TTC方法用来评估和证实低水平暴露对于人体的安全性,可以适当地集中社会资源以避免不必要的动物实验。这其中既包括了TTC的科学背景以及分层TTC框架介绍。同时,一案例研究会阐明TTC如何用来评估化妆品中的某低水平污染物和未来TTC的拓展方向。
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  T16.7 毒代动力学评估体外替代方法的研究现状及进展

  谢贻珽

  2013, 27(S1): 291-292.

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  毒代动力学评估常作为化学品法规注册的标准数据要求。作为一个特殊的毒理节点,毒代动力学评估对其他毒理试验的开展、解读和外推具有重要意义,可用于各种类型化学物质对人类健康的风险评估。但由于毒代动力学动物试验周期长,费用昂贵,近年来采用非动物试验方法获取毒代动力学数据引起了越来越多的关注。PBTK模型是最常用的毒代动力学体外评估模型,同时数据质量可靠的体外动力学数据也是PBTK预测的关键因素。现已开发多种体外转运和代谢模型,这些体外模型的有效性也在应用中得到不断评价和验证。体外转运模型根据给药途径,可分为经口吸收、经皮吸收和吸入吸收模型。其中,Caco-2细胞模型是用于评价物质肠道吸收最常用的体外模型,但随着广泛应用,该模型的缺陷也逐渐暴露,如不适用于高亲脂性和低吸收率的物质,以及转运体介导转运或有首过效应的物质。因此,各种改进后的Caco-2模型也应运而生。OECD Test Guideline 428是唯一一个被ECVAM认证的用于评估经皮吸收的体外屏障模型。肺部吸收需要考虑两个因素,即物质的沉积部位以及在上皮层支气管和肺泡的吸收。现已有一系列的计算机模拟系统可预测物质在呼吸道的沉积部位。各种用于评价物质体外肺部吸收的细胞模型(如原代肺上皮细胞,Calu-3细胞,16HBE14o细胞)已建立,一些新型的体外模型也在被不断开发。目前,还没有统一的标准化体外模型用于评价物质吸入吸收。 一直以来,如何获得可靠的代谢数据是建立体外模型的难点,也是限制非动物动力学和药效学试验的瓶颈。常用的体外代谢系统包括c-DNA表达酶,微粒体,肝组织匀浆液和肝细胞。但不同代谢系统间的代谢功能差异也成为了体外测试的主要限制因素之一。HepaRG®模型是基于生物反应器由HepaRG®细胞组成的三维系统,可作为体外的"肝脏",用于检测物质的体外代谢。生物蓄积性是风险评估中另一个重要考虑因素。研究表明,生物蓄积性可通过测定物质体外的血浆蛋白结合率和体外肝代谢清除率进行预测。目前,还没有成熟的模拟体外排泄的有效模型。一些体外模型已日趋成熟并在各个领域广泛应用,但仍存在一些问题需要克服,如不同试验间的差异性,体外-体内的相关性,载体系统与体内的一致性,代谢酶功能表达不足等。与此同时,随着体外模型系统的不断改进和各种新型模型的产生,若能充分地利用这些体外模型,在节约时间和成本的同时获取可靠的毒代动力学数据是可能的。
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  T16.9 miR-23b在2,2’,4,4’-四溴联苯醚调控CYP3A表达中的作用

  孙真真;张展;王稀琛;王守林

  2013, 27(S1): 292-293.

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  目的 本研究旨从细胞水平上确定2,2',4,4'-四溴联苯醚(BDE47)的毒性作用及对CYP3A和miR-23b的影响,为阐明miR-23b在BDE47调控CYP3A酶表达中的作用及分子机制及BDE47的毒效应及环境风险评估提供依据。方法 首先利用表达CYP3A1酶的大鼠H4IIE细胞株,通过CCK-8、Western blot、siRNA干扰、地塞米松(DEX)处理和免疫荧光等试验确定BDE47的毒性剂量及BDE47对CYP3A1的诱导作用。然后通过生物信息学预测和real-time PCR验证,进一步确认目标microRNA (miR-23b),在此基础上,运用双荧光素酶报告基因实验明确miR-23b和CYP3A1(大鼠)/CYP3A4(人)的靶向关系。然后利用microRNA的功能实验(miR-23b过表达和抑制试验)验证miR-23b和CYP3A1/CYP3A4的调控作用。最后在人群样本上,通过免疫组化和miR-23b的原位杂交进一步确认miR-23b和CYP3A4表达的关系。结果 ① 不同浓度的BDE47处理H4IIE细胞,可引起细胞活力呈剂量依赖性下降,DEX预处理可明显增强BDE47所致的细胞毒性;CYP3A1-siRNA转染H4IIE细胞后,BDE47 20 μmol·L^-1的细胞毒性有所下降。免疫荧光及Western Blot实验显示,BDE47可以显著诱导CYP3A1的表达。② 利用生物信息学软件(miRanda-mirSVR, miRBase 19, RNAhybrid, miRecords和PITA)初步确认了miR-23b可能与CYP3A的调控表达有关,研究显示,BDE47处理的细胞及BDE47染毒的大鼠肝组织中,miR-23b都显著下降。③ miR-23b mimic转染H4IIE细胞24 h后,CYP3A1的表达下降,细胞毒性降低;而miR-23b抑制剂处理,则CYP3A1表达升高,细胞毒性增强。④ CYP3A1 3'UTR/CDS和CYP3A4 3'UTR/CDS的报告基因实验结果显示,miR-23b可以分别和CYP3A1 3'UTR和CYP3A4 CDS结合发挥调控作用,进一步通过报告基因实验确定了miR-23b在CYP3A4 CDS区的具体作用位点。⑤ 利用芯片技术对50例肝癌、癌旁和正常肝组织样本分别进行免疫组化和原位杂交,结果显示,CYP3A4在三者中表达量关系为正常肝组织>癌旁组织>肝癌组织,而miR-23b的表达量则为肝癌组织>癌旁组织>正常肝组织,进一步验证了CYP3A4和miR-23b之间的调控关系。结论 BDE47可以诱导CYP3A的表达,而miR-23b可通过分别作用于CYP3A1 3'UTR(大鼠)和CYP3A4 CDS区(人)参与了BDE47对CYP3A的调控,进而影响了BDE47所致的毒效应。
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  T20.15 二氧化硫毒理学和生理学研究进展

  孟紫强;张全喜;李君灵;杨振华

  2013, 27(S1): 365-365.

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  当1985年我们开始进行二氧化硫(SO₂)毒理学研究时,文献调研发现,虽然SO₂是常见且严重的大气环境污染物,但是对它的毒理学研究大都停留在流行病学调查和动物急性毒性试验方面,科学研究的主要关注点聚焦在SO₂对呼吸系统的刺激作用及其与肺癌的关系。当时有关SO₂在细胞和生化毒理学方面的文献寥寥无几,只有3篇论文涉及职业暴露者外周血淋巴细胞染色体畸变方面的研究,且其中有的是阳性结果,而有的是阴性结果。为了确定SO₂究竟是否可以引起细胞遗传毒理学改变,我们从1986年开始对接触SO₂污染工人外周血淋巴细胞遗传毒理学进行研究,随后在近30年的时间里,我们对SO₂细胞毒理学、生化与分子毒理学、信号转导生理学等方面进行系列研究。之后,又对SO₂在血管组织内源性合成部位和调节、转化和失活、信号分子功能等生理学作用进行系列研究。主要发现: 1 采用生化方法和电子显微镜技术研究发现,SO₂及其衍生物可引起多种器官氧化损伤、蛋白质-核酸交联、细胞超微结构改变;2 采用基因组芯片技术研究发现,SO₂短期和长期动态吸入染毒可引起大鼠肺基因组表达谱改变,涉及多种基因表达的上调或下调;3 采用实时定量RT-PCR技术、Western blot方法等现代分子生物学技术研究发现,SO₂及其衍生物可引起体外培养的人支气管上皮细胞和大鼠肝、肺组织凋亡相关基因、细胞色素P450家族基因、原癌基因、肿瘤抑制基因、哮喘相关基因等mRNA、蛋白质表达水平的改变;4 采用细胞遗传学技术研究发现,SO₂及其衍生物可引起多种类型细胞发生染色体畸变、姐妹染色单体互换、微核等频率升高,表明其是基因毒性因子;5 采用细胞分子生物学方法研究发现,SO₂可引起血管舒张,且其机理与血管内皮、钙离子通道、钾离子通道及NO/cGMP信号途径有关,发现NaHSO3酸性溶液是一种SO₂供体。SO₂及其衍生物具有多种毒性作用的全身性毒物,SO₂是一种新型生物气体信号分子,具有多种生理学作用。
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  T16.11 Beagle犬静脉滴注B-01重复给药4周毒性试验的伴随毒代动力学

  孔琦;关勇彪;吴春燕;赵克永;施畅;欧阳兆和;郭巧珍;马华智;丁日高

  2013, 27(S1): 294-294.

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  目的 本试验通过Beagle犬静脉重复4周注射一类新药B-01,评价毒理研究试验方案合理性,阐明其全身暴露量与毒性剂量及毒性反应关系。 方法 Beagle犬,剂量100, 300和900 mg·kg^-1,给药途径为静脉滴注,给药速度为0.33 ml·kg^-1·min^-1,60 min输完,给药频率1 次/天,连续4周。在首次和末次给药的药前和输注结束后0 min,30 min,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h和 24 h采集约0.5 ml全血肝素抗凝、分离血浆(4℃,4 h内)后于-20℃保存待测。测定首次和末次给药后动物血浆中的药物浓度,分析并对比各剂量组之间B-01全身暴露量(C_max和AUC)、二相消除半衰期(t_1/2β)和体内平均驻留时间(MRT)等毒代动力学参数。 结果 LC-MS/MS检测方法特异性良好,线性范围5~2500 ng·ml^-1,日内和日间精密度<8%,回收率高于75%,基质效应小于10%,血浆样品在-20℃放置3 d和4℃放置4 h条件下稳定性良好。首次静脉滴注B-01三个剂量C_max比值为1:2.43:11.47(低:中:高),AUC比值为1:3.13:12.13(低:中:高);末次静脉滴注三个剂量后,C_max比值为1:1.53:4.37(低:中:高),AUC比值为1:1.52:4.27(低:中:高);比格犬连续4周静脉滴注末次给药与首次给药相比,各剂量组MRT和t_1/2β均无显著的变化,暴露量变化如下:低剂量有增加的趋势,中剂量未有变化,高剂量减少的趋势,结合动物个体值差异分析,暴露量改变无统计学差别和生物学意义,药物在动物体内动力学行为在首次和末次给药之间无明显的改变。结论 首次建立了以甲醇沉淀蛋白应用LC-MS/MS测定比格犬血浆中B-01的可靠生物样品分析方法。首次给药,B-01在犬中血浆暴露量随剂量升高存在饱和趋势,表明给药剂量设置合理,连续静脉滴注4周后各剂量B-01在犬体内无蓄积。
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  T16.12 SD大鼠单次灌胃给予邻苯二甲酸二丁酯的毒代动力学

  宋乃宁;李蕾;李海山;艾文超;谢文平;程桂林;陈会明

  2013, 27(S1): 294-295.

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  目的 探讨雄性大鼠口服不同剂量邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的毒代动力学规律。方法 雄性SD大鼠单次灌胃给予DBP玉米油溶液(250和1000 mg·kg^-1),灌胃后按规定时间采集大鼠血浆(0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12及24 h)。DBF口服后在体内迅速被代谢成活性代谢产物邻苯二甲酸单丁酯(MBP),本研究中选择MBP作为检测对象,采用高效液相色谱(HPLC)法测定血浆样品中MBP的浓度。使用Phoenix WinNonlin 6.3软件进行血药浓度-时间数据的分析与毒代参数的计算。结果 雄性SD大鼠单次灌胃DBF 250和1000 mg·kg^-1后,药时曲线下面积AUC_(0-24)分别为358.49±55.01与(3386.99±564.34)μg·h^-1·L^-1,AUC_(0→∞)分别为373.43±49.75与(3658.40±909.08)μg·h^-1·L^-1,达峰浓度C_max分别为51.31±5.90与(378.88±78.50)μg·ml^-1,达峰时间T_max分别为2.33±0.82与6 (h),半衰期T_1/2分别为3.44±0.72与(6.00±0.55)h,清除率Cl分别为3.31±0.38与(2.43±0.39)L·h^-1·kg^-1。结论 DBP半衰期随着灌胃剂量增加延长,AUC与剂量不成比列,呈现出非线性代谢动力学特征。
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  T13.45 SD大鼠灌胃XS生育力与早期胚胎发育毒性试验

  叶向锋;王灵芝;王爱平;魏金锋

  2013, 27(S1): 266-267.

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  目的 评价XS的安全性提供依据。方法 SD大鼠给药组剂量分别为100, 300和1000 mg·kg^-1。灌胃给药,给药体积为1 ml·100 g^-1。交配前雄鼠连续给药28 d,雌鼠连续给药14 d,雌雄按1:1同笼交配,交配期继续给药至交配成功,雌鼠交配成功后仍继续给药至受孕第6天。观察指标包括大鼠一般状况、体重变化、进食量、交配率、受孕率、活胎率、精子计数及活动度、雄鼠生殖系统检查等。结果 给药期间,各组动物行为活动正常,一般状况良好。从给药第8天起各给药组大鼠的体重增长明显减慢,进食量减少。在3个发情周期内除低剂量组的交配率为95.8%外,其余各组的交配率均为100%,各组的受孕率分别为:对照组95.8%、低剂量组73.9%、中剂量组95.8%、高剂量组70.8%。各组发现阴栓的平均天数分别为:溶剂对照组4.5±4.1、低剂量组2.0±0.9、中剂量组2.1±1.7、高剂量组3.8±3.6。交配结束后,每组取10只雄鼠剖检,并称量睾丸、附睾、前列腺及脑的重量,检测精子数量及活动度,结果发现,XS对雄鼠的精子功能没有影响,高剂量组前列腺重量、前列腺/脑低于溶剂对照组(P<0.05),睾丸脏器系数及附睾脏器系数高于溶剂对照组(P<0.05),出现上述差异与药物引起的动物体重下降有关。雌鼠孕期未见与给药相关的毒性反应,未见早产、流产等异常现象。XS各剂量组孕鼠的体重明显低于同期溶剂对照组(P<0.01)。于妊娠第15天解剖孕鼠,计数黄体数、着床数、活胎、死胎和吸收胎数。各给药组的着床率、吸收胎率及活胎率与溶剂对照组相比无显著性差异;各剂量组的窝平均黄体数分别为:溶剂对照组17.5±3.0,低剂量组14.7±3.0,中剂量组13.7±2.5,高剂量组13.5±1.9,与历史背景数据相比,XS中、高剂量组孕鼠的窝平均黄体数及中剂量组孕鼠的窝平均着床数及窝平均活胎数偏低,认为XS在300和1000 mg·kg^-1时(此剂量分别相当于临床用量的188倍和625倍)可能对雌鼠的生殖功能可能会有影响。结论 对于生殖功能的影响,雄鼠的NOAEL为1000 mg·kg^-1,雌鼠的NOAEL为100 mg·kg^-1。
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  T16.14 以大鼠为受试生物的体内代谢实验技术方法体系的构建

  肖经纬;孟会林;李忠生;于常艳;张志荣;李斌

  2013, 27(S1): 295-296.

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  目的 建立具有较强实用性的以大鼠为受试生物的外源化学物质体内代谢动力学非同位素标记检测法。方法 ① 受试物染毒技术:灌胃、吸入、静脉注射等方法对代谢实验的针对性改良;② 体内吸收分布代谢排泄追踪技术:血液、胆汁、尿液、粪便、组织样本收集技术方法的建立、适用性验证及方法学比较研究;③ 样本检测技术:GC-MS,LC-MS等方法在典型受试物检测中的方法校正和条件标化。结果 ① 注射器法与注射器联合静脉输液针法静脉染毒效果的比对研究提示:注射器联合静脉输液针法的准确度更优,可作为静脉染毒的主要方式,注射器法则可应用于代谢实验手术的过程中补液;② 绳索固定法和非绳索固定法两种颈静脉穿刺取血方式可联合应用于受试物染毒后定时连续取血,非绳索固定法适用于密集采血点(1, 2, 3 min),绳索固定法适用于分散采血点(1, 2, 4, 6和8 h);以眼眶后静脉丛法为补充,颈静脉插管法为技术储备,不断完善代谢动力学血液收集体系的构建;③ 以流水化作业为先导,强化关键技术,做好术后护理,提高胆道插管术后动物的存活率,保证代谢实验胆汁样本收集的完整性;④ 以潜在的毒作用靶器官为基础,明确受试物体内分布、代谢、排泄脏器组织的采集范围;⑤ 代谢笼法实现尿液粪便的有效分离和提取;⑥ GC-MS,LC-MS的适用性初筛和验证,不断完善代谢实验检测方法体系的构建。结论 以受试物染毒技术、吸收分布代谢排泄追踪技术、样本检测技术为依托,通过方法比较和验证初步构建具有较强实用性和可操作性的以大鼠为受试生物的外源化学物质体内代谢动力学非同位素标记检测法。
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  T19.13 靶器官系统性毒性(反复接触)测试结果分类中的问题和建议

  朱斌;张霞;曾娟

  2013, 27(S1): 348-348.

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  全球化学品统一分类和标签制度(GHS)的实施旨在减少不同国家地区之间对化学品分类和标签的差异,在国际范围内统一对化学品危害特征的认识,从而提高化学品防护,降低国际贸易成本。化学品测试方法是实施GHS制度过程中重要的技术支撑。GHS本身并未提出化学品的试验要求甚至不鼓励进行不必要的动物实验,而是通过证据权重,分析来自人类和动物的数据,并结合专家判断对化学品进行分类和标签。化学品测试方法作为GHS分类证据权重的重要信息源,测试剂量设置和GHS分类标准的协调性成为影响分类的重要因素。例如靶器官系统性毒性(反复接触)的分类中,对于动物试验GHS建议的分类指标为明显有害剂量, 即最低可见有害作用水平(LOAEL)。然而,化学品测试方法却未对LOAEL作出明确要求,仅仅是在剂量设置部分提出高剂量组应能产生明显毒性效应。这就导致LOAEL的推导需要很大程度的专家判断,因为简单地把试验中的高剂量组认为是LOAEL是不恰当的。如果剂量间距设置过大,将高剂量和LOAEL等同就会使其真实值被夸大,从而化学物质的危害会被低估,最终成为化学物质风险管理的隐患。另一方面,对于剂量-效应曲线较为平缓的试验结果,虽然其NOAEL值落在相应的分类区间,但真正产生毒性效应时的剂量大大超过该类别的指导剂量,此时按NOAEL值对其分类则化学物质的危害将被高估,势必造成管理资源的浪费。这也是导致相同化学物质分类由于数据的试验设计差异,得到不同的分类和标签。针对上述靶器官系统性毒性(反复接触)分类中存在的问题,如果试验设计能与GHS分类的标准相对应,在试验结果中对LOAEL的建立提出要求,会对统一分类起到关键性作用。究其根本,要求在试验结果提出NOAEL和LOAEL,事实上是对试验的质量提出了更高的要求,试验设计者需要更加谨慎地安排适合受试物毒理学特征的给药剂量,才能得出可信度高的NOAEL和LOAEL值,从而将避免通过试验数据进行专家判断产生的分歧。总之,GHS是世界化学品管理的大势所趋,但其局限性在于它概括了化学品的分类原则,却未对分类依据作细化的要求,因此一套兼容GHS分类标准的分类依据是必不可少的。与其在低可信度的数据中采取过严或过松的分类结果,提高测试质量才是做到准确分类,实现GHS制度初衷的根本途径。只有这样,才能作出对化学品严格又不失准确的分类和管理措施。
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  T19.14 乙醇对人体危害的风险评估研究进展

  王民生;常元勋

  2013, 27(S1): 349-349.

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  大量饮酒可增加肝病、口咽癌、食管癌和胰腺炎等消化系统疾病的风险,但是适度饮酒可能对胃炎和胆石症有益。慢性酒精中毒系长期饮酒所造成。临床调查显示,肝病患者中49%有酒成瘾史。流行病学调查发现,居住在城市里50岁以上的男性每天饮酒超过80 g酒精,发生肝癌的危险性增加。在对美国、法国等25个国家的调查显示,酒精消耗量与肝癌死亡率呈正相关。唐艳等将酒精消耗量进行定量分析后发现,饮混合酒或烈性酒者患肝癌的危险度分别是不饮酒者的7.41和6.5倍。Chen在中国台湾地区的研究表明,习惯性饮酒者较非习惯性饮酒者发生肝癌的危险性增加3.1倍(OR值为4.1,95%CI:2.1~8.4)。范宗华等进行的队列研究发现,不同消化道肿瘤的年龄别死亡率随饮酒等级的增加而增加;饮酒组与不饮酒组相比,死亡高峰提前。2011年《美国医学会杂志》(JAMA)发表的一项研究显示,即使每周只饮3~6杯红酒,罹患乳腺癌的风险也会增加。美国哈佛医学院的Chen博士等人分析了1980-2008年期间美国护士健康研究(NHS)的数据发现,饮酒者,其乳腺癌相对危险度(RR)为1.15。但是适量饮酒有益健康。国外对38 077名男性医务工作者为期12年的研究发现,男子每周饮酒3次者与饮酒次数较少者比较,可降低心肌梗死的危险性。日饮量<1杯(约20毫升)者,其危险性的降低与饮酒3杯者相近似。在随访期间,中度饮酒量可减少心肌梗死的危险性。无论从健康还是社会管理的角度,都应该控制饮酒。
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  T14.3 microRNA-27a基因遗传变异与环境暴露因素联合作用对胃癌发生的影响

  杨巧媛;揭志刚;叶升;李正荣;韩志远;吴建军;杨成峰;蒋义国

  2013, 27(S1): 269-270.

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  目的 探讨miR-27a基因遗传变异对N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导的胃癌变过程的影响及其机制。方法 收集胃癌病例892例和正常对照个体978例,利用病例-对照研究思路,采用Taqman探针qRT-PCR法基因分型技术,比较miR-27a基因多态位点rs11671784不同基因型分布频率的差异,确定rs11671784与胃癌发病危险度的关联;采用体外基因重组技术,构建野生型和突变型miR-27a基因质粒载体,转染至正常胃上皮细胞GES-1中,建立野生型和突变型miR-27a基因稳定表达细胞株,同时采用MNNG染毒致其发生恶性转化,采用软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验分析比较miR-27a基因野生型和突变型细胞在恶性转化过程中的差异,从人群和细胞两个层面分析miR-27a基因遗传变异与环境暴露因素对胃癌变的影响。结果 胃癌病例组中miR-27a基因GG, GA和AA基因型分布频率分别为44.62%, 46.41%和8.97%,对照组中不同基因型分布频率为37.93%(GG), 49.80%(GA)和12.27%(AA);与携带GG纯合子基因型个体比较,携带变异碱基的个体(GA/AA)胃癌发病危险度降低,差异均有统计学意义,相对于GG型个体,GA基因型个体胃癌发病危险度为0.65(95%CI,0.52~0.91; P=0.009),AA基因型个体胃癌发病危险度为0.55 (95%CI,0.33~0.84; P=0.012)。细胞水平体外试验结果表明,在MNNG染毒致恶性转化过程中,相对于野生型miR-27a基因稳定表达GES-1细胞,突变型GES-1细胞恶性转化过程受到影响;野生型和突变型细胞、不同基因型胃癌个体miR-27a成熟体、前体(pre-miR-27a)和转录体(pri-miR-27a)表达分析表明,miR-27a基因遗传变异导致miR-27a成熟体表达水平的降低,对pri-miR-27a和pre-miR-27a的表达无影响,提示该变异主要通过影响miR-27a成熟加工过程下调miR-27a的表达,从而导致胃癌发病危险度和恶性转化过程受到影响,进一步证实miR-27a基因遗传变异与胃癌变的相关性。结论 miR-27a基因遗传变异可导致miR-27a的表达水平下降,在胃癌发生和胃癌细胞恶性转化过程中起保护作用。
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  T19.16 粒径测定方法概要——关于《新化学物质申报登记指南》中可吸入部分<1%的解读

  李晶;张霞;曾娟;朱斌

  2013, 27(S1): 350-350.

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  《新化学物质申报登记指南》中,对固体物质急性吸入毒性豁免的要求为:物质的粒径分布中,可吸入部分<1%(重量百分比),且使用时产生的浮质、微粒或者液滴MMAD(质量Mass median aerodynamic diameter)>100 μm。本文总结了粒径测试的相关方法,并给出了不同种类的固体物质进行粒径测定的建议。满足《新化学物质申报登记指南》中,对固体物质急性吸入毒性豁免的要求为:物质的粒径分布中,可吸入部分<1%(重量百分比),且使用时产生的浮质、微粒或者液滴MMAD>100 μm。因此可以此豁免急性吸入毒性数据。目前指南中对可吸入部分的概念并无明确定义,建议可以参照上文中定义:可吸入部分指空气动力学直径(AD)<100 μm的颗粒。
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  T19.17 试论经济学研究对毒物管理与立法的影响

  史志诚

  2013, 27(S1): 350-350.

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  为研究经济学研究对毒物管理与立法的影响,本文回顾了20世纪90年代以来,一些涉及毒物和毒性事件有关的经济学研究对毒物管理与立法产生的积极影响。并就简述了环境污染对经济供需关系的影响、切尔诺贝利核事故带来的经济学影响、烟草经济学研究为控烟决策提供依据。以英国伦敦烟雾事件、"反应停"灾难、日本水俣汞污染事件、中国西部毒草灾害、"瘦肉精"中毒事件、毒奶粉事件等重大毒性事件的经济学研究为例,分述了这些毒性事件对毒物管理与立法的推动作用。作者指出,目前,我国毒物管理与立法工作仍然处于初创阶段,今后进一步制订和完善毒物管理的法律法规,一方面有赖于毒理学的研究成果,另一方面还有赖于毒物和毒性事件的经济学研究的不断深入,为立法提供科学技术和经济管理两方面的科学依据。为此,探讨经济学研究对毒物管理与立法的影响显得十分紧迫和必要。
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  T3.22 数字切片扫描系统在毒理病理学研究中的应用

  朱琳;周天胜;郁红;冯怡;王蕾;张秀娟;郑艳生;杨秀英

  2013, 27(S1): 78-79.

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  数字切片扫描系统可将整张病理切片全视野高分辨率的快速扫描,使切片中的组织图像信息完整精确地复制并转化为数字化病理切片,保存于计算机或上传于共享网络。数字化的病理切片可广泛的用于科研,病理教学,病理专家远程会诊等领域。近年来随着我国新药临床前安全性评价的不断发展,毒理病理学评价作为新药安全性评价的重要依据也随之日益发展,数字切片扫描系统逐渐应用于毒理病理学评价领域。作为毒理病理学评价的辅助工具,数字切片扫描系统的优缺点便逐渐显现出来。数字切片扫描系统在毒理病理学研究中应用的优点包括:① 代替切片邮寄运输,避免在运输过程中切片破碎甚至所有切片丢失的风险,另外当组织切片需要向国外运输时,节省办理各种证件的时间(如,食蟹猴组织切片的国际运输需提供濒危野生动植物物种国际贸易公约证书);② 便于在同行评议过程中实验病理学家和同行评议病理学家对病变的讨论,使其诊断结果快速达成一致,当遇到疑难病变时,不同国家或不同城市的病理学家可以登陆共享网络参与疑难病变讨论,保证病理诊断的准确性;③ 数字化病理切片保证了形态学定量分析、免疫荧光分析数据的准确性;④ 数字化病理切片可长期保存,不会随着时间的推移而褪色影响诊断;⑤ 便于毒理病理学家的培训,全信息数字化病理切片便于集体阅片,为毒理病理学家的培训提供丰富的材料。但是应用于新药临床前安全性评价的毒理病理学研究中,数字切片扫描系统目前也存在一些问题:① 如果数字化病理切片被用来直接产生诊断结果,实验设施则需要制定相关SOP,进行人员培训和仪器验证,然而目前国内对于数字切片扫描系统的验证还处于空白阶段;② 尽管数字切片扫描系统可将整张病理切片全视野高分辨率的快速扫描,但是对于常规GLP实验,病理切片数量较多,人工装载切片扫描并确认数字化病理切片的质量会耗费大量时间;③ 如果病理学家完全基于数字化病理切片来读片,需用鼠标拖动电脑屏幕上数字切片,检查其所有区域,与直接用显微镜读片相比需要时间更长;④ 由于一张数字化病理切片大小为几兆到几十兆不等,如果一个常规GLP实验所有病理切片都扫描会占据很大储存空间,不便于管理;⑤ 数字切片扫描系统成本较高。随着我国毒理病理学科的飞速发展并逐渐与国际接轨,尽管目前数字切片扫描系统存在一些问题,其在毒理病理学评价中的优点是不容忽视的。
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  T3.50 基于HepG2细胞的药物体外线粒体毒性评价模型的建立

  汤纳平;王雁;惠涛涛;富欣;马璟

  2013, 27(S1): 93-94.

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  目的 拟建立基于HepG2细胞的药物体外线粒体毒性评价模型,为早期药物线粒体毒性筛选提供研究平台。方法 以HepG2细胞作为细胞模型,采用核苷类逆转录酶抑制剂齐多夫定(AZT)作为阳性药物,通过CCK8法检测AZT对HepG2细胞的抑制作用,计算IC₅₀值,并通过流式细胞仪检测AZT对HepG2细胞Ca²⁺浓度、活性氧(ROS)水平、线粒体膜电位(ΔΨm)的影响,通过PCR法检测AZT诱导HepG2细胞线粒体DNA(mtDNA)的损伤情况,通过化学发光法检测AZT对HepG2细胞内ATP含量的影响,并通过ELISA法检测线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放情况。结果 AZT可抑制HepG2细胞增殖,IC₅₀约为100 μmol·L^-1。在该浓度下连续作用HepG2细胞7天可致细胞内ATP含量显著下降(P<0.05),而细胞内线粒体是ATP主要的合成部位,提示线粒体呼吸链或能量合成功能受损。另外在该浓度下AZT可致细胞内Ca²⁺浓度和ROS水平显著升高(P<0.05)以及线粒体膜通道转换孔开放程度明显增加(P<0.05),而线粒体膜电位出现显著降低(去极化)(P<0.05)。但是AZT在100 μmol·L^-1浓度下对mtDNA损伤并不明显(P>0.05),当浓度升高至1000 μmol·L^-1可出现明显mtDNA损伤(P<0.05)。结论 HepG2细胞对线粒体毒性药物较为敏感,能够在体外反映药物线粒体毒性情况,利用该细胞建立的模型来筛选药物体外线粒体毒性是可行的。
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  T3.24 比格犬清醒动物生理信号遥测模型的建立

  石童;鹿晓晶;王陈;李丽琴;张瑞华;张靖

  2013, 27(S1): 80-80.

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  目的 应用植入式遥测技术,建立比格犬清醒动物生理信号监测模型,对比格犬的多项生理参数进行实时和长期采集和分析,为毒物效应评价及其相关拮抗药物效应评价提供重要的技术方法。方法 在无菌洁净室内,采用外科手术,给比格犬体内埋植D70-PCTR植入子(该植入子含生理信号感应装置),护理动物至动物恢复4周后,采用DSI-Dataquest A.R.T 4.3生理信号采集系统,连续遥测记录比格犬在24 h内无束缚条件下的生理信号,观察模型的稳定性;用P3 Plus Analysis Software Module 软件分析ECG、血压、体温和呼吸等生理数据,剔除噪音数据;以沙林作为模型药物,给比格犬染毒,待动物出现中毒症状后,用抗毒剂解救中毒动物,采集和分析各项生理数据,对模型进行验证。结果 (1)比格犬染毒前参数:平均体温在36.8~38.1℃之间,且各时间段内体温值相比无明显差异(P >0.05);平均心率基本维持在85~110 min^-1之间,各时段无明显差异(P>0.05);各时间段内的收缩压、舒张压无明显差异(P >0.05),平均值分别为163.6~188.0和90.8~108.7 mmHg;各时间段内的心电图各间期指标无明显差异(P>0.05),波动较为平稳;在连续监测的24 h内,比格犬呼吸频率波动较大,活动度对呼吸频率的影响较大。(2)沙林染毒早期:比格犬体温无明显变化;呼吸频率明显加快,潮气量、分钟通气量显著增加,吸气时间和呼气时间减少;心率加快,PR间期、QAT间期缩短,QRS间期、QTcb间期无明显变化;收缩压、舒张压和平均动脉血压均明显升高。给予抗毒剂后,5~10 min内各项生理指标变化得到显著控制,30 min以后呼吸和血压参数略有反复现象,但变化不明显,约6 h后各项生理指标接近正常水平。结论 本研究成功建立了比格犬清醒动物生理信号监测模型,可进行实时、长期、连续的生理指标监测,从而获得可靠全面的生理指标数据,可为毒物毒性评价及其抗毒剂效果评价试验提供有效的技术手段。
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  T3.25 他汀类药物不良反应分析

  娄莹;李彦;张晓星;刘玉清;李一石

  2013, 27(S1): 80-81.

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  目的 了解北京地区他汀类药物不良反应报告的现状,为临床合理用药提供依据。方法 分析2008年1月至2012年12月北京市药物不良反应中心接收到的他汀类药物相关的不良反应报告,对不良反应的主要表现、发生时间以及预后等进行分析。结果 本次报表分析中,与他汀类药物相关的不良反应共207例,不良反应表现主要包括:肝功能损害、肌损伤(包括横纹肌溶解、肌酸激酶升高、肌痛等)、过敏、皮疹、乏力、神经系统损害、消化系统损害、关节痛、肝区疼痛、甲状腺功能损害、血压波动、电解质紊乱、血小板减少、凝血时间延长、DIC、全血细胞减少、癌胚抗原升高等。不良反应发生的时间多为服药后1月内,共117例次,占56.5%,其中服药1周内即出现不良反应共54例次,服药后8~30 d出现不良反应共63例次。所有不良反应中最为常见是肝功能损害,共121例,占58.5%,多出现于服药后1个月内,最长发现服药后2年3个月发生肝损害,大多数经停用他汀类药物及保肝治疗后肝功能恢复正常,只有1例死亡;其次是横纹肌溶解,共39例,所有不良反应的18.8%,其中29例出现于服药后1月内,横纹肌溶解导致死亡6例,停药后好转或痊愈28例,另外5例结局不详;其余不良反应均为散发病例,停药并给予积极治疗后均好转或痊愈。他汀类药物相关的不良反应导致死亡8例,其中6例死于横纹肌溶解继发的肾功能衰竭,1例死于严重肝功能损害继发多脏器衰竭,还有1例脑梗死患者服用阿托伐他汀后肌酸激酶明显升高,但最终死于脑疝。结论 临床上最常见的他汀类药物不良反应是肝功能损害,但横纹肌溶解是最危险的不良反应。
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  T3.64 H22实体瘤小鼠的免疫功能指标及环磷酰胺的影响

  饶子亮;郑佳琳;黄威;王诺;钟志勇;邝少松;唐小江

  2013, 27(S1): 101-102.

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  目的 规范化测定H22实体瘤小鼠的免疫功能指标及环磷酰胺的影响。方法 将H22肝癌腹水瘤细胞接种于BALB/c小鼠左侧腋窝皮下,第2天随机分成4组:荷瘤小鼠+环磷酰胺组、荷瘤小鼠组、正常小鼠+环磷酰胺组、正常小鼠组。观察小鼠一般临床表现、成瘤情况、体质量、摄食量、肿瘤体积、肿瘤质量、免疫脏器质量、血常规值、血生化值、细胞因子、淋巴细胞转化、NK细胞活性、淋巴细胞亚群分类及组织病理。结果 与正常小鼠比较,H22荷瘤小鼠平均摄食量降低,RBC, HGB和HCT显著性降低(P<0.01),WBC, PLT和RDW显著性升高(P<0.01),GOT和GPT显著性升高(P<0.01),CD4^-CD8^-显著性降低(P<0.01)。荷瘤小鼠给予环磷酰胺后平均摄食量降低,D9~D14体质量显著性降低(P<0.05),D5~D14肿瘤体积显著性降低(P<0.01),肿瘤质量、脾质量、胸腺质量显著性降低(P<0.01),WBC、MCV显著降低(P<0.01),HGB, MCH, MCHC和PLT显著增加(P<0.05),GOT和GPT显著降低(P<0.01),IL-2显著降低(P<0.01),IFN-γ显著增加(P<0.01),CD4⁺CD8^-(%)、CD4⁺CD8⁺ (%)、CD4^-CD8⁺(%)、CD3⁺(%)淋巴细胞显著增加(P<0.01),CD4^-CD8^-(%)淋巴细胞显著降低(P<0.01),脾淋巴细胞转化吸光度差值显著降低(P<0.05),NK细胞活性显著降低(P<0.05)。结论 本文全面测定了H22肝癌实体瘤小鼠的血液指标和免疫功能指标,为生物反应调节剂抗肿瘤药物筛选提供了基础数据。
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  T3.27 MTT比色法测定As₂O₃抑制C6胶质瘤细胞的增殖

  王春莲;张崇华

  2013, 27(S1): 81-81.

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  目的 观察三氧化二砷(As₂O₃)对体外培养的实验用C6鼠胶质瘤细胞的增殖抑制作用。方法 用酶联免疫检测仪(MTT比色法)测定As₂O₃对细胞的增殖抑制。结果 As₂O₃对C6胶质瘤细胞增殖具有抑制作用,在一定剂量范围内As₂O₃对C6胶质瘤细胞增殖抑制作用存在剂量依赖性和时间依赖性上升趋势。结论 三氧化二砷对脑胶质瘤具有抗癌作用。
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  T2.73 甲基叔丁基醚对斜生栅藻的毒性作用

  闫峻;胡传禄;张华山;杨红莲;林本成;袭著革

  2013, 27(S1): 64-64.

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  目的 甲基叔丁基醚(MTBE)具有良好的防爆性能和燃烧性,并且能明显提高汽油的辛烷值,已经替代四乙基铅作为一种很好的汽油添加剂而被广泛应用。同时,MTBE作为一种新型污染物,易渗入地下水、土壤中,且不易降解,对环境和生物体健康构成潜在威胁。本实验研究目的在于初步评价MTBE对水生生物斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)的毒性效应。方法 选用水生生态系统中的初级生产者斜生栅藻作为受试生物,根据ISO标准方法,绘制斜生栅藻的生长曲线,确定最佳起始藻密度,并探讨不同浓度的MTBE对斜生栅藻生长情况的影响;并采用80%丙酮抽提法,分光光度计测定并计算藻体内光合色素含量。结果 试验结果表明,在72 h附近斜生栅藻开始进入对数生长期,接种最佳初始藻密度约为1.4×10⁵ ml^-1;低浓度的MTBE(≤577.08 mg·L^-1)能刺激斜生栅藻的生长;高浓度的MTBE(≥1000 mg·L^-1)能造成斜生栅藻细胞内部结构或性质的改变,对细胞产生毒性效应,进而抑制斜生栅藻的生长;MTBE对斜生栅藻生长抑制的值72 h-EC₅₀值为5190.28 mg·L^-1,48 h-EC₅₀值为5219.41 mg·L^-1,24 h-EC₅₀值为4637.47 mg·L^-1。光合色素含量测定结果显示,光合色素含量与斜生栅藻的生长抑制率呈现良好的对应关系。各染毒组叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量与对照组相比均明显降低,差异具有显著性(P<0.05),随着染毒浓度的升高,差异具有极显著性(P<0.01),说明高浓度的MTBE对斜生栅藻的光合色素有破坏作用。结论 根据毒性分级,MTBE对斜生栅藻的毒性属于低毒性,但是高浓度的MTBE(≥1000 mg·L^-1)能够抑制斜生栅藻的生长,造成斜生栅藻细胞内部结构或性质的改变,对细胞产生毒性效应;同时对斜生栅藻的光合色素具有破坏作用。
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  T2.33 三氯乙烯对B6C3F1小鼠肝基因表达及DNA甲基化的影响

  姜岩;聂继华;童建;陈涛

  2013, 27(S1): 43-43.

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  目的 探讨三氯乙烯肝毒性的毒作用机制。方法 将三氯乙烯溶于玉米油中,以灌胃方式连续染毒8周龄的B6C3F1小鼠5 d,浓度选用1000 mg·kg^-1·d^-1。最后一次灌胃后1 h处死小鼠,取肝进行DNA和RNA提取。反转录cDNA后,用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记,与Agilent表达谱芯片杂交,洗脱后利用Agilent Scanner扫描,用Genesrping软件进行标准化和后续处理。利用T检验筛选差异基因, 并进行GO和KEGG富集分析。应用荧光定量PCR验证重要基因的表达,并采用亚硫酸盐PCR结合限制性酶切技术检测DNA甲基化水平。结果 三氯乙烯处理组小鼠肝中有388个基因表达上调,207个基因表达下调,这些基因主要集中在代谢、PPAR以及细胞周期相关的信号通路。荧光定量PCR确认了癌基因Jun和DNA修复相关基因RAd51b在三氯乙烯处理组小鼠肝中的高表达,并发现Jun的启动子区DNA低甲基化。代表全基因组范围DNA甲基化程度的重复序列LINE-1的DNA甲基化水平在三氯乙烯处理前后没有变化。结论 三氯乙烯可引起小鼠肝中与代谢、PPAR以及细胞周期信号通路相关的基因表达变化,特别是引起癌基因Jun的异常高表达,这可能与三氯乙烯引起的DNA甲基化异常有关。
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  T2.34 温度胁迫诱导秀丽线虫重金属抗性

  陈玮;汪旻旻;段红艳;郁蔓蔓;王顺昌

  2013, 27(S1): 44-44.

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  目的 利用模式生物秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)品系丰富并且对镉敏感的特点,通过预先热休克胁迫,激活线虫先天免疫信号途径,测定其镉暴露半致死剂量(LC₅₀),结合荧光蛋白表达分析,评价温度胁迫诱导的镉暴露耐受性及其作用机制。方法 将经同步化培养的N2野生型秀丽线虫置于20, 30, 32.5, 35和37.5℃下处理1 h,再于20℃恢复1 h后,在20℃下以不同剂量的CdCl₂处理48 h,统计死亡率,计算其48 h LC₅₀;利用不同线虫基因敲除品系,结合RNAi技术,分析不同信号传导途径在介导线虫温度胁迫重金属抗性的反应,并通过荧光分析,探讨相关蛋白的原位表达。结果 热休克处理可显著提高野生型线虫对镉的耐受性,48 h LC50从20℃时的(0.56±0.042)mmol·L^-1升高至35℃下的(1.07±0.03)mmol·L^-1,并随着暴露时间的延长而增加,敲除hsp-16.2基因可抑制线虫镉耐受效应。利用转基因品系线虫分析发现,热休克诱导的热休克蛋白HSP-16.2高表达与此过程密切相关,此外,hsp-4和hsp-70在此过程中也发挥重要作用。使用RNAi技术分析发现,线虫热休克因子基因hsf-1和FOXO转录因子daf-16在介导其热休克镉耐受性发挥重要作用,敲除这两个基因中任何一个,都将抑制线虫的耐受性反应,而使用表达hsf-1或daf-16 cDNA的线虫品系,其热休克镉耐受性均有显著提高。通过在不同温度下的热休克处理结果表明,热休克处理导致HSF-1::GFP表达增加,并在细胞核形成多个聚焦点,同时增加DAF-16::GFP核质转位比例。结论 预先对秀丽线虫进行热休克处理可显著提高其对重金属镉暴露的耐受性,并具有显著的时间效应;热休克蛋白基因hsp-16.2, hsp-4和hsp-70与线虫热休克诱导的镉耐受性密切相关,并受到热休克因子HSF-1和FOXO转录因子daf-16的调控。本研究结果表明,先天免疫信号转导通路在保护机体免受重金属毒害中发挥重要作用。
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  T2.36 线粒体凋亡途径介导孕期全氟辛烷磺酸盐暴露致 子鼠心脏细胞的凋亡效应

  曾怀才;孙诗博;李武;吴移谋

  2013, 27(S1): 45-45.

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  目的 探讨孕期全氟辛烷磺酸盐(PFOS)暴露对子鼠心脏细胞的凋亡效应及线粒体凋亡通路的作用。方法 40只SD孕鼠随机分成对照组、PFOS 0.1, 0.6和2.0 mg·kg^-1·d^-1组,从受孕第2天开始(GD2)天到GD21结束,每天上午8:00灌胃一次。在出生后21 d(PND21)处死幼鼠,并迅速分离心脏组织,提取mRNA,经逆转录形成cDNA,-80℃保存备用,或者4%多聚甲醛固定。逆转录荧光定量PCR(RT-QPCR)检测Bax,Bcl-2,胱天蛋白酶9,胱天蛋白酶3,P53和细胞色素c基因的mRNA含量;Western blot检测其蛋白水平;采用TUNEL染色技术检测凋亡细胞。结果 0.6和2.0 mg·kg^-1组的细胞凋亡率分别为7.2±1.3%和11.8±2.4%,高于对照组的(1.3±0.8)%(P<0.05);与对照组比较,2.0 mg·kg^-1组Bcl-2的mRNA和蛋白含量下降(P<0.05),而3个PFOS染毒组Bax mRNA和蛋白含量均增加(P<0.05);0.6和2.0 mg·kg^-1组p53,细胞色素c,胱天蛋白酶9,胱天蛋白酶3的mRNA和蛋白含量高于对照组(P<0.05)。结论 孕期PFOS暴露诱导断奶大鼠心脏细胞的凋亡,其机制可能与线粒体功能改变有关。
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  T2.37 四溴双酚A对斑马鱼胚胎抗氧化酶系作用

  吴晟旻;吉贵祥;刘济宁;王蕾;石利利

  2013, 27(S1): 45-45.

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  目的 从生化和分子水平上揭示四溴双酚A的毒性作用机制,为四溴双酚A环境风险评估和环境管理提供重要技术支持。方法 (1)建立四溴双酚A染毒模型。配制浓度分别为0.05, 0.1, 0.2, 0.4和0.8 mg·L^-1的四溴双酚A处理组,同时设置一空白对照组。将受精30 min内的斑马鱼卵放入实验液,实验过程中及时挑除死卵。(2)分别测定染毒24, 48和72 h后,空白对照、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 mg·L^-1处理组胚胎内Cu/Zn-SOD, CAT和GPX活性变化以及MDA的含量变化。(3)利用荧光定量PCR分别测定染毒24, 48和72 h后,空白对照、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 mg·L^-1处理组胚胎内Cu/Zn-SOD, CAT和GPX基因mRNA相对表达量的变化。结果 (1)不同浓度四溴双酚A染毒斑马鱼胚胎24 h,胚胎Cu/Zn-SOD, CAT和GPX酶活性均没有明显变化;在48和72 h,胚胎内的Cu/Zn-SOD, CAT和GPX酶活性均随着浓度增高而降低,与对照组相比,0.1, 0.2, 0.4和0.8 mg·L^-1四个浓度处理组酶的活性均明显下降,差异达到显著水平(P<0.05)。0.4和0.8 mg·L^-1两个处理组与对照组相比,MDA在48和72 h含量明显升高(P<0.05)。(2)在染毒72 h,Cu/Zn-SOD mRNA表达量0.4和0.8 mg·L^-1处理组与对照组相比均明显提高(P<0.05),但随着时间的推移24, 48和72 h的Cu/Zn-SOD, CAT和GPX mRNA表达量,各浓度组均呈现下降趋势。结论 随着四溴双酚A作用浓度增加,斑马鱼胚胎Cu/Zn-SOD, CAT和GPX酶活性呈现下降,而Cu/Zn-SOD mRNA表达量却明显提高,因此两者结果没有明显的一致性。而在时间序列上 Cu/Zn-SOD, CAT和GPX mRNA表达量和其酶活性均为下降趋势,呈现明显一致性。
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  T2.39 不同剂量亚砷酸钠暴露不同时间对HaCaT细胞氧化应激的影响

  许熙国;王大朋;安艳

  2013, 27(S1): 46-46.

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  目的 探索不同剂量亚砷酸钠暴露不同时间对诱导人永生化角质形成(HaCaT)细胞氧化应激的影响以及低剂量亚砷酸钠预处理HaCaT细胞诱导其氧化应激的适应性反应。方法 设未预处理组(加入终浓度为10 μmol·L^-1的亚砷酸钠染毒0, 8和24 h)和预处理组(加入0.15 μmol·L^-1亚砷酸钠预处理24 h后,加入10 μmol·L^-1亚砷酸钠染毒0, 8和24 h)。利用2'7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)通过流式细胞仪检测细胞内ROS水平,用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD水平,用硫代巴比妥酸(TBA)法检测细胞MDA水平。结果 与未预处理组比较,预处理组加入0.15 μmol·L^-1亚砷酸钠预处理24 h后,加入10 μmol·L^-1亚砷酸钠染毒8和24 h,其HaCaT细胞内ROS水平均较低,差异有统计学意义(P<0.05)。随着亚砷酸钠染毒时间的延长,预处理组和未预处理组HaCaT细胞内ROS水平不断上升,在8 h达到峰值;未预处理组HaCaT细胞内ROS水平峰值高于预处理组峰值,差异有统计学意义(P<0.05)。与未预处理组比较,预处理组加入0.15 μmol·L^-1亚砷酸钠预处理24 h后,加入10 μmol·L^-1亚砷酸钠染毒0, 8和24 h,其HaCaT细胞内SOD水平均较高,差异有统计学意义(P<0.05)。随着亚砷酸钠染毒时间的延长,HaCaT细胞内SOD水平先下降后上升。与未预处理组比较,预处理组加入0.15 μmol·L^-1亚砷酸钠预处理24 h后,加入10 μmol·L^-1亚砷酸钠染毒8和24 h,其HaCaT细胞MDA水平均较低,差异有统计学意义(P<0.05);随着亚砷酸钠染毒时间的延长,未预处理组HaCaT细胞MDA水平先上升后下降,在8 h达到峰值,而预处理组HaCaT细胞MDA水平不断上升,未预处理组MDA水平峰值高于预处理组24 h水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HaCaT细胞急性暴露于亚砷酸钠后能够引起HaCaT细胞内ROS和MDA产生增加,而亚砷酸钠暴露诱导HaCaT细胞ROS, SOD和MDA水平的改变与暴露时间密切相关,且低剂量亚砷酸钠预暴露后能诱导HaCaT细胞对氧化应激的适应性反应。
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  T3.52 左旋苯甲酰脯氨醇自由基对乳腺癌细胞的毒性作用

  曾丽华;张琰君;苗霞;郎海洋;赵涛;陈永斌;李予蓉;张杰;刘军叶;郭国祯

  2013, 27(S1): 94-95.

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  本实验研究了一种新合成的氮氧自由基化合物左旋苯甲酸脯氨醇(L-NNP)对人乳腺癌MCFK-7和MDA-MB-231细胞的细胞毒性及其作用机理。结果 发现L-NNP明显抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的生长,对MDA-MB-231细胞的细胞毒性明显大于MCF-7细胞。相同浓度的的L-NNP(50 mg·L^-1)对两种乳癌细胞的杀伤明显大于阳性对照药Docetaxel,而且效应随L-NNP浓度升高和暴露时间延长而增加。L-NNP对乳癌细胞周期有双相影响,包括短暂、轻度的G1阻滞和迟发显著的S期阻滞。形态学观察显示L-NNP暴露48 h可诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞发生典型的胀亡改变,细胞明显肿胀伴细胞结构破坏。L-NNP 诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞出现膜结构破坏、DNA双链断裂和线粒体结构功能丧失。生化实验检测结果表明细胞内ATP减少、MDA增加、细胞内抗氧化能力下降,表明L-NNP引起细胞氧化应激和氧化损伤。而且L-NNP引起两种乳腺癌细胞内活性氧含量显著增加,并随其浓度升高和暴露时间延长而增加。进一步选用活性氧清除剂NAC来降低L-NNP引起细胞内ROS含量,结果发现NAC可显著减少L-NNP引起的MCF-7细胞内活性氧的增加;可以明显提高L-NNP影响MCF-7细胞的存活率,而且细胞形态正常;研究发现L-NNP抑制MCF-7细胞内胱天蛋白酶3的活力并下调p53和Bax蛋白表达, 还可诱导NF-κB p65和Bcl-2的蛋白表达水平升高,NAC则可明显抑制L-NNP诱导的NF-κBp65和Bcl-2蛋白增加;而NF-κB的特异性抑制剂Bay-11-7082也可抑制L-NNP诱导的NF-κBp65和Bcl-2蛋白表达增加。由此可见细胞内活性氧增加可能是L-NNP细胞毒性的始动因素,它继而激活了胱天蛋白酶非依赖性的NF-κB/Bcl-2通路,最终诱导细胞发生胀亡。因此我们认为, L-NNP在细胞水平均具有一定的抗肿瘤作用,主要通过活性氧介导的氧化损伤,激活胱天蛋白酶非依赖的NF-κB/Bcl-2通路,作用于细胞膜、线粒体和DNA,引起细胞结构和生物大分子破坏,最终导致肿瘤细胞胀亡。
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  T3.82 清醒Beagle犬灌胃PH001对其心血管系统和呼吸功能影响

  关海源;郭新苗;王应印;魏金峰;王爱平;

  2013, 27(S1): 111-111.

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  目的 采用EMKA遥测设备,观察清醒Beagle犬单次灌胃PH001对其心血管系统和呼吸功能的影响,为该药的临床使用提供参考。方法 Beagle犬,雌雄各半,采用交叉拉丁方设计单次灌胃PH001 1.5, 4.5和15.0 g·kg^-1。记录给药前后动物呼吸频率、呼吸强度、血压、心电变化,设-10, 10, 30, 60, 120和180 min时间点,以给药开始点为0 min,以-10 min所测指标作为自身对照,给药后各指标与自身对照比较,进行方差分析。结果 Beagle单次灌胃PH001 1.5, 4.5和15.0 g·kg^-1剂量,呼吸频率、呼吸强度及心电各指标(心率、RR间期、PR间期、QRS时程、QT间期、QTcF)、血压(平均动脉压、舒张压、收缩压)在给药后10, 30, 60, 120和180 min与药前比较均无明显异常改变,统计结果无显著性差异;溶媒对照组受试动物上述检测指标在给药前后亦无明显改变。 给药结束后,高剂量组有1只动物出现一过性流涎、呕吐的症状,继续观察未见。其他动物未见异常。结论 在本实验条件下,Beagle犬单次灌胃PH001剂量为1.5, 4.5和15.0 g·kg^-1(相当于临床拟用剂量倍数的3, 9和27倍)不会对动物的心血管系统及呼吸功能产生影响。同时观察到了15.0 g·kg^-1剂量组1只动物出现了一过性的流涎和呕吐现象。
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  T3.29 GLP试验中供试品管理的质量保证

  郭敏;乔红群;丁亚军;刘晶

  2013, 27(S1): 82-83.

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  供试品是影响药物安全性评价的最重要因素之一,必须保证实验动物给予正确的和剂量准确的供试品。GLP试验中QAU对供试品的检查包括供试品的保管、收发、配制、检测、处理等方面,下面就这些方面的检查谈谈注意点。1. 供试品保管: SD在拟写试验方案之前,委托方应提供足量的供试品和完整的供试品信息,包括该批次供试品的质量检验报告、临床拟用说明书和含量检测方法。供试品部门根据委托方填写的保存条件对供试品进行妥善保管。QA在检查供试品保存条件是否符合要求的同时,首先应检查委托方填写的供试品信息与其说明书、检验报告是否一致。其次应注意供试品室的空调、冰箱、遮光帘、干燥剂等是否正常使用,储存容器上是否贴有信息完整的标签,供试品的摆放位置是否及时准确登记,做到帐物一致,保存条件正确。2. 供试品收发: 试验过程中供试品领用和返还记录需及时准确,试验人员每天领取当天药量,如有特殊情况,可按最小包装领用,当天剩余供试品可存放于供试品临时存放处,但需注意保存条件,并做好存放和领取记录。QA应不定期检查供试品分发、返还、剩余药液处理记录,台帐与实际数量是否吻合。3. 供试品配制: 检查供试品配制时,QA应关注天平的使用状态,使用的天平是否在检定有效期内,其感量是否符合称量要求,试验人员是否按SOP进行操作。供试品配制时应尽量采取定容的方法,同时配制时的环境条件应尽量与其保存条件一致。供试品和溶媒混合后应及时贴上统一格式的状态标签,标明研究号、试验名称、组别、浓度、配制人、配制时间和有效期等。4. 供试品检测: 供试品检测内容应包括方法学验证、含量测定、供试液稳定性、均一性检测。QA检查时应注意以下几点:SD向供试品部门提交的送检单上所填的内容是否和方案一致;供试品部门在进行检测之前是否对检测方法进行验证;供试液的使用是否在供试液稳定性时限内。5. 供试品处理: 实验期间每天给药后剩余的供试品溶液应按照废液处理,并登记剩余药液的量,QA应根据领用量、给药量和剩余量进行核对。实验结束后剩余的供试品应按照委托方要求返还或自行销毁,QA应检查供试品台帐,核对供试品收样量、领用量、留样量和返还量/销毁量是否对应。
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  T3.30 甲基化-β-环糊精对齐墩果酸的增溶效果

  王钊;王欣;廖鼐;海春旭

  2013, 27(S1): 83-83.

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  目的 为提高齐墩果酸的水溶性和生物利用度,研究甲基化-β-环糊精对齐墩果酸包合后对齐墩果酸的增溶效果。方法 建立甲基化-β-环糊精与齐墩果酸包合物中齐墩果酸的高效液相色谱测定方法,并进行线性关系、回收率考察。测定10~160 mmol·L^-1系列浓度的甲基化-β-环糊精包合的齐墩果酸的量,绘制相溶解度曲线图,考察不同浓度甲基化-β-环糊精对齐墩果酸的增溶能力,并测定包合过程的超分子包合常数。结果 建立的甲基化-β-环糊精与齐墩果酸包合物中齐墩果酸测定方法在0.0625~2 g·L^-1线性范围关系良好。回收率符合要求。齐墩果酸的溶解度随着甲基化-β-环糊精浓度的增加而明显增加,齐墩果酸与甲基化-β-环糊精的相溶解度图呈现出AL型特点。当甲基化-β-环糊精浓度为160 mmol·L^-1时,齐墩果酸的溶解度可达0.0129 mol·L^-1。结论 对甲基化-β-环糊精与齐墩果酸的相溶解度研究结果可以看出甲基化-β-环糊精与齐墩果酸可自发形成重量比为1:1的包合物。形成的超分子包合物对齐墩果酸有着良好的增溶作用,为齐墩果酸的制剂学研究提供了良好的研究基础。
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  T14.18 p15基因启动子区甲基化及缺失与燃煤污染型砷中毒的关系

  韩雪;王丽芳;张爱华;黄晓欣

  2013, 27(S1): 278-278.

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  目的 地方性砷中毒是世界性的公共卫生问题,且至今机制不明,本研究通过检测燃煤污染型砷中毒患者p15基因启动子区缺失及甲基化状况,探讨该基因在燃煤污染型砷中毒发生发展乃至癌变中的作用。方法 采用病例-对照研究,参照地方性砷中毒诊断标准(WS/T211-2001)选择105例燃煤污染型砷中毒患者作为病例组,按临床分度标准将其分为轻、中、重度中毒3组,分别为35例、44例和26例;105例中44例自愿手术者按皮肤病理诊断分为癌变组和非癌变组,分别为17例和27例。另选择相邻非砷污染地区、生活习惯相似、年龄性别配比均衡且体检合格的103例居民作为对照组。应用Ag-DDC法检测尿砷、发砷含量;应用多重PCR和甲基化特异性PCR分析p15基因外显子缺失及启动区甲基化状况,荧光定量PCR检测p15基因转录表达情况。结果 砷中毒患者尿砷、发砷含量均显著高于对照组(P<0.01)。病例组p15基因缺失率显著高于对照组(P<0.05),随病情的加重p15基因缺失率逐渐增加(χ²=7.84,P<0.05);皮肤癌变组p15基因缺失率显著高于非癌变组(P<0.05)。病例组p15基因启动区甲基化阳性率显著高于对照组(P<0.01);对照组、轻、中、重度中毒组间p15基因甲基化阳性率逐渐增加(χ²=12.82,P<0.05);皮肤癌变组p15基因甲基化阳性率显著高于皮肤非癌变组(P<0.01)。p15基因缺失率随尿砷、发砷含量的增加而增高(χ²=4.9, 4.31,P<0.05),p15基因启动区甲基化阳性率随发砷含量的增加而增高(χ²=4.28,P<0.05);随着发砷含量的增高,p15基因表达显著降低(r=-0.37, P<0.05)。结论 燃煤砷污染可导致人体p15基因缺失和启动区高甲基化,并均与地方性砷中毒的发生发展乃至癌变有关,可能是砷中毒发生发展的重要原因。
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  T17.10 Cell based in vitro toxicity testing

  Jeff HASKINS

  2013, 27(S1): 304-305.

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  The use of cells and fluorescent probes have emerged as mainstream in vitro toxicology tools where fluorescence imaging is applied and image analysis extracts quantitative features that describe cell health and cell death.This presentation will detail the application of fluorescence imaging for the study of drug and chemical-induced liver injury, genetic toxicity, reproductive toxicity, neurotoxicity, and acute toxicity associated with carbon nanoparticles.Automation, fluorescence biosensors, data analyses, and data reduction are key components of this technology designed to predict toxic affects in human following exposure to drug or chemical.This presentation will be a comprehensive technology review.
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  T14.20 人类CYP2E1介导多氯联苯的遗传毒性及其结构-活性关系

  刘云岗;赖演媚;姜浩

  2013, 27(S1): 279-279.

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  目的 探讨人CYP2E1是否对低氯化多氯联苯(PCB)的代谢活化作用。方法 采用23个含一、二、三、四个氯原子的PCB,以稳定表达人CYP2E1和人硫酸基转移酶(SULT)1A1的V79细胞系(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)为受试细胞,观察这些PCB化合物诱导细胞毒性(MTT试验)及微核的作用。结果 受试PCB对未表达上述酶的V79对照细胞均无细胞毒作用,也不诱发微核;然而,这23个PCB中有22个都对V79-hCYP2E1-hSULT1A1强弱不等地诱导细胞毒和/或微核形成。并且其作用呈现明显的结构-活性关系,例如2,3-二氯联苯和2,2'-二氯联苯是二氯联苯中遗传毒作用最强者;在前者基础上形成的2,3,3'-三氯联苯和2,3,4'-三氯联苯则为所有受试物中遗传毒性最强(增强一个数量级)。一氯联苯和四氯联苯未出现细胞毒作用,诱发微核作用相对较弱。本研究还发现CYP2E1抑制剂1-氨基苯三唑可阻断PCB的细胞毒作用,并显著降低其诱发微核的作用;而SULT1A1的抑制剂五氯酚则可强化某些PCB的作用。表明人CYP2E1是介导所观察到代谢活化作用的关键酶。结论 本研究首次发现催化PCB代谢活化的CYP亚型,并证实低氯化PCB普遍可经人CYP2E1活化为致突变物。而人SULT1A1对某些PCB的活性代谢物则具有一定解毒作用。
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  T14.22 人类CYP2E1介导多氯联苯的遗传毒性及其结构-活性关系

  赖演媚;姜浩;刘云岗

  2013, 27(S1): 280-280.

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  目的 探讨人CYP2E1是否对低氯化多氯联苯(PCB)具有代谢活化作用。此外,我们前期研究发现人硫酸基转移酶(SULT)1A1具有催化某些PCBs羟化代谢物形成硫酸基结合物(灭活形式)的作用。方法 采用23个含一、二、三、四个氯原子的PCB,以稳定表达人CYP2E1和人硫酸基转移酶(SULT)1A1的V79细胞系(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)为受试细胞,观察这些PCB化合物诱导细胞毒性及微核的作用。结果 受试PCB对未表达上述酶的V79对照细胞均无细胞毒作用,也不诱发微核;然而,这23个PCB中有22个都对V79-hCYP2E1-hSULT1A1强弱不等地诱导细胞毒和/或微核形成。并且其作用呈现明显的结构-活性关系,例如2,3-二氯联苯和2,2'-二氯联苯是二氯联苯中遗传毒作用最强者(阈浓度分别为20和30 μmol·L^-1);在前者基础上形成的2,3,3'-三氯联苯和2,3,4'-三氯联苯则为所有受试物中遗传毒性最强(增强10倍,阈浓度降低至2 μmol·L^-1)。一氯联苯和四氯联苯未出现细胞毒作用,诱发微核作用相对较弱。本研究还发现CYP2E1抑制剂1-氨基苯三唑可阻断PCB的细胞毒作用,并显著降低其诱发微核的作用;而SULT1A1的抑制剂五氯酚则可强化某些PCB的作用。表明人CYP2E1是介导所观察到代谢活化作用的关键酶。结论 催化PCB代谢活化的CYP亚型,低氯化PCB普遍可经人CYP2E1活化为致突变物。而人SULT1A1对某些PCB的活性代谢物则具有一定解毒作用。
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  T11.5 土壤中的磺胺类耐药菌及其相关抗性基因分析

  王娜;杨晓洪;郭欣妍;叶波平;单正军

  2013, 27(S1): 236-236.

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  目的 研究环境中磺胺类耐药菌的分析工作,检测相关抗性基因在这些耐药菌中的分布和表达规律。方法 采用抗性平板筛选法和实时荧光定量PCR方法,比较施用和未施用过猪粪肥的耕作土壤中磺胺类耐药菌及其相关抗性基因(sul1, sul2和sul3)的种群和分布特征。结果 从12个施用猪粪肥和3个未施用猪粪肥的土壤样品中分别分离到172株和38株磺胺类耐药菌菌株,根据主要形态特征和16s rDNA序列,可分为5个细菌类群20个属。基于16s rDNA文库的分析结果显示:放线菌门(Actinobacteria)和变形细菌门(Proteobacteria)是这两种不同类型土壤中共同的优势类群,而TM7和疣微菌门(Verrucomicrobia)是属于施用猪粪肥土壤中的特征菌属,armatimonadetes类细菌则属于未施用猪粪肥土壤样品中的特征菌。在从冬季土壤中分离到的122株耐药菌中,sul2主要分布于基因组DNA上,sul1基因主要分布于这些菌株的质粒DNA中;此外,仅从两份土壤样品来源的5株耐药菌的基因组或质粒DNA检测到sul3基因。而在夏季土壤样品来源的50株耐药菌菌株中, sul1基因主要分布于基因组DNA上,sul2则主要分布于质粒DNA上,仅有来源于一份土壤样品的1株菌的质粒DNA上含有sul3基因。从sul基因在不同菌属中的分布情况来看:sul1和sul2基因主要分布于芽孢杆菌属(Bacillus)和志贺氏菌属(Shigella)细菌中。结论 3种抗性基因在耐药菌遗传物质中普遍分布的性;一些菌属具有磺胺类耐药基因。
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  T12.3 PI3K-AKT-NFκB通路在大蒜油预防二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌中的作用

  张翠丽;曾涛;赵秀兰;宋福永;谢克勤

  2013, 27(S1): 238-238.

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  目的 探讨PI3K-AKT-NFκB信号通路是否参与了NDEA诱发大鼠肝癌的过程,并阐明其在大蒜油预防NDEA肝癌中的作用。方法 SPF级雄性Wistar大鼠随机分为4组:正常对照组、NDEA模型组、大蒜油低、高剂量处理组,每组15只。NDEA模型组和大蒜油处理组均灌胃NDEA(10 mg·kg^-1),2 个大蒜油处理组同时给予不同浓度的大蒜油灌胃(20或40 mg·kg^-1),正常对照组给予等体积的玉米油灌胃。20周后大鼠断头处死,取肝,分别提取总蛋白和核蛋白,在总蛋白中检测PI3K-p85、PI3K-p110、总AKT、p-AKT (Ser473)、p-AKT (Thr308)、p-AKT (Tyr450)的表达,在核蛋白中检测NFκB p65和p-IκB (Ser32)表达。结果 PI3K的两个亚基p85和p110的蛋白含量在NDEA染毒大鼠肝组织中均明显增加;大鼠预处理大蒜油可显著抑制NDEA诱导的p85和p110的蛋白含量的增加(P<0.05);NDEA处理使大鼠肝组织中总AKT的蛋白含量明显增加(P<0.01),预处理大蒜油可显著抑制NDEA诱导的大鼠肝中总AKT的表达(P<0.01);磷酸化AKT是AKT的活性形式,NDEA染毒大鼠后,p-AKT(Thr 308) 和p-AKT(Ser 473) 的蛋白含量均明显增加;大鼠预处理大蒜油可显著抑制NDEA诱导的p-AKT(Thr 308)和p-AKT(Ser 473)的增加(P<0.05),但p-AKT(Tyr450)在各组的表达无显著性变化;大鼠染毒NDEA后,肝组织中p-IκB的含量明显减少,大鼠预处理大蒜油可显著增加IκB的磷酸化,与p-IκB的变化情况相反,大鼠染毒NDEA后,肝组织中NF-κB p65的含量显著增加(P<0.01)大蒜油对NDEA诱导的p65蛋白含量的增加有明显的抑制作用(P<0.01)。结论 大鼠慢性染毒NDEA后,活化了PI3K-AKT信号通路,并激活下游的NF-κB信号分子;提前预处理大蒜油可显著抑制NDEA对PI3K-AKT-NF-κB这一信号通路的激活,这可能是大蒜油预防NDEA诱发肝癌的重要机制之一。
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  T12.5 枯否氏细胞在利福平和异烟肼联合所致大鼠肝损伤中的作用

  邵晓颖;王硕;杨依霖;谢克勤

  2013, 27(S1): 239-239.

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  目的 通过对正常大鼠建立抗结核一线药物利福平(RIF)和异烟肼(INH)联合诱导的肝损伤模型,并用枯否氏细胞抑制剂氯化钆(GdCl₃)抑制其枯否氏细胞,进一步探讨枯否氏细胞在其肝损伤中的作用。方法 将40只正常雄性Wistar大鼠随机分为4组:正常对照组、RIF+INH模型组、氯化钆组、RIF+INH+氯化钆组,每组10只。每3 d对GdCl₃组、RIF+INH+GdCl₃组大鼠尾静脉注射GdCl₃ 10 mg·kg^-1一次,正常对照组大鼠尾静脉注射等体积0.9%无菌生理盐水一次;RIF+INH模型组、RIF+INH+GdCl₃组给予RIF(100 mg·kg^-1)+INH(100 mg·kg^-1),正常对照组给予等体积的0.9%无菌生理盐水,每天一次,连续灌胃28 d。观察大鼠体重变化,28 d后处死大鼠,测定大鼠血清中丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TB) 水平;称取肝重,计算肝系数;做石蜡切片HE染色,观察肝损伤程度。用SPSS16.0软件进行数据分析,所有数据均以x±s表示,组间比较采用方差分析,两两比较釆用S-N-K检验。以α=0.05为检验水准。结果 与正常对照组比较,RIF+INH模型组、GdCl₃组和RIF+INH+GdCl₃组体重明显减少(P<0.05),RIF+INH模型组和RIF+INH+GdCl₃组肝重明显增加(P<0.01),RIF+INH模型组、GdCl₃组和RIF+INH+GdCl₃组肝系数明显增大(P<0.01),RIF+INH模型组血清中ALT, AST, ALP及TB的水平明显升高(P<0.01);与RIF+INH模型组比较,RIF+INH+GdCl₃组体重明显减少(P<0.05),GdCl₃组和RIF+INH+GdCl₃组肝重分别减小15.42%(P<0.01)、5.42%,GdCl3组肝系数减小14.86%(P<0.05),GdCl₃组和RIF+INH+GdCl₃组血清中ALT, AST, ALP及TB的水平明显降低(P<0.01)。肝病理结果显示,模型组有不同程度细胞浊肿、气球样变,GdCl₃组和RIF+INH+GdCl₃组没有明显的病理结构改变。结论 枯否氏细胞在利福平和异烟肼联合所致大鼠肝损伤中的起重要作用,抑制枯否氏细胞可对利福平和异烟肼联合所致大鼠肝损伤起保护作用。
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  T17.12 交叉参照方法在毒理学领域的应用探讨——类似物筛选与假说的建立

  陈水娟

  2013, 27(S1): 305-306.

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  交叉参照(read-across)已日趋作为非测试方法的一种,被应用于化学品安全评估中。欧盟化学品管理署公布的物质卷宗和美国环保署公布的高产量物质危害报告中,有相当一部分物质均采用交叉参照方法。交叉参照,即由一个(或多个)化合物的节点信息预测另一个(或多个)具有相似特性的化合物的同一节点,从而替代测试数据。科学合理的假说是交叉参照应用的前提条件,建立假说的基本原则包括:(1)化学结构相似性:具有相同的官能团,如醛基、环氧化物、酯键、特殊的金属离子等;规律性变化,如碳链的依次增加或缩短等,主要是一些碳氢化合物的溶剂、石油产物、天然复合物;额外增加或缺失官能团不会影响物质最终的毒性表征。其判断主要依赖于现有的毒理学数据,考虑该结构基团可能产生的毒性差异。目前用于预测类似物的软件AIM (Analog Identification Methodology),可基于化学结构初步筛选类似物,但不能直接代替交叉参照。(2)性质相似性:具有相似的理化特性包括,分子量、溶解性、辛醇/水分配系数、蒸汽压、粒径等;基本的毒代动力学特性、代谢途径、作用机制等信息;具有相同的前体或分解产物。(3)物质鉴定:物质的组分、纯度和杂质特性需要进行评估。其中一些杂质可能会影响整体毒性,有必要确定杂质的成分和水平,明确杂质的危害特性,判断该差异是否会产生额外的影响。(4)类似物数据质量:合理假说建立的重要因素之一是类似物数据的相关性和可靠性。只有先保证现有的试验数据质量相关且可靠,交叉参照方法的结果才有效,才可能被接受。(5)其他支撑数据:分组法中,如筛选到的相似物质数量越多,得到的趋势越显著,评估的完整性越高。单节点的评估中,一些分子相关效应有利于增加可信度,如分子表现出亲电子,则皮肤致敏和致突变的概率将增加。有些缺失的相关信息,可尝试采用(Q)SAR模型预测,如Toxtree, OECD toolbox等。目前,交叉参照应用的限制因素主要包括科学上的限制和实际情况的影响。科学上的限制主要是指:(1)相似程度无法量化,只能主观描述;(2)作用机制相似性无法获得。实际情况的影响主要包括:(1)类似物的数据质量不受控制;(2)目标物质和类似物的物质表征无法比较。因此,交叉参照假说的建立可能存在不确定性,这往往取决于论据的充分性和可靠性,如试验数据的质量是否足够可靠,相似性假说建立是否合理,证据权衡结果是否明确等综合因素考虑。
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  T17.40 Read across introduction and global applicationp

  Summer SHEN;Nicholas BALL;Rene HUNZIKER;Edward CARNEY;Darrell BOVERHOF

  2013, 27(S1): 323-324.

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  Chinese regulations currently have a heavy reliance on animal testing data, which can be time and animal consuming, resource intensive and expensive to generate. For China new chemical registration, data from predictive approaches such as QSAR and read across are usually not accepted unless the standard study could not be conducted because of technical issues. As a consequence, it takes long time to assess new chemicals hazards and potential risks. This affects the competitiveness of companies both in and outside of China. With the potential introduction of new legislation in China, particularly one that is similar to EU REACH in terms of the data requirements, it will be necessary to consider how to assess hazards and risks of existing and new chemicals without relying solely on extensive animal testing programs. One solution is accepting the use of read across to more effectively utilize available data. Read across is an approach for predicting endpoint information for one substance based on data from structurally or mechanistically related substance(s). The reliability of read-across depends on the quality of the measured data and the appropriate selection of the characteristics and measures of similarity on structure, mode of action, toxicokinetics or metabolism. Read across can be applied to predict a range of properties, such as physical-chemical properties, environmental fate, human health effects and ecotoxicity. If done in a scientifically robust way, read across can avoid unnecessary testing, reducing animal use as well as costs and time typically associated with preparing a toxicological dataset. However, at the same time it still allows a robust characterization of hazards and therefore can provide the same high level of protection for people and the environment. The use of read across is well established in many other geographic regions, and comprehensive technical guides exist, for example the OECD and ECHA technical guidelines, which will help ensure the harmonized application and assessment of read across. Read across can be used to screen for potential hazards, to supplement other forms of data, or to give a basis for definitive decision in the absence of substance specific data. Read across techniques are accepted as a valid approach for regulatory purposes such as the OECD and the US EPA high production volume chemical screening programs and the EU REACH regulation. Within REACH, read across plays a pivotal role, with up to approximately 30% of the registrations before 2011 including read-across arguments. We believe that there is an opportunity for integrating read across approaches in the China regulatory framework. Examples of how read across has been successfully applied under various programs will be elaborated.
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  T17.41 Development of alternative in vitro methods to screen for pulmonary toxicitiescharacterization of epithelial-macrophage co-cultures at the air-liquid Interface

  Sheung P. NG;David B. WARHEIT

  2013, 27(S1): 324-325.

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  The successful development of in vitro assays with cultured pulmonary cells and aerosols is instrumental for creating toxicity/screening tests for use during product development. To optimize for future in vitro aerosol exposures using the Nano-Aerosol Chamber for In Vitro Toxicology (NACIVT) system, rat lung epithelial L2 cells and NR8383 macrophages (MØ) were co-cultured on an ALI system and cell metabolism (XTT), cytotoxicity (LDH), and cytokine (IL-6) release assays were developed as endpoints to assess cell toxic effects following particle exposures. Co-cultures were exposed to 0-80 μg·cm^-2 ZnO fine particles in supplemented growth medium for 2 h followed by 24- or 48-h maintenance of cultures at ALI. Evaluation of the system for optimization purposes was performed with 2 cell seeding densities (0.25 or 0.5E5/cm²) and with 3 epithelial cell to M ratios (1:1, 2:1, 5:1). Results showed that XTT and LDH assays performed with cells exposed at the ALI were able to detect toxicity in a dose-response manner and that both seeding density and ratio play a role in the assay sensitivity. Co-cultures of L2 with primary M recovered from rat BAL fluids following ZnO exposure in vitro had similar % change in XTT activity and LDH release (vs. controls) when compared to co-cultures with immortalized NR8383, suggesting that NR8383 is a biologically relevant substitute for animal-derived M. In addition, cells co-cultured on ALI and processed in unhumidified air at r.t. for 1-2 h had 53%-74% XTT activity of their humidified counterparts maintained in 5%CO₂ at 37℃;activities recovered to 87%-98% in 24 h, thus providing information on baseline survival and recovery rates for future in vitro experiments. In a separate study, cytokine release assays performed at the optimized co-cultures showed stimulation (200%-300% of medium-exposed controls) and suppression (0%-50% of controls) of IL-6 release following relatively low-dose (2.5 μg·cm^-2) and high-dose (>10 μg·cm^-2) ZnO exposures. In conclusion, these studies are useful in characterizing and optimizing the co-culture and in vitro assay conditions with ALI which could better simulate in vivo exposure of lung cells to inhaled materials (when compared to a submerged exposure system) and ultimately should facilitate the development of reliable in vitro cell exposure systems and cell-based lung toxicity/screening tests.
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  T17.42 The usefulness of the validated SkinEthicTM RHE test method to identify skin corrosive UN GHS subcategories

  Nathalie ALÉPÉE;Robert CLÉMENT;Toriner CARINE;J COTOVIO

  2013, 27(S1): 325-326.

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  Skin corrosion is defined as the production of irreversible tissue damage in the skin following the application of a test substance (OECD, 2002). According to current regulatory requirements, assessment of skin corrosion is mandatory for all chemicals placed on the market (EC, 2006). The SkinEthic^TM Reconstructed Human Epidermis (RHE) test method has been formally validated by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) for distinguishing between corrosive and non-corrosive chemicals (ESAC, 2006). In particular, the SkinEthic^TM RhE in vitro test method was shown to meet the performance and reproducibility standards as defined in the OECD TG 431, and can therefore be used for routine regulatory skin corrosion testing. A modification in classification criteria from the EU Dangerous Substances Directive (EU DSD) to the EU Classification, Labelling and Packaging Regulation (EU CLP), had consequences on the regulatory applicability of the SkinEthic^TM RHE test method for skin corrosion testing. The EU CLP classification system is based on the United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (UN GHS), and requires subcategorising of corrosive chemicals into the three UN GHS optional subcategories (Skin Corrosion Categories 1A, 1B and 1C). Since the SkinEthic^TM RHE method was originally validated to discriminate corrosives from non-corrosives, the present study was undertaken to investigate its usefulness to discriminate skin corrosive GHS subcategory 1A from GHS subcategory 1B-and-1C in addition to its capacity to discriminate corrosives versus non-corrosives. The SkinEthic^TM Reconstructed Human Epidermis (RHE) model consists in fully differentiated three-dimensional epidermal tissue grown from normal human keratinocytes in a chemically defined medium at the air liquid interface. The model is histologically similar to in vivo human epidermis, and features a functional permeability barrier, which is one of the main functions of viable skin. The 84 tested substances represented 38 non-corrosives, 31 UN GHS subcategory 1B-1C corrosives, 12 UN GHS subcategory 1A corrosives, and 3 corrosives (the in vivo data do not allow sub-categorisation). The cell viability was measured using the MTT reduction assay, which is based on the dehydrogenase activity of living cells (Mosmann, 1983). For each exposure time of all test conditions (3 min and 60±5 min), 3 RHE tissue samples were used per control or per chemical. All chemicals were tested in three independent runs. Negative and positive controls were evaluated concurrently with the chemicals. Two prediction models (PM) were assessed, representing a pre-defined validated prediction model (PM-A) and an alternative one defined post-hoc (PM-B). The results obtained with both PM were reproducible, as shown by the 92.9% concordance of classification between runs for discriminating corrosives versus non-corrosives, and the 85% concordance for discriminating the GHS subcategories versus non-corrosives. Moreover results confirmed a high sensitivity of the SkinEthic^TM RHE method to predict corrosives (94.9%) and good specificity (73.7%) independent of the PM applied. Regarding the identification of UN GHS corrosive subcategories, PM-A resulted in 86.1% correct classifications of the GHS subcategory 1A. When using the PM-B, the identification of GHS subcategory 1B-and-1C substances improved, with 63.4% correct sub-categorisation. If considering the 30 reference chemicals as recommended in the recently revised OECD TG 431 (2013), PM-A and PM-B achieved 78.9% and 83.3% accuracy respectively for the identification of GHS subcategories and non-corrosives. They correctly predicted 90% of GHS subcategory 1A and 80% of GHS non-corrosive substances independent of the PM used. In conclusion, the SkinEthic^TM RHE test method is highly reproducible and sensitive for discriminating corrosive from non-corrosive substances. Furthermore, it allows reliable identification of skin corrosive GHS subcategory 1B-and-1C substances using the PM-A and PM-B, and of GHS subcategories 1A using the PM-B. Due to its high sensitivity, the test method provides high safety standards for skin corrosion testing.
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  T18.4 阿特拉津毒性的大鼠尿液代谢组学

  张旸;张晓峰;赵伟;赵悦

  2013, 27(S1): 335-336.

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  目的 探讨阿特拉津亚慢性毒作用特征,筛选早期、灵敏的生物标志物,为评价阿特拉津长期低剂量暴露对机体的影响提供理论依据。方法 清洁级Wistar未成年大鼠采用喂饲法给大鼠染毒阿特拉津1/20LD₅₀, 1/50LD₅₀和1/125LD₅₀,连续24周,在染毒第4周、8周、12周、16周、20周和24周时,分批剖杀大鼠,采集大鼠血液、尿液和主要脏器,观察组织病理学变化,应用超高效液相色谱-飞行时间质谱技术分析大鼠尿液,筛选大鼠尿样中阿特拉津毒性作用的生物标志物。结果 随染毒时间延长,大鼠体重逐渐增加,但相同时间点染毒组大鼠体重与对照组比有明显降低(P<0.05),呈剂量-反应关系。病理组织学可见阿特拉津高剂量组大鼠肝脏嗜酸性坏死及细胞间隙增大,肾脏空泡变合并中性粒细胞浸润,子宫肌层细胞极性紊乱、核固缩坏死等。尿液代谢组学分析表明阿特拉津染毒第4周开始大鼠代谢轨迹出现分离,随着染毒时间延长,分离趋势愈加明显。在正、负离子模式下共筛选出9种可能的生物标志物,即正离子模式下的阿特拉津、去异丙基阿特拉津、羟基化阿特拉津、谷氨酰甘氨酸、脱乙基阿特拉津、脱异丙基乙基阿特拉津、脱异丙基羟基化阿特拉津,负离子模式下的雌酮葡萄糖醛酸和黄嘌呤。脱异丙基羟基化阿特拉津(DIHYA)是阿特拉津代谢产物之一,随染毒剂量增加其含量呈明显升高趋势。谷氨酰甘氨酸是由谷氨酸和甘氨酸脱水缩合而成,谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位,甘氨酸是通过葡萄糖转化而来。黄嘌呤是嘌呤代谢产物,在黄嘌呤氧化酶作用下可生成尿酸。染毒大鼠尿液中谷氨酰甘氨酸和黄嘌呤含量变化可能导致鼠体内蛋白质、糖和嘌呤代谢异常。结论 DIHYA是阿特拉津在尿液中的代谢产物,可作为评价阿特拉津暴露的敏感、早期生物标志物,为评价阿特拉津毒性和制定防治措施提供科学依据。
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  T17.43 Assessment of test substances using in vitro EpiSkin skin irritation test method by HPLC and colorimetry

  Nathalie ALÉPÉE;Béatrice MICHEAU;Marie Hélène GRANDIDIER;Sébastien GRÉGOIRE;JoséCOTOVIO

  2013, 27(S1): 326-327.

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  Dermal irritation is the production of reversible damage to the skin following application of a test substance for up to 4 hours (OECD, 2002). Skin irritation is assessed by applying the test substances in a single dose to the skin. Prevalidation and validation studies have been reported that in vitro tests employing reconstructed human epidermis models are able to reliably discriminate between irritants and non-irritants according to EU classification system. Following the ECVAM Skin Irritation Validation Study (SIVS), the Episkin test method provided sufficient intra and inter-laboratory reproducibility and showed sufficient sensitivity and specificity for a standalone method to fully replace the in vivo skin irritation test in rabbits. The EpiSkin^TM model, commercially available at www.skinethic.com, is a fully differentiated three-dimensional skin model comprising a reconstructed epidermis with a functional stratum corneum. The model is obtained by culturing adult non-transformed human keratinocytes on a collagen substrate in conditions which permit their terminal differentiation and the reconstruction of an epidermis with a functional horny layer. The principle of the in vitro skin irritation test method is based on the premise that irritant substances are able to penetrate the stratum corneum and are cytotoxic to the cells in the underlying layers. The skin irritation potential of a test substance is typically determined by measuring cell viability in treated tissues by means of the colorimetric MTT. MTT is a water soluble tetrazolium salt yielding a yellowish solution when prepared in media solutions. Dissolved MTT is converted to an insoluble purple formazan by cleavage of the tetrazolium ring by dehydrogenase enzymes. This water insoluble formazan can be solubilised using isopropanol and the dissolved material is measured spectrophotometrically yielding absorbance as a function of concentration of converted dye. In the EpiSkin validated skin irritation test method, tetrazolium salt-based formazan assay is performed by using acidific isopropanol extraction conditions (ESAC 2007, OECD TG439 2010). The test substance is considered to be irritating, if the tissue viability is less or equal (≤) to 50%. The current work evaluated the data obtained with the EpiSkin model for the 20 reference chemicals (listed in the OECD TG439 that comprises 10 irritants and 10 non-irritants, 4 solids/16 liquids) following formazan extraction with acidified (IPA) or non acidified (IP) isopropanol solutions to evaluate the influence of acidic extraction conditions. Therefore the objectives of this work was to establish the use of HPLC measurements as a complementary assay to standard photometry assay for detection of reduced MTT, a known limitation for test substances that are highly coloured. At least 2 independent experiments were performed for each test condition. The cell viability in EpiSkin quantitatively measured after acidified (IPA) or non acidified (IP) isopropanol extractions from tissues were equivalent ranging from 6.4 to 104% by colorimetry (reference method). Following HPLC measurement, formazan quantitative analyses were comprised between 7.9 to 99.2%. The standard deviation between those 2 conditions was +/- 18%. Therefore, within-laboratory variability assessed in 3 runs showed similar concordance of classification for each condition. The sensitivity (based on 10 GHS Cat.2 substances) was 90% and the specificity (based on 10 No-category substances) was 70%. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) provides data comparable to those using standard photometry assay for the 20 reference OECD substances in EpiSkin^TM skin irritation model (validated test method) and in EpiSkin^TM isopropanol extracts. The nature of the solvent used for formazan extraction seems to have no influence using those 20 OECD reference substances. HPLC might be considered as an alternate detection system to the standard photometry detection system. Therefore, those results suggest that acidific isopropanol extraction conditions did not affect the EpiSkin skin irritation outcomes.
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  T17.44 OECD Test Guideline 431：Subcategorisation of skin corrosive chemicals by the EpiSkin^TM reconstructed human epidermis skin corrosion test method

  Nathalie ALÉPÉE;Marie Hélène GRANDIDIER;JoséCOTOVIO

  2013, 27(S1): 327-328.

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  The United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (UN GHS) defines skin corrosion as the production of irreversible damage to the skin following the application of a test substance (UN, 2011). The potential for chemicals to cause skin corrosion is an important consideration in establishing procedures for the safe handling, packing and transport of chemicals (UN, 2001). The assessment of the skin corrosion potential is therefore mandatory in international regulatory requirements for all chemicals to be placed on the market. For humane and ethical reasons, a large focus was given to the development of alternative in vitro test method as replacements to the evaluation of the skin corrosion potential of chemicals in the traditional in vivo Draize acute dermal irritation/corrosion test method, described in OECD Test Guideline (TG) 404 (OECD, 2002). Several of these in vitro assays for skin corrosion further underwent validation studies (ECVAM SCVS) . The EpiSkin^TM skin corrosion test method was formally validated and adopted within the context of OECD TG 431 for identifying corrosive and non-corrosive chemicals. The EU Classification, Labelling and Packaging Regulation (EU CLP) system requires the sub-categorisation of corrosive chemicals into the three UN GHS optional subcategories 1A, 1B and 1C. The present study was undertaken to investigate the usefulness of the validated EpiSkin^TM test method to identify skin corrosive UN GHS Categories 1A, 1B and 1C using the original and validated prediction model and adapted controls for direct MTT reduction. The EpiSkin^TM model is a fully differentiated three-dimensional skin model comprising a reconstructed epidermis with a functional stratum corneum. The model is obtained by culturing adult non-transformed human keratinocytes on a collagen substrate in conditions which permit their terminal differentiation and the reconstruction of an epidermis with a functional horny layer. In total, 85 (27 solids, 57 liquids and 1 viscous material) chemicals selected by the OECD expert group on skin corrosion were tested in three independent runs. These comprise 12 Category 1A, 3 Category 1, 19 Category 1B/1C, 9 Category 1B, 3 Category 1C and 39 non-corrosives. The cell viabilities and predicted classifications obtained for the 85 chemicals tested with EpiSkinTM at L'Oréal were analysed. A comparison with the predicted classifications for the 55 chemicals tested in the ECVAM SCVS for the three laboratories that participated in that validation study was also performed. When the new data acquired by L'Oréal were compared with the ECVAM SCVS data acquired almost 15 years ago, 100% concordance of classifications between at least three laboratories, with L'Oréal being one of the three, was obtained for 87.3% of the 55 ECVAM SCVS chemicals included in this study, when the method was used to subcategorise corrosive chemicals into 2 classes. It can therefore be concluded that the EpiSkin^TM test method produces reproducible cell viability values over a very long period of several years, which can be used to reliably classify chemicals into the different UN GHS skin corrosion subcategories based on the prediction model. Moreover the results obtained showed that the EpiSkin^TM test method is highly sensitive (99%) and specific (80%) in discriminating corrosive from non-corrosive chemicals and allows reliable and relevant identification of the different skin corrosive UN GHS subcategories, with high accuracies being obtained for both UN GHS Categories 1A (83%) and 1B/1C (76%) chemicals. The overall accuracy of the test method to subcategorise corrosive chemicals into three or two UN GHS subcategories ranged from 75% to 79%. Considering those results, the revised OECD Test Guideline 431 permit the use of EpiSkin^TM for subcategorising corrosive chemicals into at least two classes (Category 1A and Category 1B/1C), and probably even to allow its use for identifying all three UN GHS skin corrosion subcategories.
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  T17.45 Characterization of metabolizing enzymes in human skin and reconstructed human skin models from SkinEthic^TM

  J EILSTEIN;G LÉREAUX;J COTOVIO;A GARRIGUES-MAZERT;D DUCHÉ

  2013, 27(S1): 328-329.

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  Skin is the largest organ of the body and its function is not limited to a physical barrier. According to the total skin surface area (about 2 square meters, 15% of the body weight) it can be also considered as one of the main extra-hepatic metabolism organs for endogenous compounds and xenobiotics. Thus, the research on skin metabolism would require a real scientific effort and dynamism to characterize skin metabolizing enzymes and their activities. The limited and variable availability of fresh normal human skin (hereafter referred to as NHS) has resulted in the development of sophisticated biological tools such as reconstructed human skin models (hereafter referred to as skin models), such as those from SkinEthicTM laboratories. As well new European policy banning the use of animal testing (7th European amendment to the cosmetic directive) has led the cosmetics industry to focus on in vitro alternative methods to animal experimentation increasing the need of skin models. L'Oreal uses these skin models daily to develop new cosmetic ingredients. Consequently, assessing and comparing some of these skin models (Episkin^TM, SkinEthic RHE^TM and the full thickness model of SkinEthic^TM) with NHS in terms of metabolic equipment and capability was essential in order to be confident in their use. We developed an approach to characterize the skin metabolic capabilities build on two steps. At first, the gene expression study by RT-PCR to assure the presence of the main enzymes mRNA. However, the presence of mRNA material is not necessarily proof that the protein is present and/or catalytically active. Consequently, the second step was the metabolizing enzymes activities characterization using specific substrates. This work shows the presence of the main cutaneous isoforms of cytochromes P450 (CYP, 1A1/1B1, 2B6/2C18/2E1, 3A5/3A7A1 and 9A1), esterase (AADAC, CEL, ESD, CES1/2 and PLA2G4B), alcohol dehydrogenase (ADH, 1B, 7), aldehyde dehydrogenase (ALDH, 1A family, 2, 3A/3B family, 4A1, 5A1, 6A1, 7A1), peroxydase (GPx, 1, 2, 3, and 4;PTGS1 and PTGS2), glutathione-S-transferase (GST, A, M, P, T), N-acetyl transferase(NAT1 and NAT5), uridinyl diphosphate glucuronyl transferase (UDPGT, 1A family) and sulfotransferase (SULT, 1A1, 1E1 and 2B1). Excepted for CYP450, their apparent catalytic parameters such as apparent maximal velocity (V_max expressed as pmol/mg protein/min), apparent affinity (K_m expressed as μmol·L^-1) and the apparent V_max/K_m ratio which gives an estimation of the skin intrinsic metabolic clearance (expressed as μl·mg^-1 protein/min) were measured. Mean activities indicative of CYP 1A1/1B1 (expressed as pmol·mg^-1 protein/6 h) for SkinEthic RHE (2.8) and FTM (2.6) were very similar to NHS (3.0) whilst Episkin showed a slightly higher activity (7.8). Mean activities of CYP 3A5/3A7 for FTM (3.5) and Episkin (4.1) were similar to NHS (3.8) whilst activity in SkinEthic RHE (13.3) was somewhat higher. CYP 2B6/2C18/2E1 activity was below 0.5 pmol·mg^-1 protein/min in all models and NHS. Comparable intrinsic metabolic clearances were measured between NHS and skin models for esterase (-1.6 except for the full thickness model with 3.8), ADH (-0.2), ALDH (-1), peroxydase (-1.9 except for Episkin with 0.7), GST (-1.3), NAT1 (-1.0) and UDPGT (-1.1 except for SkinEthic RHETM with 0.4) activities. SULT1A1 activity towards probe substrates was not detected in skin models and observed at the LOD in NHS. Weak CYP450 and high esterase/peroxydase activities, an aldehyde dehydrogenase activity higher than an alcohol deshydrogenase activity and transferase activities suggested that NHS and skin models exhibited limited functionalization capacity and much greater detoxification (hydrolytic and conjugating) capacity. These results demonstrate that skin models are equivalent or very similar to NHS in terms of metabolic functionality towards xenobiotics and useful tools to assess the local efficiency and safety of cosmetic ingredients.
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  T18.8 大鼠正己烷染毒后组织中2,5-己二酮和吡咯加合物的相关性

  尹洪银;郭盈;曾涛;赵秀兰;谢克勤

  2013, 27(S1): 338-338.

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  目的 吡咯加合物的形成可能与正己烷导致的神经损伤相关,吡咯加合物的内剂量可能会对研究正己烷的神经毒性有一定的帮助。本实验研究的目的是研究2,5-己二酮和吡咯加合物在组织中的分布以及他们之间的相关性。方法 雄性Wistar大鼠以500,1000, 2000, 4000 mg·kg^-1的正己烷经口灌胃染毒连续5 d,末次染毒24 h后处死,用气相色谱法和埃利希试剂测定组织中的2,5-己二酮和吡咯加合物的含量,用线性回归分析2,5-己二酮和吡咯加合物的相关性。组织中的2,5-己二酮和吡咯加合物的含量。结果 组织中的2,5-己二酮和吡咯加合物的含量与正己烷的暴露剂量具有剂量-效应关系,2,5-己二酮在尿中含量最高,坐骨神经中含量最低,但是吡咯加合物在肝脏中含量最高,血清中最低。在统一组织中游离2,5-己二酮、总2,5-己二酮和吡咯加合物具有明显的相关性,血清中吡咯加合物与组织中的2,5-己二酮、吡咯加合物的相关性最好。结论 血清中的吡咯加合物可能是反应组织中2,5-己二酮和吡咯加合物内剂量的最好指标。
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  T17.46 In vitro comet and micronucleus assays using reconstructed tissues

  G OUÉDRAOGO;F NESSLANY;S SIMAR;S TALAHARI;D LAGACHE;E VERCAUTEREN;L NAKAB;A MAYIYX;G MASSIN;N FLAMAND

  2013, 27(S1): 329-330.

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  The European Cosmetics regulation prevents the use of animal tests for evaluating cosmetics. To address the need for properly evaluating cosmetic ingredients, some "alternative" methods have been validated (skin irritation for example) and others are being developed. Most of the non animal assays are used not as standalone but in integrated testing strategies. In the area of genetic toxicity, several in vitro assays are available. However, it has been shown that these assays used in isolation or in combination show poor predictive performances compared to in vivo results. In the current regulatory context, it is important to find approaches that are predictive of in vivo situations. To address specifically the cutaneous route, genetic toxicity assays using reconstructed skin were developed. These models have several interesting features: -The biological barrier (also we now know that it is not as much efficient as that of normal human skin). -The metabolic capability: it has been shown that most of the enzyme present in human skin are also retrieved in these tissue and the also display activities more or less similar to that of normal skin. -The ability to test different types of molecules: liquids, solids, gels. In the current work, the tissues were used in a co-culture system. Human lymphoblastod cells (TK6) were cultured beneath the tissues. The tissues are made of keratinocytes sitting on a collagen matrix. It was previously checked that the medium used was compatible with both biological models. Different incubation procedures were investigated for the comet assay as well as for the micronucleus assay in order to find the more suitable ones. For the comet assay, optimal conditions were tested for dissociating the tissues. This is important because the tissue dissociation procedure when not performed appropriately may yield DNA damage that can bias the issue of the assay. The purpose of this project was to investigate the added value of this co-culture system compared to the existing ones. Combining the comet assay and the micronucleus assay in one experiment gives the possibility to cover different genotoxic mechanisms at ounce: -With the comet assay, DNA damage can be evidenced. As they are early modifications, they cover both gene mutation and chromosome damage. These insults can be reversible. In addition, the protocol can be modified in order to investigate the type of DNA damage induced by the test agent. -The micronucleus assay allows the detection of chromosome damage. Therefore, this co-culture system covers gene mutation and chromosome damage, the two mechanisms that batteries of genetic toxicity assays usually cover. The project was led stepwise in two different laboratories. The purpose was to bring some information on exposure in in vitro genotoxicity assays for dermally applied compounds. Previous results had shown that this method was reproducible and could be transferred to other laboratories. The system has now evolved to combine both the comet assay and the micronucleus assay. The approach is based on performing the comet assay in cells dissociated from the tissues, while the micronucleus assay was performed using the cells cultured beneath the reconstructed tissues. Four different time schedules were considered for this project: a 4 h treatment and a 27 h treatment period with or with an extra 27 h recovery period. A set of chemicals were tested with this approach. The results obtained show that the best prediction model was the long treatment period (27 h) without recovery for both the comet assay and the micronucleus assay. Most of the "irrelevant positives" yielded negative in vitro results using this system. Other research initiatives are exploring the value of genetic toxicity assays using reconstructed tissues.
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  T17.47 Developing classification and quantitative models of toxicity using ToxCast high throughput screening and ToxRefDB animal toxiciology data

  Lisa TRUONG;Glady OUEDRAOGO;Matt MARTIN

  2013, 27(S1): 330-331.

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  The paradigm for toxicity testing in the 21st century is moving away from high-dose, gross phenotypic responses in high cost, and low throughput mammalian models to conducting toxicity testing at relevant human doses and to identify early molecular response pathways that are perturbed to produce toxicity. This focus shift will provide the opportunity to gain insight into toxic mechanisms instead of just characterizing traditional endpoints. To address the challenge and help prioritize chemicals for further testing, the US Environmental Protection Agency National Center for Computational Toxicology (NCCT) developed the ToxCast program in 2007 to assess over 1000 chemicals that are broadly characterized with various amounts of in vivo data in a diverse set of in vitro high throughput screening (HTS) assays (>700). The EPA ToxCast project is analyzing data generated on thousands of chemicals across rapid, automated HTS assays with human gene and protein targets including those which may play a role in systemic toxicity. Phase 1 of the ToxCast program consist of -300 chemicals which is mainly pesticides with existing toxicity profiles, and Phase 2 is ongoing with -700 chemicals from a broad source of industrial and consumer products, food additives, "green" products, cosmetic related chemicals, and failed pharmaceutical drugs. With the vast amount of HTS data generated from the ToxCast project, EPA-NCCT is developing predictive models to understand a large number of toxicity endpoints (ie: reproductive, and developmental toxicity). The HTS data is generated from over 8 vendors, and assaying numerous genes/pathways. Since there is overlap from the vendors evaluating the same genes/pathways, criteria for identifying a chemical as being an active was set per model. In most cases for a chemical to be considered an active using the HTS data, it must be considered a‘hit’based on statistics for an individual assay, and a‘hit’for more than 2 assays. Currently these predictive models are built using HTS data and the Toxicity Reference Database (ToxRefDB). ToxRefDB is a repository of over 5000 legacy animal studies on -1000 chemicals, and captures the animal studies using a standardized, multilayered effect vocabulary across various study types and species. The structure of ToxRefDB provides the ability to focus on specific study types, species and effect endpoints. To build these models, the actives identified from the ToxCast data is compared to specified studies (dependent on the toxicity endpoint) in ToxRefDB to calculate balance accuracy and determine predictability of the model. Within NCCT, several models have been developed to help support chemical risk management. These models include ToxPi, rat liver cancer, reproductive and developmental toxicity. To build the reproductive classification model, chemicals from the ToxCast Phase 1 chemicals library with high quality reproductive toxicity data in ToxRefDB and sufficient in vitro bioactivity were selected. This was a subset of 256 chemicals. Reproductive toxicants were defined having a lowest observed adverse effect level of less than 500 mg·kg^-1·d^-1. Eight six chemicals were categorized as reproductive toxicants in the rat, and only 68 had sufficient in vitro bioactivity data. Assay-gene combinations from Toxcast assay results were filtered and evaluated statistically using univariate analysis to identify reproductive toxicants. By using linear discriminant analysis, and fivefold cross-validation, a robust and predictive model was produced that identified rodent reproductive toxicants with 77% and 74% training and test cross-validation balanced accuracies, respectively. A 21-chemical external validation set was used to validate the model, and found it to have 76% accuracy. With this level of accuracy, it provides confidence the potential of the model to prioritize the many environmental chemicals with little or no hazard information available. As the HTS data is available for PhaseⅡ of Toxcast, the predictive model of reproductive toxicity will be forward-validated and expanded to improve the overall model and performance. Herein, we provided an example of a successfully developed model for a specific toxicity endpoint utilizing in vitro high throughput ToxCast and ToxRefDB data. This process will help inform development of future predictive models for more complex toxicity and identify potential hazardous chemicals for further testing. This abstract does not necessarily represent EPA policy.
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  T17.48 Skin sensitization using the refined myeloid U937 skin sensitization test

  Cécile PIROIRD;Fabien IBANEZ;Julien FAUGERE;Charles GOMES;Silvia MARTINOZZI-TEISSIER;Nathalie ALÉPÉE

  2013, 27(S1): 331-331.

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  OBJECTIVE The aim of this study was to refine the prediction model to only give a binary Sensitizer(S)/Non-Sensitizer(NS) call without impacting the predictive capacities of the MUSST. METHODS In the present Myeloid U937 Skin Sensitization Test (MUSST) test method, co-stimulatory molecule CD86 as a marker of cell activation is measured. In parallel, cell viability is assessed using propidium iodide exclusion. Both parameters are measured by flow cytometry. 208 substances with LLNA data were analyzed. MUSST results on this set gave 92 S, 56 NS predictions and 60 Inconclusive(INC). Statistical methods based on a stacking scoring method were applied on raw data of these 60 INC in order to find additional rules to classify these substances into S or NS. RESULTS A combination of 6 rules was identified, that allows to classify the INC into the 2 classes "sensitizers and non-sensitizers". Application of the rules to the 48 ECVAM dataset submitted in 2009 show an overall accuracy of 92% with a sensitivity of 96% and a specificity of 86%. The predictive performances of the MUSST on the 208 substances with the optimized prediction model composed of the original prediction model and the additional 6 rules-based model show 84% concordance, 87% sensitivity and 79% specificity against LLNA data. No false negative are observed among the extreme and strong sensitizers. CONCLUSION The prediction model of the MUSST classifies the substances as S or NS. However, it would be inappropriate to consider the MUSST assay as a stand-alone method for skin hazard characterization (CLP classification). The MUSST test method is modeling the dendritic cell activation. Such dendritic activation information is foreseen to play an important role in a future integrated approach for both hazard characterization and potency.
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  T17.49 Toxicogenomic analysis of human epidermis models for the development of quantitative tests for skin sensitization and irritation

  H GROUX

  2013, 27(S1): 332-332.

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  In the context of the growing pressure from national regulatory authorities to ban products tested on animal models, the ability to identify and classify the skin sensitization and irritation potential of chemicals without animals is of high importance for the cosmetic industry. A range of different in vitro chemistry-based (DPRA, GSH reactivity) and cell-based methods (MUSST, hCLAT, Keratinosens) have been developed and are currently under evaluation for their applicability to cosmetic ingredients and their physicochemical diversity. Although some of these assays appear to be interesting for hazard identification, potency assessment is still limited. Possible limitations may be linked to the metabolism that may differ between the models and native skin, to the bioavailability, which is not considered in monolayer cultures, and to the danger signal that may be different in monolayers as compared to a natural tridimensional microenvironment. We therefore developed an assay using 3D reconstituted human epidermis models. To identify biomarkers and chemical genomic signature that are quantitatively associated with the acquisition of skin sensitization we first analyzed the response of mouse skin challenged with several sensitizers or irritants used as controls. We then confirmed that these biomarkers were also expressed specifically in human epidermis collected by suction blisters after challenge with Nickel or Fragrance Mix (used as sensitizers) or Sodium Lauryl Sulfate (used as irritant control). These chemical genomic signatures were further refined using a 3D reconstituted human epidermis model (EpiSkin^TM) up to the development of a non-animal method for accurate assessment of skin sensitization potency of contact allergens : the SENS-IS^® assay. Data using the SENS-IS^® assay for the assessment of skin sensitization will be presented. We analyzed skin sensitization potency not only on chemicals that directly binds to protein but also on contact allergens that must be activated by air oxidation, or within the skin, to acquire the chemical reactivity necessary to bind to proteins. The use of reconstituted human epidermis also permits the analysis of complex mixtures and final products. Data generated on complex natural products, mixtures and final products and the interpretation of the resulting complex genomic signature will also be discussed. Regarding skin irritation, several test methods were validated by ECVAM as stand alone replacement tests for the prediction of acute skin irritation according to both former and recent implemented Globally Harmonization System (GHS) classifications applied in Europe. These tests allow discrimination between irritants (category 2 or R38) and no category (No Label) substances, Nevertheless, a more precise quantification of the skin irritation potential is of high importance not only for transport labeling and occupational health but also for the toxicological risk evaluation. We therefore developed a new assay based on the quantitative analysis of specific biomarkers expressed in 3D reconstructed epidermis (EpiSkin^TM) : IRR-IS^®. The assay provides a tool to predict irritancy potency (mild-irritants and irritants according to the UN-GHS) and to support risk assessment approach as well as keys to better address potency assessment. The selection of a set of biomarkers was done by analysis expression profiles in 3D reconstructed epidermis with several reference irritants. Test chemicals were topically applied neat for short-time and washed, then the tissues are further incubated for 6 h. Gene expression was determined by quantitative PCR. We selected 25 biomarkers and developed specific Index Irritation(Ⅱ) algorithms based on analysis of gene expression magnitude. Predictive capacities of the IRR-IS assay were evaluated on a reference set of 45 coded irritant chemicals from the public domain according to the former European Union Dangerous Substances Directive (EU DSD), the new UN-GHS in EU Classification, Labeling and Packaging (CLP) systems categories and the UN GHS (containing a moderate irritant class: category 3).
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  T18.7 循环miRNA作为4-甲基亚硝胺基-1(3-吡啶基)-1-丁酮诱导肺癌发生潜在标志物

  吴建军;黄锦坤;杨倜;李勋;杨巧媛;刘蓉;李远奇;杨成峰;蒋义国

  2013, 27(S1): 337-338.

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  目的 鉴定可作为环境化学物4-甲基亚硝胺基-1(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)诱导肺癌发生潜在标志物的循环miRNAs。方法 7周龄雄性F344大鼠系统给予烟草特异性致癌物NNK处理(皮下注射,每周3次,连续20周),常规饲养至第95周终止实验。期间大鼠眼眶静脉丛采血分别采集NNK处理第1, 5, 10, 20, 60, 80和95周血液。取第60周大鼠血清进行小分子RNA Solexa测序,分析对照组和NNK处理组大鼠血清miRNA差异表达谱,筛选出8个差异表达miRNA作为候选miRNA。运用荧光定量PCR方法,检测候选miRNA在大鼠个体血清中表达水平。最终选择miR-206和miR-133b进一步检测其在NNK诱导肺癌发生发展不同时期(第1, 5, 10, 20, 60, 80和95周)血清中表达改变。同时,我们检测了miR-206和miR-133b在大鼠肺癌组织、癌旁正常组织及几株肺癌细胞株中表达情况;为了评价miR-206和 miR-133b作为肺癌病人标志物的可能性,我们分别检测了25例吸烟致肺癌病人及25例正常人血清中miR-206和miR-133b的表达水平,受试者工作特征曲线(ROC)分析评价其作为肺癌标志物的潜力。结果 小分子RNA Solexa测序结果表明,NNK可以诱导大鼠血清miRNA表达改变。在NNK诱导肺癌发生早期,与对照组相比,NNK处理组大鼠血清miR-206和miR-133b显著性上调表达;在第20周达高峰,后期其表达水平呈下降趋势。对比癌旁正常肺组织,miR-206和miR-133b在肺癌组织中明显低表达。与正常人支气管上皮细胞16HBE相比,miR-206和miR-133b在多种肺癌细胞中均显著性低表达。与正常人相比,肺癌病人血清miR-206和miR-133b明显低表达,ROC分析表明miR-206和miR-133b曲线下面积分别为0.9024和0.8720。结论 我们的结果表明,烟草特异性致癌物NNK可诱导大鼠血清miRNA表达谱改变;循环miR-206 和 miR-133b可能作为NNK诱导肺癌发生的潜在标志物,并且可能参与肺癌的发生。
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  T20.37 活性氧介导ERK/NF-κB调控miR-21在砷所致肺细胞恶性转化中的作用

  凌敏;李远;徐媛;王守林;李忠;周建伟;王心如;刘起展

  2013, 27(S1): 377-378.

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  目的 探讨活性氧(ROS)介导ERK/NF-κB调控miR-21在砷所致细胞恶性转化中的作用及其分子过程。方法 亚砷酸钠(NaAsO₂)1.0 μmol·L^-1处理人胚肺成纤维(HELF)细胞30代后,用CCK-8检测细胞增殖情况;用软琼脂集落形成实验和迁移实验检测细胞恶性程度和迁移能力;用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测不同恶性程度HELF细胞miR-21水平和ERK,NF-κB(p65),c-Jun蛋白及其磷酸化水平;然后观察转染miR-21 mimics或转染anti-miR-21对低水平NaAsO₂所致不同恶性程度HELF细胞以上指标变化的影响;并用ROS清除剂过氧化氢酶、ERK抑制剂U0126和NF-κB(p65) siRNA及c-Jun siRNA预处理HELF细胞后,再观察低水平NaAsO₂所致HELF细胞以上相关指标的变化。结果 NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1慢性处理可引起HELF细胞增殖加快、软琼脂集落数增加、miR-21水平升高;且随处理时间延长(恶性程度增加)其变化越明显;且NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1急性处理HELF细胞也可引起miR-21水增升高;转染miR-21 mimics可促进NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1处理0, 10和30代HELF细胞增殖加快,而转染anti-miR-21则出现相反效应;转染miR-21 mimics可明显促进NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1慢性处理10和30代HELF细胞的软琼脂形成集落和细胞迁移能力、而对未经NaAsO₂处理的转染HELF细胞却未观察到以上变化;而转染anti-miR-21则引起相反效应;过氧化氢酶可阻滞NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1和H₂O₂ 10 μmol·L^-1所致HELF细胞ROS水平和miR-21表达升高和ERK, NF-κB(p65)及c-Jun激活;ERK抑制剂U0126可阻滞NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1急性处理HELF细胞所致miR-21水平升高和NF-κB(p65)及c-Jun激活;转染NF-κB(p65) siRNA和(或)c-Jun siRNA可抑制NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1所致HELF细胞miR-21水平升高,且共转染即同时关闭c-Jun和NF-κB(p65)时miR-21降低最明显;转染anti-miR-21又可阻滞NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1急性处理HELF细胞ERK持续激活;且NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1慢性处理可引起HELF细胞ERK, NF-κB(p65)和c-Jun激活,且随处理时间延长(恶性程度增加)其变化越明显。结论 低水平NaAsO₂可通过ROS调控ERK后,激活NF-κB(p65)和c-Jun而引起miR-21水平升高,然后又反馈引起ERK持续激活;其在低水平NaAsO₂所致HELF细胞恶性转化过程具有重要作用。关健词: 砷中毒;活性氧;微小RNA;信号通路;核因子-κB;细胞恶性转化
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  T20.51 死亡受体、线粒体及内质网信号通路在黏菌素致小鼠肾毒性的作用

  代重山;张朝明;李继昌;汤树生;肖希龙

  2013, 27(S1): 385-385.

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  目的 探究死亡受体、线粒体及内质网信号通路在黏菌素肾毒性小鼠模型中的作用。方法 雌性小鼠尾静脉注射硫酸黏菌素7.5和15 mg·kg^-1·d^-1,分2次给药(间隔12 h),对照组给予等量的生理盐水,连续给药7 d后,分别测定小鼠肾功能、氧化-抗氧化系统、组织学、线粒体ATP含量、超微结构及功能指标(线粒体酶活性、通透性)变化,免疫组化法及Western blot法分析死亡受体、线粒体及内质网信号通路的标志性蛋白表达。结果 与对照组相比,黏菌素7.5和15 mg·kg^-1·d^-1连续给药7 d后,血清肌酐分别增加了68%(P<0.05)和114%(P<0.05),尿素氮分别增加了84.1%(P<0.01)和108.7%(P<0.01),肾组织内MDA含量均显著升高(P<0.05),CAT及SOD酶活性均显著降低(P<0.05);高剂量组内质网相关蛋白GRP78和GADD153(P<0.05)、胱天蛋白酶12(P<0.05)上调,死亡受体相关蛋白Fas, FasL, FADD表达均显著增加(P<0.05)、胱天蛋白酶8激活体显著增加(P<0.01)、Bid显著降低(P<0.01),线粒体信号通路相关蛋白Bcl-2显著降低(P<0.01)、Bax及CytC表达显著升高(均P<0.01),胱天蛋白酶9及3活性及表达均显著升高(均P<0.01);与之对应的是,高剂量组肾小管大量变性、坏死、管型蛋白结构,半定量评分显著增大(P<0.01);肾小管上皮细胞线粒体肿胀、脊缺失、甚至空泡化,ATP含量显著降低(P<0.01),线粒体酶活性及通透性均发生显著变化(均P<0.01);此外,高剂量组肾组织中p53, p21和NF-κB蛋白均显著升高(均P<0.01),PARP激活体显著增加(P<0.01)。结论 黏菌素致小鼠肾毒性涉及死亡受体、线粒体及内质网信号通路,其中线粒体信号通路介导的氧化应激损伤起主要作用。
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  T18.9 乙醛染毒TK6细胞引起p53等反映DNA损伤的生物标志物变化

  周学贤;Penny JONES;Sarah L COOPER;Paul FOWLER;Paul CARMICHAEL;郝卫东

  2013, 27(S1): 338-339.

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  目的 评价乙醛染毒TK6细胞后,细胞中DNA损伤生物标志物的表达情况,为p53等在DNA损伤蓄积和修复中的干扰作用提供证据支持。方法 乙醛染毒TK6细胞(p53野生型的人类淋巴母细胞)20 min, 2 h和12 h后,采用高通量的流式细胞术检测细胞内肿瘤抑制蛋白total-p53、磷酸化p53(p-p53)以及磷酸化组蛋白(γ-H2AX)的细胞表达比例和细胞表达强度(平均荧光强度)。结果 阳性对照物依托泊苷染毒TK6细胞12 h可以引起三种标志物总p53, p-p53以及p-H2AX的细胞表达比例和表达强度的明显增多(P<0.5)。乙醛染毒TK6细胞12 h后,γ-H2AX的细胞表达水平在15及20 mol·L^-1的浓度显著增高(P<0.5), p-p53的细胞表达比例在0.5~7.5 mol·L^-1浓度范围内呈现剂量依赖的升高趋势。与对照组相比,在2.5, 5, 7.5, 10和20 mol·L^-1的浓度下,p-p53的细胞表达比例显著增加(P<0.5)。总p53的细胞表达比例趋势与p-p53相似,但与对照组相比,未见显著增加。20 min染毒时间的试验结果显示,三种生物标志物未见清晰的变化趋势;2 h作用时间的试验结果显示,在7.5, 15和20 mmol·ml^-1浓度下,total-p53和p-p53的细胞表达比例较对照组显著增加。而γ-H2AX细胞表达水平未见明显改变。结论 乙醛染毒TK6细胞12 h可以诱导p-p53的细胞表达比例增高、γ-H2AX的细胞表达水平增高,以及总p53细胞表达比例轻微升高。乙醛暴露于TK6细胞20 min不足以诱导反映DNA损伤的p53等生物标志物的显著变化。p-p53比γ-H2AX在检测乙醛诱导的DNA损伤方面更加敏感。
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  T18.10 不同途径诱导慢性镉中毒大鼠模型的动态变化

  钟志勇;李光先;黄威;李颖超;郑侠;唐小江

  2013, 27(S1): 339-339.

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  目的 研究慢性镉中毒大鼠模型部分指标的动态变化。方法 将126只SD雌性大鼠随机分为空白对照组,氯化镉灌胃高、低剂量组,氯化镉饮水高、低剂量组,氯化镉腹腔组,于在造模后第40天、80天和120天,分别取7只大鼠检测肾镉和血镉含量。结果 与阴性对照组相比,各染毒组SD大鼠血镉、肾镉水平均显著升高(P<0.05)。氯化镉灌胃高剂量组大鼠血镉含量随着造模时间的延长而逐步升高,肾镉含量随着造模时间的延长未呈现明显的升高趋势。氯化镉饮水低、高剂量组大鼠的血镉含量随着造模时间的延长未呈现明显的升高趋势,肾镉含量随着造模时间的延长有所降低;腹腔注射组大鼠血镉含量随着时间的延长而降低,肾镉含量随着时间的延长而逐步升高。结论 三种途径均能成功诱导出慢性镉中毒大鼠模型。
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  T18.11 吡咯加合物的毒代动力学以及其作为2,5-己二酮亚急性暴露生物监测的可能性

  尹洪银;郭盈;曾涛;赵秀兰;谢克勤

  2013, 27(S1): 339-339.

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  目的 吡咯加合物的形成可能与正己烷导致的外周神经损伤有关,但是目前没有一个合适的正己烷暴露的生物监测指标。本研究的目的是研究吡咯加合物在血清和尿中的变化趋势,以及吡咯加合物与2,5-己二酮的相关性。方法 两组雄性Wistar大鼠分别腹腔注射200, 400 mg·kg^-1 2,5-己二酮一次,两组雄性Wistar大鼠每天分别腹腔注射200,400 mg·kg^-1 2,5-己二酮连续5次,测定染毒后尿和血清中的吡咯加合物与2,5-己二酮含量。结果 血清中吡咯加合物呈现时间蓄积效应,但尿中吡咯加合物,血清中吡咯加合物和2,5-己二酮均不呈现蓄积趋势。血清中吡咯加合物与2,5-己二酮的半衰期分别为25.3±3.34和(2.27±0.28)h。尿中吡咯加合物与血清(r=0.736, P<0.001)、尿(r=0.730, P<0.001)中2,5-己二酮具有明显的相关性,而血清中吡咯加合物与2,5-己二酮的累计染毒剂量有明显的相关性(r=0.965, P<0.001)。结论 结果表明血清和尿中吡咯加合物可能是正己烷或2,5-己二酮适合的生物标志物。
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  T18.12 膜蛋白质组学在毒理学研究中的应用

  黄爱博;洪文旭;许华;刘建军

  2013, 27(S1): 339-340.

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  膜蛋白是细胞膜的重要组成部分,执行着细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号转导和调控,以及能量传递等重要功能。随着蛋白质组学技术的发展,膜蛋白质组学成为毒理蛋白质组学研究的重要组成部分,为在膜蛋白水平阐明毒理机制和建立毒理评估模型提供了新的途径。本文综述了近年来膜蛋白质组学的技术进展以及其在一些毒理学研究中的应用。
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  T18.13 冻干带状疱疹减毒活疫苗大鼠免疫原性

  杨冬华;刘瑛;任雁;韩金乐;孙亮;尤鹏飞;叶祥忠

  2013, 27(S1): 340-340.

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  目的 考察冻干带状疱疹减毒活疫苗大鼠皮下注射给药的免疫原性。方法 试验使用SD大鼠,共设3个剂量组,分别为疫苗稀释液对照组(0PFU/只)、疫苗低剂量组(20000P FU/只)和疫苗高剂量组(40000 PFU/只),每组64只动物,雌雄各半。对大鼠免疫3次,分别在0周、4周、6周进行。在1免2周、1免4周、2周2周、3免2周和3免6周使用间接Elisa法测定IgG抗体;在1免2周、2免2周、3免2周和3免6周测定脾细胞γ干扰素和使用流式细胞仪测定外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞及其比值。结果 带状疱疹减毒活疫苗经皮下多剂给SD大鼠接种,免前各组动物抗体检测结果均为阴性;两疫苗组综合评定:1免2周血清检测到IgG抗体,阳转率为96.9%,抗体均值为441.4;1免4周阳转率为95.8%,血清IgG抗体均值为590.5;2免2周阳转率为100%,血清IgG抗体均值为9007.2,3免2周阳转率100%,抗体水平最高,均值为14845.6;3免6周IgG抗体均值为8482.8,抗体水平下降。免疫可诱导脾淋巴细胞产生γ干扰素,1免2周时检测到γ干扰素,均值208.8 pg·ml^-1,阳转率为15.6%;2免2周的均值为2053.6 pg·ml^-1,阳转率为84.4%,γ干扰素达到最高;3免2周和3免6周γ干扰素水平下降,均值分别为1217.5和491.4 pg·ml^-1,阳转率分别为87.1%和93.5%;3免2周和3免6周检测,未见对大鼠CD4⁺和CD8⁺T细胞百分含量及其比值产生影响。结论 冻干带状疱疹减毒活疫苗具有良好免疫原性,免疫一剂人用剂量即可诱导大鼠产生IgG抗体(阳转率为96.9%)和γ干扰素(阳转率为15.6%),分别发挥体液免疫和细胞免疫作用,两剂后IgG抗体和γ干扰素均有10倍以上的长,免疫3剂后IgG抗体和γ干扰素仍有增长,但增长幅度不大,未对外周血T细胞免疫功能产生影响。
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  T18.14 Time-series pattern of gene expression profile in gentamycin-induced nephrotoxicity

  QIU Yun-liang;HONG Min;LI Hua;TANG Na-ping;Gene CHHSU;MA Jing;DONG Wen-xin;

  2013, 27(S1): 340-341.

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  To investigate the genomic biomarkers or molecular mechanism of nephrotoxicity, more and more studies focus on the gene expression using microarray.However, most of the available data were obtained from a single time points.As gene expression varies with time and disease stage, the time-series pattern of gene expression was considered in the present study.Rats were administrated by Intramuscular injection with 80 mg·kg^-1 gentamycin or saline for 14 consecutive days with 28 days recovery.The sacrifices were performed at different stages of this gentamycin-induced nephrotoxicity model: Day2 (prior to the serum biomarker KIM-1 changed), Day4 (KIM-1 changed significantly, while no findings in microscopic examination), Day8 and Day15 (when there were significant changes both by KIM-1 determination and histological examination), Recovery Day29 (after 28 d recovery).Using the principle component analysis, DEGs identification, herichel cluster, GO biological process and KEGG pathway analysis, we have defined primarily the time-series genes expression in gentamycin-induced nephrotoxicity, the differences among the time points including patterns of whole gene expression, numbers of regulated genes, panels of differential expression gene, and dominate GO term and pathway involved.All this changes were considered correlated closely to the process of the renal failure or the mechanism of gentamycin-induced nephrotoxicity, in the other side of the cion, there were few genes co-regulated at each time point, two for females, eleven for males, indicating it is necessary to consider the gene expression in a time-series aspect, either in the research of biomarker or molecular mechanism or toxicant classification.
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  T19.1 风险评估在化学品管理中的应用

  暨荀鹤

  2013, 27(S1): 341-341.

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  对化学品的风险评估是指对化学物质或混合物在某一特定的暴露方式下,所产生的对人类或者环境产生不利影响的概率进行科学的定性或者定量评价的过程。这一过程需要进行部分或者全部的下列步骤:危害识别,效应评价,暴露评估和风险表征。尽管面临巨大的挑战,风险评估是化学品风险管理的中心。风险评估的结果可以为决策者提供制定风险管理措施提供科学依据。根据风险表征结果,决策者可以对风险进行分类。针对必需或者需要降低风险的部分化学品,进一步分析并确定风险管理措施;在某些情况下,可能还需要进行风险效益分析。然后通过实施风险管理措施使化学品的使用能够得到有效的风险降低,通过监测等手段来回顾和评价风险管理措施是否适当,并在必要的时候修正并改善原定的风险管理措施。风险沟通是风险评估和风险管理之间的纽带。通过利益相关方的充分参与和平等讨论,可以使风险管理真正达到科学合理、符合成本效益地降低化学品生产和使用中对人类健康和生态系统的风险的目的。不确定性是风险评估的重要特点,风险管理者需要正确理解这种不确定性的存在及其意义;既不能忽视不确定性对评估结果科学性造成的偏差,也必须防止落入"分析瘫痪"(paralysis by analysis)的境况中。
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  T19.2 体外皮肤刺激性试验在化妆品安全评价中的应用

  杨毅;宋健

  2013, 27(S1): 341-342.

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  皮肤刺激是化妆品日常使用中最常见的不良反应之一,是化妆品安全性评价过程中不可缺少的毒理学终点。化妆品刺激性的不良反应主要为接触性皮炎,临床表现为红斑和水肿。传统的皮肤刺激性评价方法是借助试验动物,观测动物皮肤对化学物质的反应作为判断刺激性强弱的标准。经现代研究证明,皮肤刺激性的生理机制是化学分子透过角质层,损伤角质形成细胞引起细胞死亡,从而释放大量细胞因子,激活炎症反应信号通路。炎症分子进一步作用于真皮细胞中的基质细胞和内皮细胞,内皮细胞扩张,通透性增加最终导致红斑和水肿。体外替代实验方法正是针对此级联效应的初始反应而设计。经过20年研发历程,欧莱雅集团开发并建立了体外重组皮肤模型EpiSkin和SkinEthic。Episkin是用正常人的角质形成细胞,将其培养在气液界面的胶原基质上(SkinEthic则是培养在惰性的聚碳酸酯过滤器上)形成人体皮肤最表层的结构。它是一种体外的三维生物模型,和人体表皮在组织学上有极高的相似度并具有皮肤屏障功能。测试时,直接将受试物应用于皮肤模型表面,以百分比细胞活性为检测终点用于区分皮肤刺激物和非刺激物。此试验方法的结果与动物试验方法结果比较有高度的敏感性,特异性和准确性。 该方法于2008年通过欧盟验证,并于2010年被OECD认可载入指南439。体外重组皮肤模型被广泛应用于化妆品安全评估中,评估包括成分和成品两个层面的内容。化妆品包含的成分多种多样,有合成的也有天然提取的原料,这些原料(如表面活性剂)可能本身具有一定的刺激性,但在化妆品中可以有条件的使用。在进行原料风险评估时,利用体外皮肤模型可以确定物质本身的刺激性,以及无刺激性的浓度。当成分用于配方中,由于物化环境改变以及成分混合等因素,需要进一步验证配方整体的潜在刺激性;而且根据产品使用方式和功效的不同,对应实际暴露的情况,在体外皮肤模型上建立相应的研究方案。如专业用烫发和染发产品具有较高的潜在刺激性,但是这些产品在短时间接触后即被冲洗掉,因此针对这类产品的方案应模拟真实情况。在临床试验前,体外皮肤刺激实验是验证皮肤耐受性的基本方法。作为评估产品安全中的一部分,它既控制了临床试验中的风险,符合道德伦理的要求,又补充了产品的安全性信息。体外重组皮肤模型还在进一步发展中。研究显示,重组皮肤具有功能性的代谢酶系,今后可能为毒物局部代谢提供信息。此外,该模型还被应用于检测光毒性,并将进一步优化,应用于更广泛的层面,充分支持产品的安全性。
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  T19.3 综合测试策略在化学品风险评估中的应用

  邢立国;任雁;段明郁

  2013, 27(S1): 342-343.

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  按照欧盟REACH法规要求,要对现存的化学物质重新进行登记注册和评估。大量的物质登记进行毒性测试耗资巨大,企业无力承受,使用实验动物高达几千万只动物,是动物福利所不允许的,也同时3R的原则相矛盾。化学品登记法规要求尽可能使用非动物方法,脊椎动物试验仅是最后选择,所以近十年大量的替代方法被开发,并在管理中应用。新技术和替代方法在登记中应该结合使用,进行综合的评估。每一种替代方法都有特定的适用领域,代替部分终点,或几种方法代替一个终点,所以毒性评价时各种方法应结合一起进行。综合测试策略(ITS)首先在化学品的登记管理中被提出。此方法在风险评估中具有广泛的意义。根据ECVAM/EPAA工作组的定义,综合测试策略(ITS)是一种方法,安全评估时集中多个资源的信息进行毒理学评价,从而有利于决策,同时考虑3R原则。Jaworska和Hoffmann (2010)将ITS定义为: 在文字上,ITS可以被描述为试验的组合,涵盖相关操作步骤,通过逻辑和假设驱动组织的决策方案,满足高效的利用产生的数据,获得危险和风险的决策的全面信息。从系统分析的角度理解,他们以综合信息累积方式,和测试信息获取最大化指导测试顺序的方式,作为决策支持的工具。ITS使用的数据包括非测试数据、非动物数据和在体试验数据等。每种数据依赖于不同的方法获得,但以非动物数据为主,在体试验是最后的选择。非测试数据主要通过计算机(in silico),构效关系预测(SAR和QSAR),物质分类和交叉参考(read-cross)等方法获得。非动物数据主要指细胞培养(In vitro)获得的数据,是替代方法的基础。In vitro细胞培养主要使用人源细胞或人源化工程细胞,基于试验结果和人类毒性的直接比较。In vitro方法还包括离体亚细胞组分、酶、受体、通道等,这些主要是高通量HTS方法。Omics是转录组学、蛋白组学和代谢组学等的简称,在分析毒性作用关键事件和反应结果之间联系,获得毒性通路(POT),建立毒性作用模式MOA具有重要作用。在体试验数据(in vivo)主要指实验动物数据,在ITS策略评估不可避免的进行动物实验时,应按3R的要求,尽可能减少动物数量,降低疼痛和痛苦,使用人道终点。ITS策略就是用上述基本要素组合形成评估框架,用于物质的毒性评估和分类标签。一般框架的起点是从人类暴露评估开始,使用已经存在的数据,来源于已有的毒性数据,QSAR预测和交叉参考数据等,根据暴露情况证据权衡决定是否进行试验,或者满足风险评估的要求,本部分应该评价生物利用度,评估物质是否通过吸入、皮肤或消化道等进入体内,如果存在,靶器官和体内浓度通过PBPK预测。第二阶段是预测靶器官的毒性,使用QSAR方法预测遗传毒性、发育毒性和致癌性等,使用in vitro细胞培养方法预测心脏、肝脏等靶器官毒性。第三阶段评估上阶段的数据确定是否缺失,是否必要进行迭代的非动物测试,必要时进行动物实验。最后使用已有数据进行风险评估。ITS建立之初是为REACH法规使用非动物试验方法而起,经过近10年的发展理论逐渐成熟,在管理中得到应用。在欧洲化妆品登记和化学品登记中,ITS策略是重要手段。眼刺激和皮肤刺激试验的分层测试是最简单的ITS,已经得到国际上的广泛认可。通过逐步的PH范围、经皮毒性、in vitro测试、in vivo序贯体内测试,实现局部刺激/腐蚀性的评价。皮肤致敏的ITS也已基本成熟,通过表皮生物利用度、肽反应测试、DC细胞激活和QSAR预测等非动物方法能够预测不同强度的致敏物,结合LLNA和GPMT动物方法形成完整的ITS框架。重复给药、代谢、致癌和发育毒性因为涉及机制复杂,目前还没有可行的ITS方法。广义的ITS是风险评估策略的一部分,随着TOX21毒性测试体系建立,风险评估的方式也发生转变。ITS贯穿在危害鉴定、暴露评估和风险评定的各个环节。当然ITS作为风险评估的架构,还有很多不明确的地方,需要不断的探索。
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  T19.21 The application of chemical grouping approaches in toxicology preparing an analogue justification report

  Caroline CURRID;CHEN Shui-juan;KONG De-tao

  2013, 27(S1): 352-353.

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  Progress in the use of non-testing methods in chemical risk assessment has accelerated in recent years as global chemical legislations have been updated to highlight the principles of animal welfare and the 3 Rs (Replacement, Reduction, Refinement). Chemical agencies have either adopted specific programmes to facilitate grouping of chemicals (eg OECD Existing Chemicals Database, US EPA HPV Challenge Programme) or are in the process of reviewing category or analogue chemical grouping approaches (eg European Chemicals Agency (ECHA) EU REACH dossier submissions for 2010 and 2013). It is clear that systematic grouping approaches (eg read-across in chemical categories or between chemical analogues) are expected to be applied more regularly in filling data gaps and the submission of a high quality robust read-across report will underpin an alternative non-testing strategy. As there are no specific guidelines available from the CRC-MEP in China for submission of a chemical grouping approach report, we propose a template based on experience in submitting read-across reports from technical guidance provided from ECHA and the European Chemicals Ecotoxicology and Toxicology Centre (ECETOC). The template will focus on preparing a quantitative read-across report for a chemical analogue for human health endpoints. The report should consist of 4 main sections: (i) Hypothesis for the analogue approach The hypothesis is the most critical part of the justification, as it is the basis for why the read-across may be performed. The hypothesis should explain how the target and source substance(s) have molecular structure similarities as well as describing any other evidence that may support the read-across e.g. similar mode of action, toxicokinetics. All functional groups need to be identified and any possible effects of any disparate groups should be discussed. The hypothesis should also clearly state which endpoint the read-across approach applies to as each endpoint has a specific set of complexities that should be addressed. (ii) Substance identity and similarity of target and source substance(s) The target and source substance(s) should be identified clearly with names, chemical structures and chemical identifier numbers provided. The composition and purity/impurity profiles should be detailed, particularly in cases where either the target and source substance(s) are multi-constituents or UVCBs (unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials), as these substances pose further challenges for read-across based on their complex characteristics. The form or phase of the target and source substance(s) should be clearly stated, as this may affect which hazards the substances may pose. The structural similarities (e.g. functional groups) between the target and source substance(s) should be discussed in detail;if there are any relevant QSAR profilers that may provide an insight into the mechanistic activity of the substances (e.g. DNA or protein binding in the OECD QSAR Toolbox), they can be referred to here as supporting data. It is also beneficial to consider any common breakdown products here though this point can be further elaborated on in the description of the toxicokinetic profiles. (iii) Analogue approach justification The physicochemical and toxicokinetic profiles of the target and source substance(s) can be used to strengthen the read-across hypothesis. If specific toxicokinetic studies are not available, the absorption, distribution, metabolism and excretion may be assessed based on physicochemical properties and toxicity data. Predicted data derived from QSAR profilers may also be acceptable to use as supporting information (e.g. metabolic profilers in the OECD QSAR Toolbox). If reliable toxicokinetic studies are available, they should be submitted as it may provide substantial evidence to justify/support the read-across hypothesis. The endpoint-specific data (e.g. specific study results and dose descriptor) should then be discussed in detail to demonstrate how the results from the source substance(s) suggest a similar systemic and local toxicity profile to the target substance. The effect of structural differences between the target and source substance(s) should also be discussed as they may contribute to a difference in the toxicity profiles. It is also recommended to consider how the uncertainty in the read-across prediction may influence the overall conclusion of the endpoint. A robust consideration of the impact of uncertainty and steps taken to account for it (e.g. use of appropriate assessment factors in DNEL derivation) may be included in a qualitative uncertainty assessment and will strengthen the read-across hypothesis. The current classification and labelling of the target and source substance(s), as well as the results of the PBT assessment should also be included in the justification. Overall, the analogue approach justification will clearly indicate that the hypothesis is supported by data available and that the read-across approach will not lead to an underestimation of the hazards of the target substance. (iv) Data matrix The data matrix should report the available study results for the target and source substance(s). The target and source substance(s) are the columns in the matrix and the endpoints are the rows in the matrix. Each cell in the matrix should contain the study result type e.g. key experimental study result, reliable predicted data (e.g. QSAR), read-across from supporting substance. Typically the data matrix should report the physicochemical, mammalian toxicity, ecotoxicological and environmental fate data. The source of all data listed in the matrix should also be included, with a list of comprehensive references provided. Any issues relating to data ownership/sharing here should also be considered, as the data is supporting the read-across justification and therefore data access must be considered. In conclusion, we believe the template described is a useful starting point to generate a robust hypothesis-driven comprehensive report that may be used to fill data gaps using a chemical grouping analogue method.
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  T19.22 Threshold of toxicological concern-status and future direction

  GAO Ren-jun;ZHAI EMI;Summer SHEN;Heli Miriam HOLLNAGEL

  2013, 27(S1): 353-354.

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  The Threshold of Toxicological Concern (TTC) concept for chemical safety assessment has encountered significant development over the last forty years. The TTC has been used in the risk assessment of chemicals to which humans are exposed at very low levels and was first used to asses chemicals migrating from food contact materials then gradually has been applied to a broad range of safety assessment including food and feed additives, genotoxic impurities in pharmaceutical products, cosmetic ingredients, household products, airborne substances, organic substances in the aquatic environment, plant protection product metabolites and combined exposures. Human Health related TTC values were developed using data from rodent cancer bioassays, from oral and inhalation chronic and sub-chronic toxicity studies for non-cancer effects. The environmental TTCs for freshwater systems were developed by evaluated acute and chronic eco-toxicological data. There are a number of ongoing projects to improve the TTC approach. These includes the desirability of developing better tools to assess the comparability of the chemical domain covered in different toxicological databases, and the need to develop an internationally acceptable framework and databases for updating the aspects critical to application of the TTC approach. An overview of values for the threshold of toxicological concern (TTC) is presented. This comprises the more established TTC values, including those that have been endorsed by regulatory bodies, and those that have more recently been proposed and may still need further evaluation. The advantages and limitations of the TTC concept are discussed. Application of the TTC approach would provide significant benefits in terms of reduced animal testing when predicted exposures to a chemical are below a level that would be associated with potential human health concerns and would also allow risk managers to concentrate risk assessment resources on chemicals posing potentially greater risks.
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  T19.23 Application of the Mode-of-Action and Human Relevance Framework analysis in human cancer risk assessment

  GAO Ren-jun;DONG Jing;Bryce LANDENBERGER;Lynn H. POTTENGER

  2013, 27(S1): 354-354.

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  It is well established that cancer is a multistep process which involves initiation, promotion, and progression stages. Mode-of-Action (MOA) is defined as the sequence of key cellular and biochemical events and processes (key events), which are necessary and quantifiable, starting with the interaction of an agent with a cell and moving through subsequent changes to result in tumor formation. The key events in an MOA are established on weight of evidence, using criteria based on considerations described by Bradford Hill, taking into account factors such as dose-response and temporal concordance, biological plausibility, coherence, and consistency. Once an MOA is established, the Human Relevance Framework (HRF) analysis should be conducted, which includes qualitative and then quantitative comparison of each key event between the experimental animal and humans, and enables a conclusion as to the likely relevance of the MOA for human risk. There are currently two distinct approaches for MOA-based risk assessment for carcinogens, depending on the DNA-reactivity of the chemical. Non-DNA-reactive carcinogens are considered to have a threshold for effects while DNA-reactive carcinogens with a mutagenic MOA do not. For non-DNA-reactive carcinogens with accepted thresholds, adequate dose-response data demonstrating a NOAEL allows the NOAEL or a similar point-of-departure (POD) to be used to derive a health-based guidance value. This guidance value is compared to the predicted exposure to provide a margin-of-exposure (MOE) comparison and complete the risk assessment. For DNA-reactive carcinogens determined to have a mutagenic MOA, typically a low dose linear extrapolation is applied to a POD (e.g., benchmark dose) to determine an exposure which conveys a negligible cancer risk. The threshold of toxicological concern (TTC) approach, 1.5 g·d^-1 or 0.15 g·d^-1 for non-genotoxic or genotoxic impurities, respectively, can be used to conduct preliminary risk characterizations, when adequate toxicology data are not available for a more thorough assessment.
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  T20.42 阿维菌素对容积氯离子通道及肌动蛋白的作用

  罗亮;孙英健;杨琳;伍一军

  2013, 27(S1): 380-381.

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  目的 探讨阿维菌素对S2细胞的容积氯离子通道的作用及肌动蛋白是否在阿维菌素对细胞容积氯离子通道影响过程中起作用。方法 利用膜片钳全细胞记录技术研究阿维菌素是否对低渗诱导的S2细胞的容积氯离子通道电流产生影响,并利用药理学方法进行确认。另外利用Western blotting技术和药理学方法研究肌动蛋白表达变化和阿维菌素对细胞容积氯离子通道的影响之间的关系。结果 低渗刺激后S2细胞的电流值分别从等渗条件下的(125.78±4.36)pA和(-103.47±4.12)pA增加至(1169.86±7.71)pA和(-1082.40±11.08)pA(n=8)。另外该膜电流的翻转电位大约是0 mV左右,接近Cl^-平衡电位0 mV。提示该电流为氯离子电流。检测不同浓度阿维菌素在低渗条件下是否引起S2细胞的电流的变化,结果发现,阿维菌素0.1, 1.0及 10 μmol·L^-1处理组的电流在±40 mV 及+100 mV下最大值分别为:926.10±96.73, 534.11±46.83, (186.68±22.71)pA及-782.97±49.82, -430.49±66.42, (-206.91±36.29)pA;与对照组相比具有显著性差异 (n=5, P<0.05)。 在低渗状态下,给予氯通道阻滞剂尼氟灭酸(NFA)和激活剂戊巴比妥(PBB),在阿维菌素存在的情况下,NFA则基本上完全抑制了氯离子电流,而在阿维菌素抑制容积激活氯离子通道后给予PBB可对氯通道电流有较弱的激活作用。用阿维菌素作用S2细胞后,肌动蛋白表达量明显降低,并呈浓度依赖性。当用氯离子通道激活剂PBB与S2细胞共同作用后,肌动蛋白表达量比阿维菌素单独作用有所增加,而用氯离子通道抑制剂NFA与阿维菌素共同处理后的结果则相反,肌动蛋白表达量下降。结论 S2细胞存在容积氯离子通道型离子通道,并在低渗状态下可引出容积激活氯离子电流,且阿维菌素可作用于容积氯离子通道,并呈剂量依赖性抑制该电流。另外阿维菌素还可使肌动蛋白表达水平下降,这种作用可能通过抑制容积氯离子通道而实现。
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  T19.24 A tiered approach to hazard evaluation with the goal of endpoint identification for human health risk assessment

  YIN Zheng-yu;Tessa L. SEREX

  2013, 27(S1): 354-355.

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  The goals of health hazard assessment for industrial chemicals typically involve gaining enough information to provide a hazard classification according to a classification system such as the Globally Harmonized System of Classification (GHS) as well as derivation of the most sensitive endpoint and concentration-effect level for health risk assessment. Hazard Classification under the GHS scheme involves animal testing of several endpoints that typically are not used for risk assessment, but may provide information for the design of higher tier testing that can be used to identify the most sensitive and appropriate endpoint for human health risk assessment. The goal of this presentation is to review the current approach to hazard evaluation and provide examples of assessments where using a tiered testing scheme could lead to a more targeted approach that may involve the use of fewer animals and provide more accurate health hazard information for risk assessment. Specifically, this approach would use a combination of screening and standard OECD guidelines to allow the toxicologist to better determine and target endpoints for evaluation in longer-term studies.
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  T19.25 Perspective on the use of risk assessment in national remediation programs：Europe, Latin America and the United States

  Ralph G STAHL;Jr.;Timothy S. BINGMAN;Annette GUISEPPI-ELIE

  2013, 27(S1): 355-355.

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  DuPont's Corporate Remediation Group is responsible for addressing environmental contamination issues at company sites around the globe. Our approach is risk-based, and over the years, we have experienced a wide diversity in approaches to using risk assessment for remediating contaminated sites in Europe, Latin America and the United States. In many cases the fundamental technical elements of human health and ecological risk assessments are similar across the various geographical regions. However, the approaches for human health risk assessment tend to be more similar across regions than those for ecological risk assessment. Nevertheless, differences are found in both human health and ecological risk assessments conducted in these geographical regions, and appear to result from variability in technical application, national policies, cultural preferences, or legal requirements. This can represent a challenge to companies undertaking environmental investigations, risk assessments and remedial actions at sites around the globe. This presentation highlights some of the similarities and differences that have been observed in the application of risk assessment in remediation programs of Europe, Latin America and the United States, and offers suggestions for approaches that may be of benefit in China.
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  T20.1 利用人胚胎干细胞研究三氯乙烯对心肌细胞发育毒性的机制

  王丹;张国兴;王国卿;陈涛;童建;姜岩

  2013, 27(S1): 355-356.

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  目的 探讨三氯乙烯(TCE)对心肌细胞发育毒性的机制。方法 选用人胚胎干细胞(ES)细胞系H9,进行定向心肌细胞分化, TCE作用于整个分化过程,其处理剂量如下:10 ppb, 100 ppb, 1 ppm, 10 ppm, 只接受DMSO处理组作为对照。分化过程如下:悬浮培养,第0~第3天,BMP4 10 μg·L^-1, activin 6 μg·L^-1, bFGF 5 μg·L^-1, 第4~第7天,贴壁培养VEGF10 μg·L^-1, DKK1 150 μg·L^-1, 第8~第21天, VEGF 10 μg·L^-1和bFGF 5 μg·L^-1。收集对照组和不同TCE剂量处理下的不同发育时期的细胞(心肌前体细胞期, 成熟心肌细胞期),提取RNA, 应用实时PCR和免疫荧光方法检测各个时期相关基因和蛋白的表达与分布。选取差异显著的剂量组10 ppm成熟心肌细胞进行表达表达谱基因芯片分析。简述如下:总RNA反转录成双链cDNA,进一步合成 (Cy3)标记的cRNA和芯片杂交,洗脱后利用Agilent Scanner G2505C扫描得到原始图像。利用倍数变化值进行差异基因筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0。接着,对差异基因进行GO和KEGG富集分析,以判定差异基因主要影响的生物学功能。结果H9细胞在细胞因子作用下可定向分化为自主搏动的心肌细胞,表达心肌细胞特异性蛋白cTnT和MHC。TCE降低了心肌前体细胞期NXK2.5和GATA4的表达,以及成熟期的心肌细胞中cTnT和a-actinin的表达,但差异不显著(P>0.05)。TCE降低成熟心肌细胞中Cav1.5, Serca2A等与Ca离体通道相关蛋白表达(P<0.05)。表达谱基因芯片结果显示,10 ppm TCE处理显著影响钙离子释放通道相关基因的表达,包括钙泵、Ryanodine 受体、L型和T型钙离子电压门控通道、神经肽及肌质网钙磷受体蛋白。结论 TCE通过干扰Ca²⁺通道相关基因的表达,影响心肌细胞分化及其泵血功能,从而使心房、心室和瓣膜的形成受累,可能是TCE对心肌细胞发育毒性的机制之一。
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  T20.2 内源性SO₂的生物气体信号分子特征及对血管舒张的作用机制

  李君灵;孟紫强

  2013, 27(S1): 356-356.

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  目的 探讨内源性气态SO₂的生物气体信号分子特征及其对血管的舒张作用机制。方法 应用气态SO₂或SO₂生理盐水溶液加入孵育液的方法,使SO₂分子直接作用于离体大鼠胸主动脉血管环,同时使用不同信号转导途径抑制剂,研究内源性气态SO₂对血管的舒张特征及其信号转导机制;并与SO₂的体内衍生物亚硫酸盐和亚硫酸氢盐混合液(摩尔比为3:1, pH 7.0)的作用进行比较以探讨SO₂在体内的失活机制。结果 气态SO₂(1~2000 mol·L^-1),对大鼠血管的舒张作用是剂量依赖性的,SO₂气体和SO₂生理盐水溶液作用强度相似,表明在SO₂生理学和毒理学试验中二者可相互替代之。内源性气态SO₂对大鼠血管的舒张作用是SO₂分子直接作用引起的,与SO₂引起的pH值轻度降低无关,也与亚硫酸盐和亚硫酸氢盐无关,SO₂所致血管舒张的特征与亚硫酸盐和亚硫酸氢盐的作用也不同。气态SO₂的舒血管作用远大于SO₂衍生物亚硫酸盐和亚硫酸氢盐混合液,表明SO₂衍生物是SO₂信号作用失活机制的产物。气态SO₂在生理浓度(110 mol·L^-1)和低浓度(450 mol·L^-1)引起的舒血管作用主要是通过NO/cGMP途径介导。很低浓度的气态SO₂(3 mol·L^-1)和NO(3或5 nmol·L^-1)在引起血管舒张作用时有协同作用,二者在体内联合发挥对血管张力的调节作用。结论 (1)SO₂是一种新型生物气体信号分子,是血管组织的一种内源性气体舒张因子;(2)SO₂衍生物亚硫酸氢盐、亚硫酸盐及硫酸盐是SO₂信号作用失活过程的代谢产物,通过这一失活过程SO₂被转化为亚硫酸盐并进一步被酶促氧化为硫酸盐;(3)低浓度SO₂引起的舒血管作用可通过NO/cGMP途径介导,且SO₂与NO对血管张力的调节有较强协同作用。
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  T20.7 XRCC1介导顺铂所致胃癌细胞DNA损伤修复的分子机制

  许文侠;王守宇;张亚杰;陈 琦;倪 盼;吴徐明;强福林;李爱萍;徐 珊;Oluf Dimitri RE;周建伟

  2013, 27(S1): 359-360.

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  目的 探讨XRCC1表达与胃癌细胞顺铂耐药关系及其分子机制。方法 采用胃癌细胞株BGC823,浓度梯度法诱导产生顺铂耐药亚株BGC823/DDP;检测顺铂耐药亚株与亲本株的DNA修复能力及XRCC1表达;二维电泳-质谱法检测顺铂耐药亚株与亲本株的蛋白质组差异,分析蛋白质组差异与DNA修复之间的相关性;结合药敏实验分析XRCC1与铂类方案敏感性间相关性。结果:成功构建耐药指数为18.9的顺铂耐药亚株,BGC823细胞IC₅₀值0.85 μg·ml^-1,而BGC823/DDP细胞IC₅₀值为16.09 μg·ml^-1。BGC823/DDP细胞DNA修复能力显著增强,相同剂量的顺铂(1 μg·ml^-1)处理BCG823细胞和BGC823/DDP细胞,γH2AX染色结果显示BGC823/DDP阳性率显著低于BGC823(P<0.01);免疫印迹结果显示,BGC823/DDP细胞中XRCC1表达显著增加;在BGC823细胞中转染RFP-XRCC1表达质粒上调XRCC1表达可以显著抑制顺铂诱导的DNA损伤(P<0.01)及细胞凋亡(P<0.01);在BGC823/DDP细胞中转染XRCC1 shRNA质粒抑制XRCC1表达可以显著增加顺铂诱导的DNA损伤(P<0.01)及细胞凋亡(P<0.01);在顺铂诱导DNA损伤过程中,XRCC1与DNA-PK相互作用,通过非同源重组修复途径介导顺铂诱导的DNA损伤修复过程;BGC823/DDP细胞对伊立替康无交叉耐受性,伊立替康抑制BGC823/DDP细胞中XRCC1的表达,伊立替康联合顺铂显著杀伤BGC823/DDP细胞,提高其对顺铂的敏感性;二维电泳-质谱法检测发现BGC823/DDP细胞中TXNL1表达显著下降;在BGC823/DDP胃癌细胞中,TXNL1与XRCC1表达呈相反趋势;TXNL1shRNA抑制BGC823细胞TXNL1表达可以上调XRCC1表达,而flag-TXNL1表达质粒回复BGC823/DDP细胞中TXNL1表达可以下调XRCC1表达;TXNL1通过泛素-蛋白酶体途径负调控XRCC1表达;在23例经药敏检测的胃癌原代细胞,进一步证实TXNL1和XRCC1的表达呈负相关性(P<0.05),与铂类化疗方案的敏感性相关。结论 TXNL1通过泛素-蛋白酶体途径调控XRCC1表达及TXNL1-XRCC1可作为胃癌患者个体化治疗标志物。
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  T20.8 Poly(ADP-ribose) glycohydrolase regulates DNA hypomethylation induced by BaP

  HUANG Hai-yan;LIU Jian-jun;YANG Lin-qing;WU De-sheng;YANG Xi-fei;HONG Wen-xu;HUANG Xin-feng;CHEN Wen;ZHANG Jian-qing;ZHUANG Zhi-xiong

  2013, 27(S1): 360-361.

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  OBJECTIVE Poly(ADP-ribosyl)ation regulates chromatin structure and transcription driving epigenetic events. We provided evidence that poly(ADP-ribose) polymerases (PARP1) is able to directly influence DNA methylation patterns in cells treated with BaP. Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) is the primary enzyme responsible for the degradation of poly(ADP-ribose). PARG participates in a number of biological processes. Accumulating data suggest that inhibitors of PARG are potent anticancer drug candidates. The present study was designed to investigate whether inhibition of PARG would control and/or protect the DNA methylation pattern in cells. METHODS DNA methylation and DNMTs expressions were studied in detail using PARG-deficient human bronchial epithelial cell line (shPARG cell) as an in vitro model after BaP treatment using 5-mC Immunofluorescent detection, global DNA methylation assay, flow cytometric analysis, western blotting, real-time polymerase chain reaction and enzymatic activity assays. The global DNA methylation levels were determined using the EpiQuik^TM DNA Methyltransferase Activity kit according to the manufacturer's instructions. RESULTS Our study shows: (1) Treatment of 16HBE cells with BaP was resulted in reduction in the levels of global DNA methylation in a concentration-dependent manner. And we found that the levels of global DNA methylation in 16HBE cells were significantly reduced (P<0.05) after 72 h of treatment with BaP than the treatment of cells with BaP for 24 h. At the same time point, no dramatic changes in global DNA methylation were observed in shPARG cell between BaP treatment for 24 h and 72 h (P>0.05). (2) Cells were treated with various concentrations of BaP for 72 h, then harvested and washed with PBS for 3 times. We found that BaP decreased DNMTs activity in 16HBE cells, and the effect of BaP was concentration dependent. However, DNMTs activity in shPARG cells did not alter significantly after BaP treatment (P>0.05). This data indicates that the DNMTs activity can be effect by PARG. (3) After cells treated with various concentrations of BaP for 72 h, we found that treatment of 16HBE cells with BaP decreased the mRNA level of DNMT1, whereas increased the level of DNMT3b and MBD2, but did not change the mRNA level of DNMT3a. In contrast, treatment of shPARG cells with BaP decreased the mRNA level of DNMT3a but did not alter the level of DNMT1, but the mRNA levels of DNMT3b and MBD2 were significantly increased (P<0.05). The increase in mRNA expression of DNMT3b and MBD2 in 16HBE cells were greater than shPARG cells. Similar to mRNA expression, protein reactivation levels were also determined using western blot analysis. There was also an increase in protein expression levels of DNMT3b and MBD2 after the treatment of cells with BaP for 72 h, and the increase of the protein expression was greater in 16HBE cells than shPARG cells. BaP treatment decreased the protein expression levels of DNMT1 in the 16HBE cell, whereas BaP treatment decreased the protein expression levels of DNMT3a in shPARG cells, in a concentration-dependent manner. CONCLUSION In conclusion, our results showed that poly(ADP-ribose) glycohydrolase correlates with DNMTs and involves in regulating global DNA methylation, which would help to elucidate the underling molecular mechanism of the role of PARG during DNA methylation, and may have important implications for epigenetic therapy.
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  T20.9 核糖体小亚基蛋白S7通过调控MDM2依赖GADD45泛素化降解反应介导砷化物诱导的促细胞凋亡效应

  高明;李小光;董雯;金蕊;马航航;杨平勋;胡美茹;李译;郝一;宋伦

  2013, 27(S1): 361-361.

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  目的 探讨GADD45在静息状态下维持持续性泛素化降解反应、应激损伤信号刺激作用下终止泛素化降解反应并实现其诱导表达的分子机制。方法 采用酵母双杂交系统筛选可能参与GADD45蛋白质稳定性调控的GADD45结合蛋白;采用GST-pull down、免疫荧光、免疫沉淀等方法证实以上信号蛋白在砷化物刺激前后与GADD45的结合反应状态;采用基因过表达和siRNA干扰技术研究以上信号蛋白在GADD45稳定性调控中的作用;采用体外和体内泛素化修饰反应分析系统分析以上信号蛋白在GADD45泛素化修饰反应中的调控作用;采用流式细胞术分析以上信号蛋白和GADD45在介导砷化物诱导细胞凋亡反应中的协同作用及贡献。结果 采用酵母双杂交技术筛选得到GADD45相互作用蛋白核糖体小亚基蛋白S7;并从体外、体内多层次证实了S7在砷化物刺激前后存在有与GADD45的相互结合反应。过表达S7可增强多种细胞中内源及外源性GADD45的蛋白质稳定性,提示S7在GADD45稳定性调控中存在关键作用。由于目前公认的S7核糖体外功能主要表现为参与p53的稳定性调控;而GADD45又是经典的p53下游靶基因,因此为了进一步确定S7对GADD45的表达调控作用是直接发生还是通过p53而间接实现,比较了p53^+/+和p53^-/-细胞中的S7-GADD45信号传递情况,结果证实了S7对GADD45的稳定性调控作用是独立于p53的全新生物学功能。我们在后续体内、体外多重实验中发现了受控于S7的MDM2是GADD45的E3泛素化连接酶,它与S7和GADD45的组成性结合是导致静息细胞中GADD45发生组成性泛素化降解反应的关键前提。砷化物刺激后,S7与MDM2结合能力显著提升,致使MDM2介导的GADD45泛素化降解反应被显著抑制,从而实现了GADD45的诱导表达。干扰肿瘤细胞中S7表达水平后可显著抑制GADD45依赖的细胞凋亡反应途径的诱导活化以及砷化物诱导的促细胞凋亡效应;而且以上反应发生强度与阻断GADD45诱导表达后的效应几乎相同;说明S7-MDM2-GADD45 信号途径在介导砷化物促细胞凋亡反应中具有重要作用。结论 核糖体蛋白S7通过抑制MDM2的E3泛素化连接酶活性从而在细胞静息和砷化物诱导的应激状态下稳定GADD45的调控。
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  T20.10 转化生长因子β激活激酶1在三氯乙烯所致接触性超敏反应中的作用

  盘瑶;杨进涛;吴双;黄鸿鹏;王宛怡;郝卫东

  2013, 27(S1): 362-362.

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  目的 研究转化生长因子β激活激酶1(TAK1)基因在三氯乙烯(TCE)所致小鼠接触性超敏反应(CHS)中的作用。方法 在ER-TAK1fl/fl小鼠双侧耳背部涂抹他莫西芬(TMA),局部敲除TAK1基因,以不涂抹TMA的ER-TAK1fl/fl小鼠作为野生型对照;此外,还用到在树突状细胞(DC)中特异性敲除TAK1基因的CD11c-TAK1fl/fl小鼠,以CD11c-TAK1wt/wt小鼠作为野生型对照。每种基因型动物均随机分为3组,每组4只,分别为AOO溶剂对照组、80%TCE组和0.2%2,4-二硝基氟苯(DNFB)阳性对照组。实验第1, 2, 3天分别于小鼠双侧耳背部涂抹25 μl TCE,第5天经腹腔注射0.5 ml 10 mg·ml^-1 BrdU溶液,第6天处死小鼠,取双侧耳后淋巴结,进行淋巴细胞计数和BrdU含量测定,比较各组小鼠淋巴细胞增殖和刺激指数(SI)的差异,观察TAK1对TCE所致CHS发病的影响,同时用流式细胞仪检测淋巴结内CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的细胞比例和细胞数,观察TAK1敲除对淋巴结中T细胞功能的影响。结果 在不涂抹TMA的ER-TAK1fl/fl野生型对照小鼠中,80%TCE组和0.2%DNFB组的刺激指数SI分别为1.81和2.72,均超过判断致敏性阳性的临界值1.6;局部敲除TAK1基因小鼠的80%TCE组和0.2%DNFB组的刺激指数SI分别为0.79与1.45,均低于1.6,并且与野生型对照小鼠相比SI值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);淋巴结内CD4⁺/CD8⁺T细胞比例无变化,但致敏期的总淋巴细胞数明显降低。在CD11c-TAK1wt/wt野生型对照小鼠中,80%TCE组和0.2%DNFB组的SI分别为1.98和3.22,均超过1.6;DC中特异性敲除TAK1基因后,80%TCE组和0.2%DNFB组小鼠的SI分别为0.98与1.05,均低于1.6,并且与野生型对照小鼠相比SI值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);淋巴结内CD4⁺/CD8⁺T细胞比例无变化,但致敏期的总淋巴细胞数明显降低。结论 局部和DC特异性敲除TAK1基因均可以抑制TCE所致小鼠CHS反应和致敏期T细胞的增殖功能,提示局部或DC特异性抑制TAK1基因可能成为治疗TCE所致CHS型免疫疾病的潜在靶点。
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  T20.11 miR-203通过调控多环芳烃受体介导TCDD和BaP引起的细胞毒性效应

  刘彩霞;李道传;余皓辉;曾晓雯;章征保;邢秀梅;陈丽萍;肖勇梅;段化伟;郑玉新;王庆;陈雯

  2013, 27(S1): 362-363.

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  目的 探索microRNA对多环芳烃受体(AhR)介导的多环芳烃及二恶英类物质引起的毒性效应的调控机制,寻找毒性暴露相关的microRNA标志物。方法 利用生物信息学检索,预测可能靶向AhR的候选microRNA。构建AhR的全长及各个位点的荧光素酶基因报告质粒,利用双荧光素酶报告实验,筛选出效应显著的microRNA。通过导入microRNA模拟物和microRNA抑制剂检测相应的mRNA及蛋白水平变化,从而确证其靶点效应。再选择合适浓度的AhR配体TCDD以及BaP,观察mir-203以及AhR之间的变化关系。同时通过模拟物以及抑制物的导入干扰内源性miR-203的水平,检测AhR及其下游基因在暴露中对毒物的诱导反应及细胞毒性效应。结果 TargetScan,PicTar等microRNA数据库预测多个可能通过以上方式调控AhR的microRNA,我们选择了其中总体得分最高的5个microRNAmiR-29b/c, miR-124, miR-203和miR-375。经过双荧光素酶报告实验筛选显示,miR-203和miR-124均可结合到AhR mRNA的3'UTR区域(分别是miR-203的第二个结合位点和miR-124相应结合位点),降低荧光素酶的相对活性(31%和32%);AHR mRNA 3'UTR种子区域突变(第二个结合位点)后酶活性恢复,证明了miR-203和miR-124与AHR的结合效应。当在肺腺癌细胞株A549和肝癌细胞株HepG2中导入miR-203和miR-124的模拟物时,可显著降低AhR mRNA(大于20%),和蛋白(大于35%)的表达,并呈剂量-反应关系。利用AhR的经典配体TCDD和BaP处理A549时,可引起miR-203和AhR剂量依赖性的表达增加和降低。而提前转染miR-203模拟物后再用TCDD处理可降低TCDD对下游代谢相关靶基因,如CYP1a1,CYP1a2,NQO1的mRNA诱导程度(41%, 36%,37%)。相应的,利用miR-203的抑制物抑制miR-203的表达后,增加了相应基因的诱导表达(1.91-, 3.94-, 1.86-)。采用细胞增殖实验及CYP1a1酶活性检测,结果表明miR-203的异常表达影响HepG2由BaP处理引起的增殖抑制和CYP1a1酶活性的显著差异(下降15%)。结论 miR-203对AhR的负向调控作用在环境毒物暴露的毒性通路中有着重要的作用。
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  T20.12 microRNA-1254调控血红素氧化酶1表达的机制

  李成刚;戚新明;任进

  2013, 27(S1): 363-363.

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  目的 寻找能有效调节血红素氧化酶1(HO-1)表达的microRNA并对其调节机制进行研究。方法 使用脂质体法将microRNA模拟物及其突变体转入细胞,Western blot及realtime PCR分别检测HO-1蛋白及mRNA表达量,luciferase荧光素酶报告基因检测microRNA模拟物及其突变体对HO-1基因启动子及3'UTR的作用。结果 miR-1254可能对血红素氧化酶1表达具有调节作用。本课题发现在经氯化血红素诱导而高表达HO-1的HEK293和自然状态下高表达HO-1的A549细胞系中,外源转入miR-1254模拟物均可观察到HO-1的mRNA及蛋白水平显著降低,证实miR-1254是能够有效调节HO-1表达的microRNA,而抑制内源性的miR-1254,可以使HO-1的mRNA及蛋白水平升高,直接证明了内源性miR-1254对HO-1具有抑制作用。随后,将miR-1254模拟物与含有HO-1的3'非翻译区(3'UTR)重组荧光素酶质粒共同转入细胞,发现miR-1254能够降低重组质粒荧光素酶的表达,而将HO-1的3'UTR上与miR-1254结合位点突变后这种抑制作用消失,提示miR-1254可能具有翻译抑制的功能;同样的方式我们发现miR-1254对HO-1可能还具有转录抑制作用;最后,miR-1254突变实验证明,其5'端的"种子区序列"对转录后抑制是重要的。结论 miR-1254能够有效的调节HO-1的表达,并且可能是以转录水平和转录后水平双重抑制的机制进行调节。
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  T20.13 N-乙酰半胱氨酸、α-硫辛酸和盐酸美金刚胺对甲基汞 致大鼠脑谷氨酸代谢及氧化损伤的影响

  徐兆发;魏衍刚;刘巍;杨天瑶;李乐慧;奉姝;邓宇;徐斌

  2013, 27(S1): 363-364.

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  目的 观察甲基汞对大鼠脑谷氨酸代谢及氧化损伤作用,探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)、α-硫辛酸(α-LA)和盐酸美金刚胺(MEM)对甲基汞神经毒性的影响。方法 60只Wistar大鼠按体重随机分成6组,每组10只。第1组为对照组,第2和第3组为低、高剂量染甲基汞组,第4~第6组为预处理干预组。第1~第3组先皮下注射0.9%的氯化钠,第4~第6组分别皮下注射NAC 1 mmol·kg^-1, α-LA 35 μmol·kg^-1, MEM 5 μmol·kg^-1。皮下注射2 h后,第1组腹腔注射0.9%的氯化钠,第2和第3组大鼠分别腹腔注射甲基汞4和12 μmol·kg^-1,第4~第6组腹腔注射甲基汞12 μmol·kg^-1。大鼠每天染毒1次,每周5次;NAC, α-LA和MEM隔日皮下注射1次,每周3次,连续4周。最后一次染毒后24 h,将每组6只大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,断头处死,在冰浴下迅速分离大脑皮质,测定大脑皮质汞含量,谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)含量和谷氨酰胺合成酶(GS)、磷酸活化的谷氨酰胺酶(PAG)活力。大脑皮质丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。大脑皮质蛋白羰基、蛋白巯基含量。每组另外4只大鼠麻醉后心脏放血处死,制备大脑皮质单细胞悬液,用于测定细胞内ROS含量和细胞凋亡率。结果 随着染甲基汞剂量的增加,大鼠脑汞含量升高;Glu含量升高,Gln含量降低;GS活力降低,PAG活力升高;MDA含量升高,SOD和GSH-Px活力降低;蛋白羰基含量升高,蛋白巯基含量降低;ROS含量增加,细胞凋亡率升高。NAC, α-LA和MEM干预组大鼠脑汞含量亦显著升高。和单纯染高剂量甲基汞组比较,Glu含量均降低,Gln含量明显升高;GS活力升高,PAG活力降低;MDA含量降低,SOD和GSH-Px活力升高;蛋白羰基含量降低,蛋白巯基含量升高;ROS含量降低,细胞凋亡率下降。结论 甲基汞可引起大鼠脑谷氨酸代谢紊乱及氧化损伤,NAC, α-LA和MEM对甲基汞所致神经毒性均有一定的拮抗作用。
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  T20.25 儿茶酚O-甲基转移酶在儿茶酚促进K562细胞红分化中的作用

  苏日咕嘎;李扬;余春红;李怡然;唐恪雅;姜良;易宗春

  2013, 27(S1): 370-371.

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  目的 观察儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)在儿茶酚促进K562细胞红分化中的作用。方法 K562细胞经儿茶酚处理后,分别用联苯胺染色法和反转录PCR分析氯化高铁血红素诱导的血红蛋白合成和红系相关基因表达,应用HPLC分析培养基儿茶酚经COMT催化产生的愈创木酚的含量。脂质体转染COMT shRNA表达质粒载体(PGPU6/GFP/Neo-COMT-homo-723)并经G418筛选获得稳定敲降COMT的K562细胞系。分析稳定敲降COMT的K562细胞系经儿茶酚处理后,培养基愈创木酚的含量,以及氯化高铁血红素诱导的血红蛋白合成和红系相关基因表达情。结果 K562细胞未经氯化高铁血红素诱导的血红蛋白阳性率低于1%,经氯化高铁血红素诱导的血红蛋白阳性率升高到39.4%;当K562细胞经儿茶酚20, 40和80 μmol·L^-1处理,然后经经氯化高铁血红素诱导,血红蛋白阳性率进一步升高,处理24 h各浓度儿茶酚组分别升高到41.4%, 45.2%和50.7%到39.4%,处理48 h各浓度组分别升高到48.2%, 56.7%和67.7%;而且当K562细胞经儿茶酚20, 40和80 μmol·L^-1处理48 h,然后经经氯化高铁血红素诱导,红系相关基因(包括α-, β-和γ-珠蛋白、血红素合成相关酶PBGD和ALAS2)的mRNA表达水平也出现浓度依赖性升高。当K562细胞经儿茶酚20和40 μmol·L^-1处理6~48 h,24 h内培养基愈创木酚含量出现时间和浓度依赖性升高,在24和48 h处于稳定水平。反转录PCR分析显示脂质体转染COMT shRNA表达质粒载体并经G418筛选获得稳定敲降COMT的K562细胞系,该细胞系COMT的mRNA表达水平显著低于对照K562细胞;该细胞系经儿茶酚20和40 μmol·L^-1处理48 h,培养基愈创木酚含量显著低于没有敲降COMT的K562细胞;COMT敲降细胞系经儿茶酚20和40 μmol·L^-1处理48 h, 然后经经氯化高铁血红素诱导,相对于未经儿茶酚处理细胞,血红蛋白阳性率与各红系相关基因的mRNA表达水平均也没有明显差异。结论 儿茶酚可以促进氯化高铁血红素诱导的K562细胞红系分化,儿茶酚加入K562细胞可经COMT转换产生愈创木酚,敲降COMT可显著减少儿茶酚处理细胞愈创木酚的产生,阻断儿茶酚促进的红系分化,表明COMT催化儿茶酚转换为愈创木酚在儿茶酚促进的红系分化过程中发挥重要作用。
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  T20.26 活性氧在氢醌抑制K562红系分化中的作用

  余春红;李怡然;苏日咕嘎;李扬;姜良;唐恪雅;易宗春

  2013, 27(S1): 371-371.

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  目的 氢醌可以抑制K562细胞红系分化,也可引起活性氧(ROS)的产生,实验观察了ROS的产生在氢醌抑制K562 细胞红系分化中的作用。方法 K562细胞经氢醌单独或抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)共同24 h处理后,用DCFDA作为探针应用流式细胞术分析K562细胞的细胞内ROS水平,分别用联苯胺染色法和反转录PCR分析氯化高铁血红素诱导的受氢醌与NAC处理的K562细胞的血红蛋白阳性率和γ-珠蛋白基因的mRNA表达水平。结果 K562细胞经氢醌5, 10和20 μmol·L^-1处理24 h,然后经氯化高铁血红素诱导红系分化48 h后,其血红蛋白阳性率从对照组的41.0%分别下降到39.6%, 35.8%和32.7%。相对于没有经氯化高铁血红素诱导的K562细胞,被氯化高铁血红素诱导的对照细胞的γ-珠蛋白基因mRNA表达水平提高了3.1倍,而经氢醌5, 10和20 μmol·L^-1处理24 h的K562细胞在被氯化高铁血红素诱导的情况下γ-珠蛋白基因mRNA表达水平分别只提高了2.1, 1.5和0.6倍。K562细胞经氢醌5, 10和20 μmol·L^-1处理24 h 后细胞内ROS水平出现浓度依赖性增加,而同时加入NAC可完全抑制ROS水平的提高。如果K562细胞经20 μmol·L^-1氢醌和NAC 10 mmol·L^-1同时处理24 h,NAC的存在可完全阻断氢醌抑制氯化高铁血红素诱导的血红蛋白合成和γ-珠蛋白基因的mRNA表达。结论 氢醌可抑制K562 细胞的红系分化和提高细胞内ROS水平,而抗氧化剂NAC存在可阻断红系分化的抑制和细胞内ROS水平的提高,提示ROS在氢醌抑制红系分化中发挥重要作用。
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  T20.14 人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中差异甲基化基因谱分析

  张文娟;纪卫东;杨淋清;胡大林;杨建平;袁建辉;庄志雄

  2013, 27(S1): 364-364.

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  目的 筛检人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中年轻及复制性衰老阶段差异的甲基化基因,为细胞衰老相关基因的表观遗传调控机制提供理论依据。方法 以人胚肺成纤维细胞为研究对象,利用免疫共沉淀(MeDIP)方法捕获并富集甲基化基因组片段,特异性抗体采用5-甲基胞嘧啶,经全基因组扩增(WGA)、纯化和鉴定后,进行DNA甲基化芯片(chip)分析其甲基化水平(-2200 bp~+500 bp),利用IP/Input确定peak,有显著意义的peak即为DNA甲基化区域。通过kobas 2.0软件对涉及的所有高甲基化基因进行信号通路富集性分析,并利用IPA软件构建网络关系。结果 人胚肺成纤维细胞年轻阶段特异的高甲基化基因有252个,复制性衰老阶段特异的高甲基化基因有1165个,两者共有的高甲基化基因有372个;在KEGG信号通路分析中,年轻细胞涉及的显著性关联信号通路(P<0.05)有视黄醇代谢途径,IgA产生的肠道免疫网络,泛素介导的蛋白质降解通路,类固醇激素生物合成通路,花生四烯酸代谢途径,磷酸戊糖途径及同源重组通路;复制性衰老细胞涉及的显著性关联信号通路(P<0.05)有抗原加工提呈过程,天然杀伤细胞介导的细胞毒性过程,移植物抗宿主病信号途径,PPAR信号途径,凋亡途径,抗利尿激素调节的水重吸收途径以及破骨细胞分化途径。进行与信号通路相关联的高甲基化基因的网络整合,发现71个基因的高甲基化在人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中发挥核心作用。结论 人胚肺成纤维细胞年轻与复制性衰老阶段存在其特异的高甲基化基因,涉及不同的信号通路,特异相关高甲基化基因对衰老及相关性疾患的研究具有重要的作用。
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  T20.75 丙烯酰胺对大鼠背根神经节细胞NF-M转运速度的影响及其机制

  安丽红;谢克勤;李国珍;司纪亮;韩晓英

  2013, 27(S1): 398-398.

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  目的 研究丙烯酰胺(ACR)对Wistar大鼠原代DRG细胞NF-M转运速度的影响并初探其机制。方法 用ACR对原代培养的Wistar乳大鼠背根神经节细胞(DRG)染毒,用四甲基偶氮唑盐(MTT)确定受试物的染毒剂量。将质粒p-GFP-NFM和DsRED共转染进入DRG中,细胞培养48 h后ACR染毒(0, 0.14, 0.28 mmol·L^-1)。ACR染毒培养24 h后,将DRG置于荧光显微镜下,选取共转染成功、状态良好的DRG的平滑近端轴突,每隔30 min记录一次视野内轴突的pGFP-NF-M绿色荧光强度,连续记录2 h。将各时间点的pGFP-NFM绿色荧光强度与0 min的荧光强度相比较,计算在该时间段内的绿色荧光强度变化,并以此代表在该时间段内DRG的NFM转运水平。同时检测各ACR染毒组DRG的ATP水平。结果 根据MTT结果,ACR染毒大鼠DRG,其IC₅₀为2.67 mmol·L^-1;ACR染毒剂量低于0.70 mmol·L^-1时,吸光度(A)与阴性对照组相比无显著性差异(P>0.05), 故在此剂量以下选择ACR染毒剂量进行试验。在30, 60, 90和120 min四个时间段内,ACR染毒组(0.14,0.28 mmol·L^-1)的NF-M运动速度显著低于阴性对照组(P<0.01),且0.28 mmol·L^-1 ACR染毒组的NF-M转运速度也明显低于0.14 mmol·L^-1 ACR染毒组(P<0.05),在120 min内ACR染毒各组(0, 0.14, 0.28 mmol·L^-1)未被转运的NF-M为(62.64±7.82)%, (74.20±4.09)%, (81.27±5.26)%。ACR染毒组(0.14,0.28 mmol·L^-1)的ATP水平分别为(8.68±0.59),(6.76±0.28)mmol ATP·g^-1蛋白,低于阴性对照组(10.54±0.50)mmol ATP·g^-1蛋白,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 ACR染毒可导致Wistar乳大鼠原代DRG细胞轴突内NFM转运速度减慢,其机制与ACR减少原代DRG内ATP水平有关。
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  T20.76 储存条件对代谢组学研究尿液样本的稳定性的影响

  汤柳英;高燕红;王晶;许瑛华;陈文才;梁旭霞;杨杏芬

  2013, 27(S1): 398-399.

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  目的 了解代谢组学研究中常用的4种尿液储存条件下人尿中小分子代谢物的稳定性,寻找理想的尿液保存方法。方法 采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF)正离子和负离子模式对4种储存条件下(-80℃, -20℃, 1%HNO₃置-80℃和2%抗坏血酸置-80℃)人尿中小分子代谢物进行分析,运用主成分分析法和偏最小二乘判别法分析尿液中代谢物的差异性,采用MPP软件对差异性代谢产物进行识别和确认。结果 4种不同储存条件中,-80℃组样本较为稳定。与-80℃组相比,-20℃组存在4个具有显著性差异的小分子代谢物(ESI+/-为2/2个),1%HNO₃置-80℃保存后尿液有120个具有显著性差异的小分子代谢物(ESI+/-为76/44个),2%抗坏血酸置-80℃保存尿液中存在与原尿中具有显著性差异的小分子代谢物18个(ESI+/-为6/12个)。与-80℃相比,-20℃、1% HNO₃置-80℃、2%抗坏血酸置-80℃ 3种条件保存后尿液均出现了具有显著性差异的小分子代谢物,以1% HNO₃置-80℃组差异化合物最多。结论 样本储存条件对代谢组学研究结果的真实性至为关键,本研究提示-80℃为首选保存条件。
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  T2.41 武汉地区空气细颗粒物PM_2.5的细胞毒性及发育毒性评价

  苑晓燕;李利忠;王以美;彭双清

  2013, 27(S1): 47-48.

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  目的 评价PM_2.5的细胞毒性和体外胚胎发育毒性。方法 于2011年5月13日至5月27日在汉口江滩采集PM_2.5样本,经超声洗脱、冷冻干燥收集PM_2.5。在细胞毒性评价中,采用MTT法评价PM_2.5对细胞存活的影响,通过线粒体ROS水平和细胞SOD活性反映细胞的氧化还原状态,采用DNPH比色法、TBA比色法和彗星实验评价细胞生物大分子的氧化损伤程度,采用流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。在发育毒性评价中,采用大鼠全胚胎培养模型评价PM_2.5的体外胚胎发育毒性,采用Mito-Sox荧光探针结合流式细胞技术检测胚胎细胞线粒体的ROS水平,采用TUNEL法评价胚胎细胞的凋亡情况。结果 在细胞毒性评价中,透射电镜结果显示,随PM_2.5染毒剂量的增加,细胞器损伤逐渐加重,出现线粒体肿胀甚至空泡化、内质网扩张等改变;此外,Beas-2B细胞胞浆中可见大量被包裹的PM_2.5颗粒。MTT和LDH漏出检测结果显示,PM_2.5明显抑制了Beas-2B细胞的增殖(≥12.5 mg·L^-1),增加了LDH漏出(≥25 mg·L^-1)。随染毒剂量增加,PM_2.5诱导细胞内ROS生成增多,胞内总SOD活性降低,蛋白质、脂质和DNA氧化损伤加重。流式细胞术检测结果显示,PM_2.5染毒后Beas-2B细胞发生G₁期阻滞,但未引起细胞凋亡。发育毒性评价结果显示,随PM_2.5染毒剂量的增大(≥25 mg·L^-1),大鼠体外胚胎的卵黄囊直径、头长、头臀长和体节数明显减少,形态学评分显著降低,表现为胚胎前、中、后脑、神经管、心脏、视觉、听觉、嗅觉、鳃弓和前肢芽等器官的发育评分普遍降低,提示PM_2.5明显抑制了胚胎的整体生长发育,并无特异靶器官。经S9体外转化后,PM_2.5对胚胎生长发育的影响无明显增强。Mito-Sox荧光探针检测显示,PM_2.5作用于胚胎24 h后,胚胎细胞ROS生成显著增加;TUNEL检测结果显示,PM_2.5作用于胚胎48 h后,胚胎细胞的凋亡率明显增加。结论 汉口PM_2.5具有明显的细胞毒性和体外胚胎发育毒性。PM_2.5可能通过增加线粒体ROS水平、引起细胞生物大分子氧化损伤和G₁期阻滞而诱导细胞毒性;通过引起胚胎氧化损伤、增加胚胎细胞凋亡而诱导胚胎发育毒性。
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  T2.42 N-乙酰半胱氨酸对微囊藻毒素-LR诱导中国仓鼠卵巢细胞凋亡的影响及其机制

  杨明峰;张慧珍

  2013, 27(S1): 48-48.

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  目的 研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对微囊藻毒素-LR(MC-LR)诱导中国仓鼠卵巢(CHO)细胞凋亡的影响及其机制。方法 调整细胞密度为1×10⁵ ml^-1,置于12孔板贴壁生长24 h后,用不同浓度的 NAC(0、1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60和80 mmol·L^-1)处理细胞,或者不同浓度的NAC(0, 1和5 mmol·L^-1)和不同浓度的 MC-LR(0, 2.5, 5和10 mg·L^-1)共同处理细胞24 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,2, 7-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)含量,四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(JC-1)荧光探针法检测线粒体膜电位(MMP),荧光分光光度法检测丙二醛(MDA)含量,酶标仪法检测超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽还原酶(GR),谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和胱天蛋白酶3的活性,AnnexinⅤ-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 NAC 1和5 mmol·L^-1单独作用于细胞,细胞存活率均在80%以上;当MC-LR单独处理细胞时,随着MC-LR浓度的升高,细胞活性减少,ROS生成增加,MMP降低, MDA含量增加,抗氧化物酶SOD, GR, GSH-px活力降低,胱天蛋白酶3活性增加及凋亡率增加, 且差异性具有统计学意义(P<0.05);在同一MC-LR浓度下,加NAC组与不加NAC组相比,细胞活性增加,ROS生成减少,MMP上升,抗氧化物酶SOD, GR, GSH-px活力恢复,胱天蛋白酶3活性抑制,凋亡率减少,且差异性具有统计学意义(P<0.05)。结论 MC-LR可诱导CHO细胞产生大量ROS,抑制抗氧化酶活性,激活胱天蛋白酶3及细胞凋亡。NAC能明显抑制MC-LR诱导的CHO细胞凋亡,其机制可能与抑制ROS产生,增强抗氧化能力有关。
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  T2.44 高砷煤烘玉米粉致大鼠遗传损伤作用

  汪希兰;张爱华;张璞;袁国辉

  2013, 27(S1): 49-49.

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  目的 探讨高砷煤烘烤玉米粉致大鼠遗传物质的损伤情况。方法 模拟燃煤污染型砷中毒病区居民接触砷的主要途径,采用贵州省燃煤污染型地方性砷中毒某病区的高砷煤烘烤玉米粉,以其为主要原料加工制备含砷饲料喂饲大鼠,建立砷中毒模型。选择健康断乳的Wistar大鼠40只,随机分为4组,每组10只,雌雄各半,包括低砷、中砷、高砷粮食污染组和对照组。分别给予25, 50和100 mg·kg^-1的含砷饲料和标准饲料喂饲3个月。实验结束后,采用微核实验、彗星实验和精子畸形实验分别检测大鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核率、肝细胞DNA彗星尾长和精子畸形率。结果 随着染砷剂量增加,大鼠PCE微核率、DNA彗星尾长和精子畸形率呈上升趋势;其中,中砷、高砷粮食污染组大鼠的PCE微核率和精子畸形率均明显高于对照组(P<0.05),低砷粮食污染组大鼠的PCE微核率和精子畸形率有增高趋势,但与对照组比较,差异无统计学意义(P >0.05);3个染砷剂量组大鼠的DNA彗星尾长均明显高于对照组(P<0.05)。结论 高砷煤烘玉米粉可诱导大鼠染色体、DNA损伤,具有潜在的遗传毒性。
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  T2.45 十溴联苯醚对雌性小鼠外周血淋巴细胞亚群表达的影响

  何国群;李志

  2013, 27(S1): 49-50.

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  目的 探讨持久性环境污染物十溴联苯醚(BDE-209)经口灌胃对小鼠外周血中T和B淋巴细胞亚群的影响。方法 将40只健康SPF级未怀孕雌性BALB/c小鼠按体重随机分为4组,分别为阴性对照(花生油)组和低(20 mg·kg^-1)、中(100 mg·kg^-1)、高(500 mg·kg^-1)剂量BDE-209染毒组,每组10只。采用经口灌胃方式进行给药,灌胃容量为0.01 ml·g^-1,每天1次,连续灌胃30 d。灌胃结束后,摘除小鼠一侧眼球获取外周血,应用流式细胞术测定外周血中T淋巴细胞亚群的CD3⁺淋巴细胞比例、CD3⁺CD4⁺淋巴细胞比例、CD3⁺CD8⁺淋巴细胞比例,并计算CD4⁺/CD8⁺比值;同时测定外周血中CD3^-CD19⁺ B淋巴细胞的比例。结果 与阴性对照组比较,中、高剂量组 BDE-209染毒组小鼠外周血中CD3⁺ T淋巴细胞比例明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01);中剂量组小鼠CD3⁺CD4⁺淋巴细胞比例明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量组小鼠CD3⁺CD8⁺淋巴细胞比例明显升高,差异有统计学意义(P<0.01), 而高剂量组小鼠CD3⁺CD8⁺淋巴细胞比例有升高的趋势,但差异无统计学意义(P﹥0.05);中剂量组小鼠CD4⁺/CD8⁺比值明显降低,差异有统计学意义(P<0.01), 而高剂量组小鼠CD4⁺/CD8⁺比值有降低的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);低、中、高剂量组外周血中CD3^-CD19⁺淋巴细胞比例均无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 BDE-209经口灌胃后可影响小鼠外周血T淋巴细胞亚群的表达,可能抑制小鼠的细胞免疫功能,但未发现BDE-209 对小鼠外周血B淋巴细胞亚群的表达产生影响。
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  T3.9 非临床安全性评价在新药早期研发中的作用

  王英;Lee GEIGER

  2013, 27(S1): 71-72.

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  近年来,为了降低药物开发的失败率,尽早终结毒性化合物,非临床药物安评部门在药物开发的一开始,即靶点选择阶段,就已介入新药的研发。非临床药物安评部门的专家们通过文献阅读,根据已有的转基因动物或阳性对照物的研究结果找出靶点调节后可能产生的安全隐患并为研究部门就靶点的选择提出建议。靶点选择之后,非临床药物安评部门将继续在今后的安评实验中继续关注哪些可能存在的安全隐患。在化合物优化阶段,非临床药物安评部门将开展一些列的体外药理活性分析实验(其中包括受体结合,离子通道,酶活性和药物载体等实验),早期心血管安评实验,基因毒理和普通毒理(耐受性)实验以便进一步研究候选化合物的安全性并为下一步的长期毒理实验设计和剂量选择提供依据。据悉,75%的药物副作用是剂量依赖性的,可以通过药理活性分析来预测。化合物的药理活性可以分为主要活性和次级活性。主要活性是化合物作用其意向靶标产生的,次级活性是由化合物与其意向靶标以外的靶标相互作用(即靶标外相互作用)而产生的。靶标外相互作用通常与药物的副作用有关。因此,及早鉴别并减少甚至消除候选药物的次级活性是减少药物副作用发生概率的关键。早期心血管安评实验,基因毒理和普通毒理(耐受性)实验是按照国际协调会议(ICH)指导原则,如ICH S7A4, ICH S7B5和ICH M3(R2)6,进行的。ICH指导原则唯一要求的体外药理活性分析实验是化合物对hERG通道的作用,hERG通道的抑制将引发QT间隙延长并进一步导致致死性心律失常(尖端扭转型室性心动过速)。
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  T1.23 非综合性唇腭裂发生的易感因素及其机制研究进展

  张吉梅;罗鹏;冯红超

  2013, 27(S1): 22-22.

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  非综合性唇腭裂(NSCL/P)是指不伴其他器官畸形的,不在综合征之内的唇裂、唇裂合并腭裂或单纯腭裂的总称。NSCL/P不仅严重影响面部美观,影响生长发育,导致上呼吸道感染,中耳炎,还可致哺乳期儿童营养不良。NSCL/P作为一种先天性畸形,是一种多基因易感性疾病。是胚胎在发育过程中, 由许多微小基因协调作用并与环境因素共同作用,而导致上唇和上腭的发育受阻的结果。由于致病因素及其机制的复杂性,目前人类对该病的研究还处于探索阶段。本文主要就对其发病易感因素及发生机制的最新研究进展进行综述。
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  T1.24 铝与苯并[a]芘联合作用致神经细胞损伤的作用机制

  殷金珠;牛侨

  2013, 27(S1): 22-23.

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  目的 通过研究铝和苯并[a]芘联合染毒对大鼠神经元细胞的影响,探索两种毒物共同作用下致神经细胞损伤的作用机制。方法 采用新生的SD大鼠进行原代神经元细胞培养,培养5 d后,选取生长良好的同批次细胞,分为9组对照组(DMSO+S9+maltol)、染苯并[a]芘组(B[a]P 5和40 μmol·L^-1)、染铝组(Al(mal)₃ 50和100 μmol·L^-1)、联合作用组(Al(mal)₃ 50 μmol·L^-1+B[a]P 5 μmol·L^-1,Al(mal)₃ 50 μmol·L^-1+B[a]P 40 μmol·L^-1,Al(mal)₃ 100 μmol·L^-1+B[a]P 40 μmol·L^-1,Al(mal)₃ 100 μmol·L^-1+B[a]P 40 μmol·L^-1),继续培养72 h后电镜观察不同实验组神经细胞凋亡形态学变化,采用CCK8法检测细胞活力变化,流式细胞仪AnnexinⅤ-PI 双染法定量检测神经元凋亡率的变化。结果 ① 透射电镜和荧光倒置显微镜下观察,可以看到高剂量下的单独染苯并[a]芘组、染铝组神经元细胞出现核膜皱缩,胞质致密,核染色质边集等细胞凋亡的经典形态学变化;联合作用组均出现了明显凋亡形态学变化。② 细胞活力测定结果:与空白对照组相比,B[a]P 40 μmol·L^-1组、Al(mal)₃ 100 μmol·L^-1组及所有联合作用组细胞活力降低(P<0.05),析因分析表明,B[a]P和Al(mal)₃及联合对原代培养的神经细胞损伤的影响有显著性意义。③ 细胞凋亡率测定结果显示,与对照组相比,低剂量单独染苯并[a]芘组、染铝组均没有统计学意义(P >0.05);高剂量单独染苯并[a]芘、染铝组凋亡率差别有统计学意义(P<0.05);联合作用组各指标差别均有明显统计学意义(P<0.05)。结论 铝和苯并[a]芘联合染毒对神经细胞凋亡具有联合作用,作用类型为协同作用。
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  T2.47 自噬在DEHP致甲状腺毒性作用中的机制

  胡帅尔;张紫虹;杨美玲;李文立;黄建康;陆彦;王凤岩;董活波

  2013, 27(S1): 50-51.

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  目的 探讨自噬在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)致雄性大鼠甲状腺毒性作用中的机制。方法 SD种雄性大鼠24只,随机分为4组,每组6只。用50.0, 158.2和500.0 mg·kg^-1 BW DEHP连续灌胃染毒四周,动态观察大鼠的一般情况和体重变化;检测不同浓度DEHP染毒后大鼠血清中三碘甲状腺原氨酸(T₃)、四碘甲状腺原氨酸(T₄)及促甲状腺素(TSH)的变化情况及甲状腺组织病理改变;测定大鼠血清、甲状腺组织中超氧化物歧化酶(SOD)及活性氧(ROS)水平;Western blot检测LC3和p62蛋白表达变化。结果 DEHP染毒后,大鼠体重无明显变化。光镜下可见高剂量组甲状腺滤泡体积变小,腔内胶质密度下降,低、中剂量组甲状腺组织与对照组比较没有明显差异。DEHP高剂量染毒组大鼠血清T₃和T₄水平显著低于对照组(P<0.05)。高剂量组血清及甲状腺组织SOD活性下降,而ROS升高,与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。Western蛋白质印迹法检测结果显示,DEHP作用后甲状腺组织自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达水平随作用浓度升高显著增加;p62蛋白表达水平随作用浓度升高而显著下降,中、高剂量组LC3-Ⅱ和p62蛋白表达与对照组相比有显著性差异(P<0.01),提示DEHP可以显著上调大鼠甲状腺组织的自噬活性。相关性分析结果显示ROS与LC3Ⅱ蛋白表达成正相关,与p62蛋白表达成负相关。结论 DEHP可通过氧化应激引起甲状腺功能减退,同时诱导机体的自噬反应,进而降低ROS对细胞的毒性伤害,提示自噬是DEHP致甲状腺毒性作用中的自我保护机制。
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  T2.48 草甘膦对GC-1小鼠精原细胞的毒性作用及N-乙酰半胱氨酸的干预效应

  曾明;黄婷;易吉平;钟才高;关岚;王安;刘新民

  2013, 27(S1): 51-51.

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  目的 为探讨41%草甘膦水溶液(农达)对雄性生殖细胞的毒性及其作用机制,以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)的干预效应。方法 GC-1小鼠精原细胞为受试细胞,设正常对照组、草甘膦染毒组(60, 90, 120, 150和180 mg·L^-1)、NAC干预组(10 μmol·L^-1 NAC+90 mg·L^-1农达)。MTT法检测细胞存活率,姬姆萨染色观察细胞的形态学改变,彗星实验检测细胞DNA损伤,比色法检测细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)以及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)的变化。结果 随着草甘膦染毒浓度增加,细胞存活率逐渐下降(P<0.01), 彗星阳性率逐渐升高(P<0.01);与对照组相比,草甘膦染毒组LDH活性增加(P<0.05,60 mg·L^-1组除外),MDA生成增多(P<0.05)、GSH含量降低(P<0.05)和SOD活性降低(P<0.05)。加入抗氧化剂NAC预处理后具有相应的拮抗作用。结论 草甘膦对GC-1细胞有明显的损伤作用,其机制可能是草甘膦诱导氧化应激,导致细胞通透性增加和DNA损伤。抗氧化剂NAC对草甘膦的细胞毒性具有一定保护作用。
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  T1.26 SET在乳腺癌中的生物学作用

  李杰;任晓虎;黄培武;洪文旭;杨细飞;刘建军

  2013, 27(S1): 23-24.

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  目的 探讨SET基因对乳腺癌细胞转移及侵袭的影响。方法 培养MDA-MB-231细胞,利用慢病毒介导的RNA干扰技术构建SET缺陷表达的乳腺癌细胞株;利用MTT吸光度与细胞数目之间的关系绘制细胞生长曲线,并利用公式计算细胞倍增时间;采用划痕实验观察肿瘤细胞迁移能力的改变,并利用Transwell实验再次检测SET缺陷对肿瘤细胞迁移能力的影响;利用Transwell实验检测肿瘤细胞侵袭能力的改变。结果 首先利用慢病毒介导的RNA干扰技术成功构建了SET干扰重组质粒,筛选并得到了稳定干扰SET的乳腺癌细胞。然后以乳腺癌细胞、SET缺陷乳腺癌细胞及空白质粒对照组乳腺癌细胞为受试细胞,探讨了SET改变与乳腺癌细胞的细胞增殖、肿瘤细胞迁移及肿瘤细胞侵袭等之间的相互关系。MTT实验结果显示,慢病毒介导的SET的缺陷表达显著性降低了乳腺癌细胞的增殖能力;划痕实验与Transwell实验结果均表明SET的下调表达显著性抑制了肿瘤细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验显示SET缺陷显著抑制了肿瘤细胞的侵袭能力。结论 SET可能通过不同途径参与了人体乳腺癌细胞形成、发生、发展的全过程。
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  T2.50 孕烷X受体参与外源化学物诱导人肝L02细胞坏死性凋亡

  廖昆;高艳芳;夏斌;张玉静;殷花;何承勇;林育纯;林忠宁;

  2013, 27(S1): 52-52.

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  目的 筛查诱导坏死性凋亡的外源化学物,并探讨孕烷X受体(PXR)在外源化学物诱导人肝细胞坏死性凋亡中的作用。方法 采用永生化人正常肝L02细胞,利用Nec-1(30 mol·L^-1)作为坏死性凋亡抑制剂建立细胞模型进行体外实验;MTT法检测外源受试物(包括CdCl₂, ZnSO₄, TMT, AFB1, DEHP和MEHP等)处理48 h后的细胞增殖抑制作用;进一步采用NR1I2基因稳定转染建立PXR高表达的L02-PXR细胞,检测各细胞株中PXR蛋白水平,以L02-pB为空载体对照细胞,同上受试物处理后,MTT法检测细胞毒性反应。结果 各种受试物处理组L02细胞,与对照组相比,在单独Nec-1处理组细胞增殖抑制率为(16.44±2.38)% (P<0.01),呈明显细胞毒性;在CdCl₂(20 mol·L^-1), TMT(60 mol·L^-1), AFB1(60 mol·L^-1)组或DEHP(80 mol·L^-1)与AFB1(30 mol·L^-1)联合暴露对L02细胞增殖抑制率分别为(83.49±2.44)%, (67.07±1.15)%, (26.30±2.17)%和(27.24±5.2)%,未见Nec-1引起各处理组细胞死亡的降低(P>0.05);但Nec-1使MEHP(100 mol·L^-1)与AFB1(30 mol·L^-1)联合处理组细胞抑制率(29.27±2.57)%显著降低至(18.51±2.07)%(P<0.001)。与L02-pB细胞相比,DEHP(160 mol·L^-1)和MEHP(200 mol·L^-1)组L02-PXR细胞增殖抑制率分别为(3.56±2.90)%和(2.95±1.24)%,呈显著性降低(P<0.01);而AFB1(60 mol·L^-1)处理组L02-PXR细胞增殖抑制率增加到(31.55±2.88)%(P<0.05),且Nec-1使AFB1组细胞增殖抑制率降低至(23.39±1.20)%(P<0.01)。结论 不同外源受试物(包括CdCl₂, TMT, AFB1等)诱导肝细胞毒性未见与坏死性凋亡有关;PXR参与DEHP, MEHP或AFB1诱导的肝细胞增殖功能的差异,并且与AFB1诱导肝细胞坏死性凋亡有关。提示PXR参与不同外源化学物经由坏死性凋亡介导的差异性细胞毒性转归。
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  T2.7 三氯生通过DNMT1-MeCP2通路诱导HepG2细胞的全基因组DNA甲基化降低

  马慧敏;潘尚霞;郑刘进;黎玉华;曾柳丹;于志强;张干;盛国英;傅家谟

  2013, 27(S1): 29-29.

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  目的 探索三氯生诱导的肝肿瘤的可能作用机制。方法 高浓度(1.25, 2.5, 5,和10 μmol·L^-1)和环境相关浓度(0.625~5 nmol·L^-1)三氯生分别暴露HepG2细胞24 h和2周,其中恢复实验选择5 nmol·L^-1暴露组细胞在正常培养液中继续培养2周。① 利用HPLC-MS/MS检测全基因组DNA甲基化的改变和8-OHdG的水平变化,DNA甲基化抑制剂5-AZA暴露为阳性对照;② 荧光定量PCR检测DNA甲基化转移酶(DNMT)(包括DNMT1, DNMT3a和DNMT3b)和MeCP2的基因表达改变;③ Western blotting检测DNMT1, DNMT3a, DNMT3b和MeCP2的蛋白表达改变;④ 检测DNMT的活性改变和甲基化DNA结合蛋白(HDAC)的活性改变,AZA和HDAC酶抑制剂TSA暴露为阳性对照。结果 虽然在恢复实验中,5 nmol·L^-1的三氯生暴露的细胞组全基因组DNA甲基化恢复正常,高浓度和环境相关浓度三氯生在短期和长期暴露下都显著下调了HepG2细胞的全基因组DNA甲基化水平;由于MeCP2蛋白通过与DNMT1的相互作用而维持了细胞的全基因组DNA甲基化水平,实验结果显示三氯生下调了DNMT1和MeCP2的基因和蛋白表达,加上DNMT1和DNMT的酶活性显著降低都暗示了三氯生的作用途径可能是DNMT1-MeCP2信号通路,同时MeCP2蛋白是精神性疾病Rett的关键蛋白,暗示三氯生可能与神经系统紊乱相关;同时8-OHdG的显著升高,可能是通过空间位阻效应减低了DNMT1的活性和结合力;而三氯生引起的HDAC活性的减低,可能会通过泛素依赖信号通路诱导了DNMT1的降解。结论 高浓度和环境相关浓度三氯生诱导了HepG2细胞的全基因组DNA甲基化显著降低,可能是通过信号通路DNMT1-MeCP2而引起的,这一途径可能是三氯生引起的肝肿瘤的作用途径。
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  T2.10 长期低剂量摄入噻唑膦原药对大鼠毒性作用

  李本长;邓磊;周宁

  2013, 27(S1): 31-31.

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  目的 研究长期低剂量摄入噻唑膦原药对大鼠的毒性作用,确定其最大无作用剂量,为安全生产及慢性毒性实验提供剂量参考。方法 将80只SD大鼠(雌雄各半)按体重随机分为4组,分别为噻唑膦原药0.8 mg·kg^-1组、4.0 mg·kg^-1组、20.0 mg·kg^-1和正常对照组。在实验结束后处死实验大鼠,同时检测血液学、血清生化、体重和脏器系数等指标,并对结果进行统计学处理。结果 高剂量组雄、雌性大鼠体质量增长缓慢,雄性大鼠高剂量组TG明显低于对照组,雌性大鼠高剂量组ALP明显高于对照组,雌性大鼠高剂量组TP, ALB, TBIL, CREA, GLU明显低于对照组,雌性大鼠低、中、高剂量组CHE明显低于对照组,且有剂量效应关系;雄性大鼠高剂量组脑、肺、肾、肾上腺、睾丸的脏器重量系数明显高于对照组,雌性大鼠高剂量组脑、肺、肾的脏器重量系数明显高于对照组,高剂量组的卵巢子宫的脏器重量系数明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论 噻唑膦原药对雄、雌性大鼠经口染毒剂量为20.0 mg·kg^-1及以上时,对大鼠有毒性效应;长期低剂量摄入烯草酮原药对大鼠最大无作用剂量为4 mg·kg^-1。
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  T3.53 安全药理学遥测仪器计算机化系统验证及试验要点分析

  宋浩亮;顾性初;徐敏;孙洪华

  2013, 27(S1): 95-96.

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  目的 通过对安全药理学遥测仪器(植入式和马甲式)进行全面的计算机化系统验证以及对动物手术、术后护理、试验开展和数据分析等要点的分析,研究建立符合GLP法规和新药注册申报要求的安全药理学遥测技术平台,为新药研发的安全药理学研究提供规范的技术支持。方法 本课题分两部分(1)计算机化系统验证:遵循国家食品药品监督管理总局《非临床研究质量管理规范》和美国21号联邦法案第58部分(非临床研究良好实验室规范)和第11部分(电子记录和电子签名),进行安全药理学遥测仪器(植入式和马甲式)计算机化系统验证。通过成立验证小组进行职责分工、主计划文件、用户需求(URS)、供应商评估、验证计划(validation plan)、验证方案(protocols)、测试脚本(test scripts)、矩阵跟踪(traceability matrix)、安全计划及安全水平设置、差距分析、安装验证(IQ)、运行验证(OQ)、标准操作规程(SOP)、性能验证(PQ)、灾难恢复计划(DRP)、业务连续性(BCP)、验证总结报告等文件的撰写和执行进行计算机化系统验证。(2)建立Beagle犬植入式遥测系统和食蟹猴马甲式遥测系统,开展了超过25项用于新药注册申报的安全药理学研究课题,研究课题通过遥测系统连续监测清醒动物在笼内自由活动状态下至少26小时的心电、血压和呼吸等生理指标。在对这些指标进行归纳和整理的基础上,探讨和分析安全药理学实验室布局、动物(Beagle犬和食蟹猴)选择、术前准备、手术方法、术后护理、用于安全药理学动物的日常管理等环节需要注意的要点以及安全药理学试验数据分析及异常数据的处理等方面遇到的问题及解决方案。结果 (1)安全药理学遥测仪器(植入式和马甲式)通过了计算机化系统验证,可以进行GLP试验研究,验证过程同时使实验人员正确熟练地操作该系统。通过验证,从技术和法规角度保证了遥测系统的正常应用、数据真实可靠。(2)通过对试验要点的分析,成功保障安全药理学植入式遥测系统和马甲式遥测系统技术平台的顺利使用,数据稳定可靠。结论 新药研发对安全药理学的研究不仅仅局限于技术要求,同时需满足GLP法规。通过全面的计算机化系统验证,使遥测系统在技术和法规方面符合新药申报的要求;同时遥测系统试验的要点分析,使这一技术更加成熟,日臻完善,为新药研发的安全药理学研究提供规范的技术支持和保证。
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  T3.54 药物生殖发育毒性评价整合策略

  张丽;彭双清

  2013, 27(S1): 96-96.

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  将生殖发育毒性试验整合到3~6月重复给药毒性试验中进行可以减少动物的用量,符合3R原则,也省时省力;还可以从同一个动物身上得到有关药物毒性、代谢过程、毒代动力学等完整的信息,有利于进行整体毒性评价。生殖能力评价分三种,即雌、雄都给药、仅雌性给药和仅雄性给药,均可以有效地整合到一般毒性试验中。若雌、雄都给药,如果生殖能力降低,则需要将此批雄性动物和未给药的雌性动物交配,来确定影响来自于哪一方;但传统的复合设计,不再用雌性动物与未给药的雄性动物交配来验证药物对雌性动物生育能力的影响而只是进行推论。联合试验设计与传统方法不同,不仅要观察生殖能力,还要进行临床病理、组织病理和毒代动力学检测。按照ICH S5(R2)生殖毒性试验要求,生殖毒性评估整合到3~6个月重复给药毒性试验中要求达到以下要求:每组动物数量要足够;性成熟动物交配前给药2~9周;1比1交配;有足够的雄性动物在雌性孕后进行解剖观察;每天临床观察;每周两次体重称量;每周一次摄食量(交配期外)称量;交配期阴道涂片;其他观察指标,如临床病理,尿检等;大体病理观察和畸形器官及生殖器官的病理检查;精子评估(计数,活动度和形态)等。此外,整合中还要需要考虑以下问题:① 试验采取的策略要得当,要结合所有可获得的生殖发育毒性、药物毒理学特性等资料来选择最合适的试验策略。② 动物数量要足够,要能同时满足两个实验的研究要求。③ 剂量选择要合适,要综合考虑两者所需要的药物剂量。④ 取样组织和时间要周全,一个组织可能同时要用于两个试验,在量的分配和取样时间一致上必须要综合考虑。⑤ 整合条件及技术能力要达标,如动物种属和年龄选择、在毒性终点检测时能力、在结果分析综合能力等。
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  T2.12 百草枯对鲤鱼的免疫毒性作用

  马军国;李效宇

  2013, 27(S1): 32-32.

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  目的 评价水体中百草枯对鱼类及水体生态系统的影响。方法 商业用百草枯水剂,有效成分含量200 g·L^-1,采用改进的寇氏法检测百草枯对鲤鱼(8.14±1.37)g的急性毒性,分别选取1/10和1/5 72 h-LC₅₀百草枯暴露鲤鱼,并于1, 3, 7 d取材,通过ELISA方法和荧光定量PCR方法分别检测鲤鱼肝、胰、肾和脾的白介素-1β (IL-1β)、干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白M (IgM)、溶菌酶和补体3(C3)的含量及其基因的表达情况;同时采用组织学方法检测了鲤鱼肝、胰、肾、脾、肠、鳃和尾鳍的组织病理学变化。结果 百草枯对鲤鱼的72 h-LC₅₀为15.962 mg·L^-1,置信区间为(15.018~17.005),置信度95%。百草枯亚急性毒性实验结果表明,百草枯处理对鲤鱼肝、胰、肾和脾的IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IgM和C3的表达有明显的影响,但对其蛋白含量和基因转录的影响并不完全一致,例如处理组肝胰TNF-α蛋白含量均显著高于对照组,然而其基因相对表达量却在第1天下降,这种蛋白水平与转录水平的不一致有可能是由于百草枯的影响而导致该基因转录后修饰和调控的结果。处理组溶菌酶活力先升高 (1-3 d) 而后下降 (7 d),其基因相对表达量也是先上升后下降,因此百草枯处理后,鲤鱼免疫器官溶菌酶活性与基因转录水平表现出较好的一致性。组织病理学检测发现,1/5 72 h-LC₅₀百草枯暴露鲤鱼7 d,与对照组相比,鲤鱼的肝、胰、肾、脾、肠、鳃和尾鳍均有一定的组织损伤,特别是肠、鳃和尾鳍损伤最为严重。处理组鲤鱼肠肌层损伤、浆膜破坏、细胞空泡化;鳃丝上皮膨大、软骨核心组织损伤、鳃丝融合;尾鳍鳍条血管损伤、韧带和表皮坏死、生发层空泡化、上皮细胞核致密化。结论 百草枯对鲤鱼的急性毒性为中毒-高毒;百草枯对鲤鱼还具有免疫毒性,不仅干扰鲤鱼免疫因子和细胞因子的表达,而且损伤鲤鱼免疫相关器官。
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  T2.52 长江三角洲流域百菌清水生生物基准

  周军英;王香兰;梁霞;王蕾;葛峰;孙红英;单正军

  2013, 27(S1): 53-53.

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  水生生物基准是制订水质标准的基础和科学依据,而水质标准是实施水环境管理的重要依据。我国是农药生产和使用大国,农药生产过程中的点源排放和农药使用过程中的面源排放势必会对水环境产生不利影响。但我国农药水生生物基准的研究基本处于空白。长江三角洲流域水系发达,水生生物种类繁多。更重要的是,长江三角洲流域是我国农药生产企业最为集中的地区,也是我国农药使用量最大的地区之一。百菌清是一种非内吸性广谱杀菌剂,对水生生物毒性非常高,属于高风险农药品种,在长江三角洲流域广泛使用。本研究开展长江三角洲流域百菌清水生生物基准研究,旨在为百菌清的风险评价和我国农药水质标准的制订提供科学依据。研究选择长江三角洲流域14种代表性水生生物-大乳头水螅、中华圆田螺、狭萝卜螺、大型溞、长江华溪蟹、中华绒鳌蟹、日本沼虾、银鲫、黄颡鱼华大蟾蜍、泽陆蛙、蛋白核小球藻、浮萍、紫萍,分别开展急性毒性和慢性毒性试验,得到百菌清对上述生物的毒性终点值。然后分别采用评价因子法、物种敏感度分布法和毒性百分数排序法三种方法推导长江三角洲流域百菌清水生生物基准值。结果显示,评价因子法、物种敏感度分布法和毒性百分数排序法得出的急性基准值分别是0.065, 0.94和0.48 μg·L^-1,慢性基准值分别是0.007, 0.10和0.10 μg·L^-1。比较了三种方法得出的基准值之间的差异并分析了产生差别的原因,同时将得到的基准值与加拿大百菌清基准值进行了比较。研究结果将为我国农药水质标准的修订及农药水生生态风险评价提供科学依据。
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  T2.20 IL-6通过STAT3/miR-21调控炎症反应在亚砷酸钠所致HBE细胞恶性转化中的作用

  罗菲;徐媛;赵越;徐文超;庞瑛;申璐;周建伟;王心如;刘起展

  2013, 27(S1): 36-36.

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  目的 研究白介素6(IL-6)调控信号转导与转录激活子3(STAT3)/微小RNA-21(miR-21)在低水平亚砷酸钠(NaAsO₂)诱导炎症反应所致支气管上皮(HBE)细胞恶性转化中的作用,为寻找砷化物致癌的早期生物学标志及发现新的防治措施提供新的线索。方法 NaAsO₂ 1.0 μmol·L^-1处理HBE细胞不同时间后,逆转录PCR(RT-PCR)检测IL-6 mRNA水平,Western blot检测细胞STAT3蛋白水平,实时定量PCR(qRT-PCR)检测细胞miR-21水平及其变化情况;并应用siRNA关闭STAT3、转染anti-miR-21下调miR-21及应用IL-6中和抗体阻滞IL-6后,进一步观察恶性转化HBE细胞STAT3, vimentin, N钙黏蛋白和E钙黏蛋白水平及miR-21水平,并应用免疫荧光染色检测vimentin, N钙黏蛋白和E钙黏蛋白表达水平及细胞定位。结果 1.0 μmol·L^-1 NaAsO₂引起HBE细胞IL-6 mRNA水平升高,且NaAsO₂处理HBE细胞15, 30 min, 1, 3, 6, 12和24 h后,STAT3能被NaAsO₂瞬时被激活;STAT3水平3 h明显升高,并于6 h达到高峰;在处理3, 6, 12和24 h后,HBE细胞miR-21水平升高,其高峰表现在12 h;并且在NaAsO₂所致慢性恶性转化HBE细胞miR-21水平随着细胞代数(恶性程度)增加而逐渐升高;应用siRNA关闭STAT3后,细胞miR-21水平也随之降低;应用IL-6中和抗体阻滞IL-6后,细胞STAT3和miR-21水平均显著低;IL-6中和抗体处理处理30代恶性转化HBE细胞后,其EMT发生明显逆转,即间质细胞标志vimentin和N钙黏蛋白水平明显降低,而上皮细胞标志E钙黏蛋白水平升高,说明发生了EMT现象,而且细胞恶性程度也明显降低。结论 IL-6通过STAT3/miR-21调控炎症反应在亚砷酸钠所致HBE细胞发生EMT和恶性转化过程中发挥重要作用。
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  T12.7 锌对氟砷联合染毒大鼠骨代谢毒性的干预作用

  徐德淦;洪峰

  2013, 27(S1): 240-241.

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  目的 观察氟砷单独、联合染毒大鼠及锌干预后大鼠体内氟、砷负荷变化及骨钙素、骨涎蛋白改变情况,分析锌对氟砷联合染毒大鼠的氟砷蓄积和排泄的影响及骨代谢毒性的干预作用。方法 SD大鼠按体重随机分成对照组、低氟组(NaF: 5 mg·kg^-1)、低砷组(NaAsO₂: 2.5 mg·kg^-1)、低氟+低砷组、高氟组(NaF: 20 mg·kg^-1)、高砷组(NaAsO₂: 10 mg·kg^-1)、高氟+高砷组、高氟+锌组(ZnSO₄·7H₂O: 14.8 mg·kg^-1)、高砷+锌组、高氟+高砷+锌组共10组。灌胃染毒,每日给药1次,每周5 d,连续6个月。每周根据体重调整灌胃量,对照组给予蒸馏水,实验期间动物自由饮食。实验末收集大鼠24 h尿液,测定尿氟(氟离子选择电极法)、尿砷(氢化物发生器-电感耦合等离子体离子发射光谱法)含量;大鼠处死前观察牙齿色素及磨损情况;腹腔注射0.9%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠后心脏采集血样,离心分离血清,Elisa法检测骨钙素(OCN)、骨涎蛋白(BSP),检测血清砷含量;取大鼠右侧股骨,测定骨氟、骨砷含量。结果 (1)各组大鼠整个实验期间体重变化均无显著性差异(P >0.05);(2)含氟剂量组患有不同程度的氟斑牙,其中低氟组、低氟低砷组、高氟组、高氟+高砷组、高氟+锌组、高氟+高砷+锌组大鼠氟斑牙的病损程度较对照组严重,氟斑牙度数分布构成比与对照组比较有统计学差异(χ²值分别为8.57, 9.18, 11.61, 12.34, 11.84, 11.25,P<0.01),高氟+高砷+锌组大鼠氟斑牙程度较高氟+高砷组明显减轻(χ²=11.25,P<0.01);(3)干预组血清与骨中氟、砷含量均低于相应的高剂量染毒组,但无统计学意义(P >0.05),高氟+高砷+锌组尿砷(UAs)含量高于高氟+高砷组(P<0.01);(4)高氟+锌组血清OCN、BSP浓度明显低于高氟组(P<0.01),高氟+高砷+锌组血清OCN浓度明显低于高氟高砷组(P<0.05)。结论 (1)一定剂量的锌可以减轻氟砷联合染毒大鼠氟斑牙的发生程度;(2)一定剂量的锌可以促进氟砷联合染毒大鼠砷的排泄,减少氟砷在机体内的蓄积;(3)一定剂量的锌可抑制氟中毒导致OCN和BSP的高表达,进而拮抗氟对骨骼的毒性;(4)砷对大鼠成骨细胞活动没有产生明显的影响。
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  T14.24 Pig-a基因突变试验研究与应用进展

  李岩;霍娇;张立实

  2013, 27(S1): 281-282.

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  遗传毒性评估是化学品和药品安全性评价的重要组成部分,现有致突变试验虽已很多,但仍不能完全满足毒理学安全性评价和风险评估的要求。近几年来,一项新的体内致突变试验Pig-a基因突变试验受到广泛关注,该试验的检测终点为基因突变,且能够利用流式细胞术对人体突变细胞频率实现高通量检测。Pig-a基因位于人类X染色体,编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶复合物,参与糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白的早期合成。当Pig-a基因发生突变时,细胞不能正常合成GPI连接蛋白,致使造血干细胞最终分化的血细胞(包括红细胞等)表型缺失。 Hall等学者收集患者外周血,用荧光标记的单抗与细胞GPI连接蛋白反应,使用流式细胞术(FCM))检测未被荧光标记的突变细胞,根据表型缺失细胞的比例来诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。鉴于对PNH中Pig-a基因的研究以及FCM对Pig-a基因表型缺失的成功检测,不少学者期望使用Pig-a基因作为体细胞突变实验的报告基因。目前已建立两种方法测定Pig-a基因突变率:流式细胞术或有限稀释法。流式细胞术方法利用梯度离心液等方式富集目标细胞,利用荧光标记的抗体与目标细胞孵育,标记目标细胞,以及至少标记一种GPI连接蛋白标志物。之后利用散射光区分血小板、白细胞和红细胞,核酸染色还可用于区分正染红细胞和网织红细胞。另一种检测方法为有限稀释法。淋巴细胞能够将前气单胞菌溶素转变为气单胞菌溶素,气单胞菌溶素能够与正常细胞GPI连接蛋白结合,导致细胞膜完整性受损以致细胞死亡。而Pig-a基因发生突变的细胞GPI连接蛋白缺失,因此得以存活。该方法利用ProAER作为选择物质,使发生突变T淋巴细胞在96孔板内克隆性生长,而未突变的细胞死亡。Pig-a基因突变试验能够利用少量样本相对迅速地得到较为精确的结果,并节省实验室工作量。有学者将Pig-a基因突变试验、体内微核试验与28 d重复剂量染毒试验结合应用,通过收集不同时间点外周血,同时检测同一动物同一靶组织的非整倍体诱变剂、染色体断裂诱变剂和基因突变诱变剂。该整合方法不仅可比较化学物对同一动物造成的不同遗传学终点损伤,还可以研究重复染毒对突变频率的影响,并且大量节省实验动物,实验过程更为简便快捷。
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  T14.25 人乳头状瘤病毒16型E6E7基因与三种N-亚硝基化合物对诱导细胞恶性转化的协同作用

  武双;龚平;薛翊钧;李科文;刘震;虎燊;谢爱玲

  2013, 27(S1): 282-282.

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  目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16 E6E7基因与三种N-亚硝基化合物对BALB/c 3T3细胞恶性转化的协同作用。方法 从含HPV16全基因组序列的质粒上扩增HPV16 E6E7基因,与质粒载体pcDNA 3.1(+)相连构建重组质粒,使用FuGENE HD试剂将重组质粒转染BALB/c 3T3细胞,使用G418筛选获得阳性细胞克隆Balb-E6E7,采用RT-PCR和Western blot技术检测Balb-E6E7细胞中HPV16 E6E7基因和蛋白表达;应用细胞转化实验研究三种N-亚硝基化合物-司莫司汀、N-亚硝基二甲胺、N-甲基-N亚硝脲诱导Balb-E6E7细胞和BALB/c 3T3细胞的恶性转化,并检验转化细胞在软琼脂上形成集落的能力及对SCID鼠的致瘤能力。 结果 RT-PCR和Western blot检测结果表明HPV16 E6E7基因与蛋白均可在阳性克隆Balb-E6E7细胞中有效表达。Balb-E6E7细胞和BALB/c 3T3细胞在司莫司汀、N-亚硝基二甲胺、N-甲基-N亚硝脲的诱导下均会发生细胞转化,转化细胞表现出嗜碱深染、致密多层、丧失接触抑制、排列紊乱、转化灶边缘的细胞自由定向生长、向周围单层细胞侵袭生长等明显恶性特征。在相同N-亚硝基化合物的诱导下,Balb-E6E7细胞比BALB/c 3T3细胞形成的转化灶个数增加3~21倍,且形成转化灶的时间明显缩短,可缩短25%。将正常与转化细胞接种至软琼脂中比较其形成克隆的能力,以形成克隆个数多少、生长快慢和直径大小排序,其顺序依次为:阳性对照HeLa细胞、Balb-E6E7转化细胞、BALB/c 3T3转化细胞,其克隆形成率分别为:60.1%, 25.7%和5.2%。再分别将正常细胞、Balb-E6E7转化细胞与BALB/c 3T3转化细胞接种1×10⁷个至SCID鼠前肢皮下,每组3只,定期观察小鼠。正常BALB/c 3T3细胞未能在小鼠体内形成肿瘤,接种两种转化细胞的小鼠最终均可形成肿瘤,成瘤率为100%,4周时接种Balb-E6E7转化细胞与BALB/c 3T3转化细胞的小鼠肿瘤直径分别为1.6±0.5和(1.1±0.3) cm。结论 HPV16 E6E7基因与N-亚硝基化合物对诱导BALB/c 3T3细胞的恶性转化具有协同作用,它们可诱导更多细胞发生转化,增强细胞恶性程度,加速细胞癌变进程,从而为HPV、环境化学因素与肿瘤病因学的关系提供证据,对环境化学物、病毒等危险因子的评估和肿瘤预防具有一定意义。
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  T12.9 大蒜油对苯中毒致小鼠白细胞减少的预防作用

  徐子茜;王海瑞;陈亚飞;毛阁琦;胡月;谢克勤

  2013, 27(S1): 241-242.

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  目的 研究大蒜油对苯中毒引起的白细胞减少的预防作用。方法 SPF级雄性BALB/c小鼠120只,随机分为6组:正常对照组、苯中毒模型组、碳酸锂阳性对照组、大蒜油低、中、高剂量组 (n=20)。大蒜油各组小鼠每日分别经口给予大蒜油20, 40和80 mg·kg^-1,碳酸锂组动物给予15 mg·kg^-1的碳酸锂,其余2组动物给予等体积的蒸馏水;2 h后,除正常对照组外,其余各组动物均经口给予2 ml·kg^-1苯,连续21 d。第22天,各组动物眼球取血,CA500全自动血球计数仪测定红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)的数目以及血红蛋白(Hgb)的含量;分离肝和脾,称重并计算脏器系数;取胸骨,制备骨髓涂片,吉姆萨染色,观察并计数骨髓微核数目。结果 与对照组小鼠相比,苯中毒模型组小鼠外周血WBC下降了47.5(P<0.05)。与苯中毒模型组小鼠相比,中、高剂量大蒜油组小鼠外周血WBC分别升高了32.1%和45.1%(P<0.05),而碳酸锂组小鼠外周血WBC未见明显升高。各组小鼠外周血RBC, Hgb和PLT水平相比,无统计学差异。与对照组小鼠相比,苯中毒模型组小鼠脾重量显著降低,脾系数显著减小(P<0.05)。与模型组小鼠相比,中高剂量大蒜油组小鼠脾系数分别增加了36.1%和71.6%(P<0.05)。此外,大蒜油显著抑制了苯中毒引起的骨髓微核数目的增加。结论 大蒜油可显著抑制苯中毒引起的白细胞减少,其作用机制可能与其对骨髓的保护作用有关。
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  T9.5 纳米二氧化钛对神经细胞的毒性及机制

  冒志磊

  2013, 27(S1): 215-216.

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  目的 研究纳米二氧化钛对神经细胞的毒作用机制。方法 用MTT检测了实验剂量(0, 0.1, 1, 10和100 mg·L^-1)下纳米二氧化钛对细胞存在的影响,用流式细胞仪评价了纳米二氧化钛对细胞周期和凋亡的影响,并通过免疫荧光、Western blot、转染末端结合蛋白(EB3-GFP)研究了微管蛋白的表达、细胞骨架结构和微管动力学。同时观察了纳米二氧化钛对神经细胞迁移能力的影响。结果 实验剂量下,纳米二氧化钛不影响细胞的增殖,周期,会引起细胞凋亡。并且导致细胞突触减少、形态变圆。免疫荧光显示,微管排列紊乱、断裂、回缩、微管密度下降。Wester blot结果显示,游离的微管蛋白增加,与免疫荧光结果一致。同时细胞迁移实验显示,神经细胞迁移能力降低。结论 纳米二氧化钛可能通过与微管蛋白结合,引起微管蛋白空间构象改变,从而导致微管聚合障碍,同时作用于聚合的微管以及干扰微管相关蛋白的功能,导致微管骨架不稳定,解聚增强,最终导致微管功能障碍。
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  T19.19 氯仿的毒理学研究现状及氯仿残留的风险性评估

  陈志蓉;裴新荣;张凤兰;邢书霞

  2013, 27(S1): 351-351.

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  氯仿常用于化妆品香料的提取,或用于化妆品原料的合成,如卡波树脂的合成,因此易作为溶剂残留物存在于化妆品终产品中,如含有三氯生的化学物质,与经氯消毒的水接触后会生成氯仿。IARC(International Agency for Research on Cancer,国际癌症研究机构)已将其列为肯定的动物致癌物, 对人类则归为2B类, 即可疑致癌物。我国《化妆品卫生规范》(2007年版)2(1)化妆品禁用组分表中第338号禁用物质,但尚未规定残留限量值。本文通过整理分析国内外相关法规和文献,从化妆品中可能存在氯仿的分析,毒代动力学,毒理学特征(包括急性毒性、皮肤刺激、生殖毒性、胚胎毒性、遗传毒性、慢性毒性及致癌性、免疫毒性、皮肤毒性),临床表现,国内外法规标准管理,应急处理处置方法等方面介绍了氯仿毒理学研究现状。
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  T8.13 化学品GLP环保标准对生态毒理学测试的要求

  刘纯新;于丽娜;杨力

  2013, 27(S1): 212-212.

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  《危险化学品安全管理条例》(国务院令第591号)规定环保部组织鉴定化学品的环境危害性。《新化学物质环境管理办法》(环境保护部令第7号)规定"境内测试机构应当遵守环境保护部颁布的化学品测试合格实验室导则,并按照化学品测试导则或者化学品测试相关国家标准,开展新化学物质生态毒理学特性测试。"为了确保数据的真实、准确,环保部2010年立项组织制修订化学品测试合格实验室规范(GLP)导则,用来规范测试机构的质量管理体系,提高技术水平。该标准草案于2012年5月公开征求意见,2012年11月通过专家论证,即将送审。标准原则上与经济合作与发展组织(OECD)的GLP准则(ENV/MC/CHEM(98)17)一致。同时,针对生态毒理学测试的特点和中国测试机构的实际状况,作出具体的、可操作的规定。目的是只要测试机构符合本标准,就能符合国际GLP准则。生态毒理方面的主要规定包括:(1)项目负责人(SD)应熟悉HJ/T 153及相关生态毒理测试方法标准并通过环保部的技术考核;(2)测试设施和标准操作程序(SOPS)应确保受试生物与饲料、养分、土壤、辅助材料等供应品有效分隔;(3)受试生物应与藻类和水生动物的保种与繁殖、活性污泥的预培养区有效隔离;(4)确保废弃的试剂、受试物、参比物、生物等废物的收集、暂存、转移、处理和处置符合环保要求,且不影响测试项目的完整性;(5)应定期分析水生生物驯养用水水质和蚯蚓毒性试验供试土壤的基本理化性质,定期检查测试用的植物、生物降解用的接种物的活性状态;(6)对于要求测定受试物浓度的项目,应出具包括化学分析方法有效性在内的完整的分析测试报告。
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  T8.14 化学品GLP环保标准修订的思路和特点

  刘纯新;于丽娜;聂晶磊

  2013, 27(S1): 212-213.

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  经过近40年的发展,GLP已成为各国普遍采用的化学品测试质量管理规范、经济合作与发展组织(OECD)"安全性评价数据互认"(MAD)的前提和基础之一。各国所实施的GLP虽然在细节上有所区别,但基本要求都与OECD的GLP指南和符合性监督系列文件一致。我国于2009年启动申请加入MAD体系的工作。环境保护部作为我国化学品环境危害鉴定、新化学物质危害性鉴别的组织者和领导者,为防控化学品的环境危害、掌握高质量的化学品危害性数据;同时为顺应国内外的大形势,追赶国际先进水平,建立既符合OECD的规范,又满足我国管理需求的化学品GLP体系,立项修订环保标准《化学品测试合格实验室导则》(HJ/T 155-2004)为"化学品测试合格实验室规范导则"。化学品测试数据的质量至少包括真实性和准确性两方面。化学品种类繁多、性质各异,对测试技术要求高。发达国家是在化学品测试技术发展到相当高的程度时,为防止伪造数据,构建了GLP体系并立法保证实施,所以他们声称不关注实验室的技术能力,不关注测试项目设计的科学性和数据结果的准确性。更重要的是,发达国家的大型企业,往往拥有熟悉测试的专家团队,对委托测试项目全过程跟踪、评估,有助于保证测试数据的科学性、准确性。我国的化学品测试工作及相关学科的研究起步晚,多数测试机构在技术能力和质量管理体系两方面的水平较低。而且我国的化学品生产企业没有辨别、判断测试机构水平的能力和意识。在这种情况下,如果不从管理体系和技术能力两方面提高,测试数据的可靠性将难以保证,更不可能实现国际互认。因此,此次修订,坚持既重视质量体系,保证真实性,又关注技术能力,兼顾准确性的思路;达到只要测试机构符合本标准,就能符合国际GLP准则的目标。此次修订特点包括:(1)尽可能将国际GLP准则的要求转化为环保部对测试机构的要求;同时,针对我国化学品测试实际情况,对实验室的组织结构、人员、仪器设备、环境设施以及最终报告等方面提出了硬性要求,对项目负责人、测试人员和质量保证人员在专业背景、技术经历等方面提出了比OECD的GLP准则更具体、更严格的要求。(2)将多场所测试、计算机化系统两方面的管理纳入。(3)适当关注测试项目设计的科学性、测试操作的规范性以及相关人员的专业背景和技术经历,从而保证测试数据的可靠性。(4)为防止化学品测试造成新的污染、增加额外的风险,此次修订还增加了环境与健康安全措施及应急保障方面的规定。
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  T9.1 纳米材料在生物体内的转运及组织清除特征

  丰伟悦

  2013, 27(S1): 213-214.

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  深入了解纳米材料在生物体内的转运及体内清除特征是纳米材料安全性应用特别是生物医学应用的基础。纳米材料具有异质特征,既具有固体材料的性质又具有分子的流动性。我们通过实验证实纳米材料可以通过呼吸暴露、消化道吸收、皮肤暴露等方式进入血液循环并通过血液循环进入组织器官。纳米材料的物理化学特性,包括尺寸、形状、表面电荷、表面化学功能团和比表面积等对纳米材料在生物体体内的循环、组织器官的清除具有重要影响。对于纳米材料的生物医学研究,发展原位、实时和定量分析技术研究纳米材料在体内的代谢行为,并据此建立适当的、以生理学为基础的药代动力学和定量构效关系模型预测纳米材料的体内生物学行为将是下一步研究工作的重点。
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  T13.4 药物生殖毒性试验不同阶段阳性对照品给药条件

  周莉;姜娟;王永;崇立明;杨阳;王蓉;许丽;马爱翠;孙祖越

  2013, 27(S1): 244-245.

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  目的 建立药物非临床安全性评价生殖毒性试验各阶段阳性对照品模型,确定对大鼠和兔易感的给药条件,为生殖毒性试验阳性指标的判定提供依据。方法 采用不同的阳性对照品(环磷酰胺或丙基硫氧嘧啶),通过不同给药途径、采用不同的给药剂量、时间和频率诱导大鼠或兔生殖毒性实验不同阶段的阳性指征。具体如下: (1) Ⅰ段生殖毒性试验:分别于交配前给予环磷酰胺A组(1次,100 mg·kg^-1)和B组(5次,20 mg·kg^-1);(2) Ⅱ段生殖毒性试验:① 孕兔:环磷酰胺A组(18 mg·kg^-1,GD_6-20,ig)、B组(25 mg·kg^-1,GD_10-13,sc)和C组(15 mg·kg^-1,GD_6-18,im),3种方式;② 孕鼠:环磷酰胺A组(7 mg·kg^-1,GD_11-13,im),环磷酰胺B组(15 mg·kg^-1,GD₁₂单次皮下注射),2种方式。(3) Ⅲ段生殖毒性试验:孕鼠GD₆-PND₂₁给予丙基硫氧嘧啶(15 mg·kg^-1),至PND₂₁处死。结果 ① 环磷酰胺各组均可表现出着床后丢失率和吸收胎率增加(P<0.01),平均活胎数、活胎率、子宫连胎重降低(P<0.01)等阳性指征;② 环磷酰胺各组均可导致胎仔外观、内脏和骨骼畸形出现(93.3%~100%),胎仔体格和生长发育也受到明显影响(P<0.01)。③ F₀代哺乳能力弱,F₁代仔鼠体重、生殖能力(受孕率、出生存活率、窝平均数和窝平均体重等)、生理发育(出毛、门齿萌出、张耳、睁眼、龟头包皮腺裂开和张开的时间等指标)、反射发育(悬崖回避、瞳孔反射和听觉惊愕反射)、平衡协调和自发活动等指标均明显迟缓(P<0.05);F₁代断乳后,检测其生育能力,F₂代仔鼠观察指标同F₁代,F₂代仔鼠部分生殖能力指标仍然呈现迟缓趋势。结论 ① 环磷酰胺100 mg·kg^-1单次给药,为大鼠I段最佳易感阳性模型;② 环磷酰胺(18 mg·kg^-1灌胃GD₆-GD₂₀,每天1次,连续给予15 d)为家兔致畸的最佳易感阳性模型;环磷酰胺E组(15 mg·kg^-1,GD₁₂单次皮下注射)为大鼠最佳易感阳性模型;③ 大鼠GD₆-PND₂₁给予15 mg·kg^-1丙基硫氧嘧啶为Ⅲ段易感阳性模型。
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  T13.18 全氟辛烷磺酸盐对小鼠胚胎干细胞的毒性研究及机制探讨

  徐菠

  2013, 27(S1): 252-253.

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  目的 以小鼠胚胎干细胞(D3 mESC)为模型,从一般细胞毒性和mESCs的多能性改变两方面来评价全氟辛烷磺酸盐(PFOS)的生殖发育毒性,并进行相关分子机制的初步探讨,为PFOS的毒性评价提供线索。方法 MTT检测细胞活力,碱性磷酸酶染色检测细胞形态,碱性磷酸酶活性试剂盒检测AP活力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡, RT-PCR方法检测多能因子的基因表达水平,Western blot检测多能因子的蛋白水平,lipo2000转染miR-490-3p mimics/inhibitor之后,检测Nanog的基因和蛋白水平的改变。双荧光素酶报告基因实验确定miR-490-3p和Nanog之间的关系。结果 MTT结果显示,DMSO, PFOS(0.2, 2, 20和200 μmol·L^-1) 染毒mESC 24和48 h后, 均不影响细胞活力。不同剂量PFOS染毒mESC后,细胞形态,碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶活力,细胞周期和细胞凋亡均没有统计学差异的改变。多能因子Nanog,Sox2的基因和蛋白水平都显著下降,Oct4的基因和蛋白水平都没有改变。分别调控Nanog和Sox2的miRNA(miR-490-3p,miR-145)都上升,转染miR-490-3p mimics/inhibitor后,Nanog下降/上升。通过构建miR-490-3p-Nanog野生型和突变型质粒,转染后报告基因结果显示miR-490-3p直接调控Nanog,Nanog的宿主基因Chrm2在染毒之后上升。结论 PFOS染毒mESC后,多能因子Nanog和Sox2基因和蛋白水平都下降,Oct4基因和蛋白水平都没有改变,miR-490-3p能直接调控Nanog,宿主基因Chrm2可能会调控miR-490-3p。因此,PFOS染毒mESC后,多能因子Nanog的改变可能是由于Chrm2和miR-490-3p的共同调控导致的。
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  T13.47 Metabolomics reveals novel metabolic pathwaysLin relation to BPA toxicity

  CHEN Min-jian;XU Bin;QIAO Shan-lei;ZHOU Zuo-min;WANG Xin-ru;XIA Yan-kai

  2013, 27(S1): 267-268.

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  OBJECTIVE Toxicity induced by exposure to bisphenol A (BPA) has been widely reported. Studying metabolites variation holds promise for the discovery of mechanisms linked to BPA toxic effects. METHODS AND RESULTS Male Sprague-Dawley rats were orally administered doses of BPA at the levels of 0, 0.0005, 50 mg·kg^-1·d^-1 for 8 weeks. We used unbiased liquid chromatography (LC)-time-of-flight (TOF) and capillary electrophoresis (CE)-TOF metabolomics technique to discover, identify and analyze the variation of metabolites in testes and urine, respectively. In rat testes, by using multiple approaches, we identified linoleic acid (LA) and arachidonic acid (AA), two n-6 fatty acids, as potential testicular biomarkers. Decreased levels of LA, increased levels of AA and AA/LA ratio in testes were observed in exposed group. According to these suggestions, the levels of testicular antioxidant enzymes were detected. Testicular superoxide dismutase (SOD) declined significantly compared with that of the control, and the glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) also showed decreasing trend in BPA treated group. In rat urine, 199 named metabolites were profiled in rat urine. Various changes in metabolic pathways were observed including elevated nucleotide degradation, altered choline metabolism and vitamin metabolism. CONCLUSION BPA caused testicular n-6 fatty acid composition variation and decreased antioxidant capacity, which may be involved in its reproductive toxicity. The metabolic profiling in urine indicates that BPA exposure caused wide changes in lipid, nucleotide, carbohydrate and amino acid metabolism. This metabonomics study firstly showed the availability of metabolomic analysis in exploring BPA toxicity.
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  T14.1 上皮-间质转化和肿瘤干细胞特性获得在亚砷酸钠所致HaCaT细胞恶性转化中作用及其分子机制

  姜蓉蓉;李远;徐媛;庞瑛;申璐;赵越;周建伟;王心如;刘起展

  2013, 27(S1): 268-269.

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  目的 探讨亚砷酸钠诱导上皮-间质转化(EMT)过程中肿瘤干细胞(TSC)特性获得在亚砷酸钠(NaAsO₂)所致人皮肤角质(HaCaT)细胞恶性转化过程中的作用及其分子机制,为寻找砷化物致癌的早期生物学标志及发现新的防治措施提供新的线索。方法 应用显微镜检测细胞形态;软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验检测细胞检测细胞恶性程度和致瘤性;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测不同恶性程度HaCaT细胞的上皮细胞指标E钙黏着蛋白水平,间质细胞指标N钙黏着蛋白和波形蛋白水平,干细胞表面抗原CD34和K5 mRNA表达水平和悬浮细胞集落,NF-κB信号通路的p-IKKβ, p-IκBα和p-NF-κB/RelA及snail水平等指标;并进一步观察NF-κB抑制剂Bay11-7082预处理HaCaT细胞或IKKβ-siRNA, IKKα-siRNA或NF-κB/RelA-siRNA转染HaCaT细胞后,1.0 μmol·L^-1 NaAsO₂对HaCaT细胞以上指标的影响。结果 1.0 μmol·L^-1 NaAsO₂处理细胞20代时引起细胞形态发生间质样改变;细胞粘附能力下降,上皮细胞指标E钙黏着蛋白水平降低,而间质细胞指标N钙黏着蛋白和波形蛋白水平以及干细胞表面抗原CD34和K5 mRNA表达升高,细胞能够形成悬浮细胞集落,且随NaAsO₂处理时间延长,上述改变越明显;1.0 μmol·L^-1 NaAsO₂处理细胞10代时,引起HaCaT细胞经典NF-κB信号通路的p-IKKβ, p-IκBα和p-NF-κB/RelA水平均升高,snail水平也升高,且随NaAsO₂处理时间延长,上述改变越明显;1.0 μmol·L^-1 NaAsO₂急性处理引起HaCaT细胞snail水平升高,并具有一定的时间-效应关系;阻滞经典NF-κB信号通路可抑制1.0 μmol·L^-1 NaAsO₂急性处理所致HaCaT细胞snail水平升高;阻滞NF-κB可抑制1.0 μmol·L^-1 NaAsO₂慢性处理所致HaCaT细胞E钙黏着蛋白水平和细胞粘附能力下降及N钙黏着蛋白, 波形蛋白, CD34和K5水平升高,抑制细胞形态发生间质样改变,抑制细胞悬浮集落形成能力和致瘤性。结论 经典NF-κB信号通路激活而引起snail水平升高在低浓度NaAsO₂慢性处理所致HaCaT细胞EMT和TSCs特性获得及恶性转化过程中具有重要作用。
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  T13.20 家兔胎仔骨骼染色单染法与双染法的比较

  姜娟;崇立明;杨阳;王蓉;周莉;孙祖越

  2013, 27(S1): 253-254.

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  目的 胚胎-胎仔发育毒性试验中骨骼标本制备的好坏是关系到整个实验成败的关键,通过家兔胎仔骨骼进行单染和双染方法的对比观察,比较两种染色方法的优缺点。方法 孕兔于妊娠第28天剖宫检查,取出胎仔,剥皮并祛除内脏,摘除颈部和背部脂肪,于95%乙醇固定24 h,次日分单染法和双染法分别进行染色,以对两种染色效果进行比较。单染法以含氢氧化钾的茜素红染液染色,然后逐级进行透明和脱色处理;双染法以阿利新蓝染液和含氢氧化钾的茜素红染液两种分步染色,然后逐级进行透明和脱色处理。结果 (1)单染法操作简便,影响染色效果因素较少,但只能对硬骨染色,而双染法能将已骨化的骨骼染成红色或紫红色,软骨染成蓝色,其他组织呈无色透明状,颜色对比鲜明,能有效的发现硬骨及软骨发育异常;(2)双染法染色步骤繁琐,影响着色因素较多,首先阿利新蓝染色时应控制好时间,防止染色过深致标本整体颜色较深,影响后续骨骼检查;其次双染法染色分为两步,应注意透明和脱色时间适当延长;(3)另外由于家兔胎仔较大,两种染色方法染色过程中均应注意及时翻动标本,避免标本与染液接触不均致标本局部染色过深或过浅。结论 采用阿利新蓝和茜素红两种染液染色的方法能直观的展现硬骨和软骨的发育状况,能获得最佳实验数据,是骨骼染色较好的选择。
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  T13.21 邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对原代大鼠睾丸巨噬细胞凋亡的影响

  裴秀丛;段志文;马明月;张玉敏

  2013, 27(S1): 254-254.

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  目的 雄性生殖毒物作用靶点与睾丸巨噬细胞(TM)密切相关,本实验在原代培养大鼠TM的基础上,研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)对TM细胞凋亡的影响,从而为探讨免疫在环境污染物雄性生殖毒性中的作用提供依据。方法 采用剥离提取法原代培养大鼠TM。将TM接种于6孔培养板,分别用DEHP 0, 10, 100和1000 μmol·L^-1处理24 h,用AnnexinⅤ-FITC法通过流式细胞仪检测凋亡情况。结果 原代培养TM 72 h,大量细胞贴壁,形态学观察贴壁的细胞呈圆形、梭形和不规则形,有突起,胞浆丰富,具有巨噬细胞的形态特征;墨汁吞噬率>90%,提示细胞吞噬功能良好;CD68抗原鉴定为巨噬细胞。10, 100, 1000 μmolL^-1 DEHP染毒组的细胞凋亡率分别为(5.41±0. 35)%、(9.37±1.01)%及(15. 52±0.85)%,与对照组的细胞凋亡率(0.11±0.02)%比较,差异均有统计学意义(P<0.05),即随着DEHP染毒剂量的增加,TM凋亡率明显增加。结论 DEHP能干扰大鼠TM的凋亡。
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  T20.19 锰对脉络丛上皮细胞系Z310的毒性作用及锰致细胞周期阻滞的分子机制

  敬海明;刘君丽;董一文;胡雯若;谭壮生;高文晖;宁钧宇;李煜;赵超英;马玲;李国君;

  2013, 27(S1): 367-367.

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  目的 探讨锰致Z310细胞周期阻滞的可能机制。方法 MTT法和WST-8法观察低剂量(0.00005~50 μmol·L^-1)和高剂量(50~1600 μmol·L^-1)MnCl₂对Z310细胞增殖的影响;光镜和透射电子显微镜观察MnCl₂对Z310细胞形态及其亚细胞超微结构的损伤;流式细胞术检测MnCl₂对Z310细胞周期时相及细胞凋亡的影响;Western blot检测MnCl₂对Z310细胞内应激性磷蛋白1(STIP1)、Erk1/2及其磷酸化蛋白、Akt及其磷酸化蛋白的影响,并采用SiRNA干扰技术抑制Z310细胞中STIP1蛋白的表达,进而研究STIP1在MnCl₂所致的Z310细胞周期影响中的可能作用及其分子机制。结果 高剂量(100~1600 μmol·L^-1)MnCl₂对细胞增殖具有明显的剂量依赖性的抑制作用,而低剂量(0.00005~5 μmol·L^-1)MnCl₂对细胞增殖的作用表现为促进趋势;MnCl₂作用下,Z310细胞数量明显减少,排列不紧凑,且多边形态不明显,呈类梭状生长,核膜皱缩,核质浓缩、边缘化,线粒体出现缺嵴空泡化,胞质空泡化;MnCl₂(100~800 μmol·L^-1)作用24 h后, 处于G₀/G₁期的Z310细胞比例从1.8%增加到7.6%,48 h后从5.0%增加到19.2%。MnCl₂(500 μmol·L^-1)作用24 h后,Z310细胞的晚期凋亡及坏死率比对照组增加了8.34%;MnCl₂(50~400 μmol·L^-1)作用24 h后,Z310细胞内STIP1蛋白表达上调,MAPK信号通路中的关键蛋白Erk1/2的磷酸化水平无明显变化,而PI3K通路中的关键蛋白Akt的磷酸化水平下调;将Z310细胞内STIP1蛋白敲低至原有水平的13%后,未发现锰(400 μmol·L^-1)对Z310细胞周期改变趋势有变化,而且对Z310细胞内Erk1/2和Akt磷酸化水平也无影响。结论 锰可引起Z310细胞中STIP1的表达量增高,但在锰引起的Z310细胞周期阻滞的过程中并不起关键性作用。
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  T20.20 AQP5在甲胺磷农药诱导唾液分泌中的作用

  张璇;陈致飞;陈刚

  2013, 27(S1): 367-368.

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  目的 探讨有机磷农药甲胺磷对颌下腺水通道蛋白质AQP5的影响。方法 与半定量RT-PCR,Western blot,组织免疫荧光分析。结果 (1)由于AQP5 G308A突变型大鼠的AQP5蛋白质在大鼠颌下腺、耳下腺、肺等组织中表达明显减少,腹腔注射给予AQP5 突变型和野生型SD大鼠甲胺磷7 mg·kg^-1,收集给予甲胺磷后大鼠分泌的唾液,野生型大鼠分泌的唾液量在给予甲胺磷后1, 1.5和2 h时间点明显高于突变型大鼠,这一结果说明,唾液腺中AQP5蛋白质在甲胺磷农药引起的唾液分泌中起重要作用。(2)腹腔注射给予小鼠甲胺磷7 mg·kg^-1,收集5 min, 15 min, 0.5, 1, 2, 6, 12和24 h不同时间点的唾液分泌量,在给予甲胺磷后,从0.5~6h唾液分泌量明显增多,2 h时间点唾液分泌量达到最高峰,6 h后唾液分泌量逐渐减少,12 h后恢复正常。(3)半定量RT-PCR方法检测给予甲胺磷后小鼠颌下腺上述各时间点AQP5 mRNA表达,结果表明,上述各时间点AQP5 mRNA表达水平没有明显改变,说明甲胺磷农药没有影响AQP5 mRNA的表达水平。(4)Western blot的方法检测给予甲胺磷后小鼠颌下腺上述各时间点AQP5蛋白质表达,结果表明上述各时间点AQP5蛋白质表达水平没有明显改变。(5)组织荧光免疫方法观测给予小鼠甲胺磷农药后AQP5在颌下腺组织中的分布,与对照组相比,给予甲胺磷后2 h,在颌下腺腺泡中AQP5聚集在腺泡细胞的顶端膜,6 h后聚集在顶端膜的AQP5减少,12 h后恢复正常,AQP5聚集到顶端膜上有利于唾液水分的分泌。结论 甲胺磷农药使唾液分泌增加,但不影响AQP5在颌下腺中表达水平,部分原因是甲胺磷使AQP5聚集到颌下腺腺泡细胞顶端膜,利于水分的分泌到腺泡腔,增加唾液的分泌。
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  T20.21 三甲基氯化锡对大鼠神经行为及氧化应激的影响

  范攀;赵飞;卿燕;梁艳芳;杜清清;徐汉宫;石年

  2013, 27(S1): 368-368.

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  目的 拟建立大鼠重复剂量三甲基氯化锡(TMT)急性经口中毒模型;评价TMT对大鼠神经行为学影响及组织神经结构的改变;检测血清及脑组织氧化抗氧化系统的影响。方法 健康成年雄性SD大鼠每天经口灌胃给予TMT 0.75, 1.50和3.00 mg·kg^-1,共6 d。采用前肢握力、后肢撑力、平衡木行走及甩尾系数等评价TMT的神经行为毒性。末次染毒24h后处死大鼠,尼氏染色法进行病理分析。取血清,皮层和小脑,检测MDA, GSH及T-SOD等氧化抗氧化系统指标的变化。结果 高剂量大鼠第6天有震颤、四肢僵直无力、癫痫发作、抽搐等明显的中枢兴奋性神经毒性表现。高剂量大鼠第4, 5, 6天体重明显下降(P<0.01)。高剂量组大鼠心,脑,肺,肾,睾丸脏器系数均明显变大(P<0.05),脾的脏器系数明显减少(P<0.05)。高剂量组前肢握力评分第5和第6天降低更加明显(P<0.01),无第三肢攀上钢丝。高剂量组的后肢撑力系数在染毒后第4, 5, 6天下降明显(P<0.01)。高剂量组钉板平衡木行走评分第6天基本上都不能完成平衡木行走实验,评分增高(P<0.01)。高剂量组甩尾系数第5和第6天明显增加(P<0.05)。高剂量组大脑皮层神经细胞数目明显减少,胞体变小,染色很浅,排列紊乱,胞核和胞浆分界不明显,轴突和树突无法区分,Nissl体数量明显减少。高剂量组血清MDA增加22.0%(P>0.05);中、高剂量组GSH分别增加133.6%(P<0.01)和92.9%(P<0.05);高剂量组T-SOD活性活性显著增强(P<0.05)。随着染毒剂量增加,各染毒组大鼠皮层MDA含量均有所增加,其中高剂量组增加45.4%(P<0.05);低、中、高剂量组大鼠皮层中GSH 含量均分别减少29.91%(P<0.05)、38.0%(P<0.01)和50.66%(P<0.01);各剂量组T-SOD酶活性均明显降低(P<0.05)。结论 成功建立TMT神经毒性整体实验模型TMT可引起神经行为毒性,造成神经运动及感觉功能障碍;TMT可引起血清、皮质和小脑氧化损伤,氧化应激损伤是TMT致神经毒性的可能机制之一。
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  T20.22 TH17在槲皮素抑制自身免疫性脑脊髓炎中的作用

  魏雪涛;;Akihiro KIMURA;Akihiko YOSHIMURA

  2013, 27(S1): 368-369.

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  目的 观察槲皮素对自身免疫性疾病模型EAE(脑脊髓炎)的拮抗作用,同时确定TH17在槲皮素拮抗自身免疫性EAE反应中的角色及作用机理。方法 用MOG_35-55作为抗原免疫动物,制造自身免疫性EAE模型,在造模过程中,给予槲皮素,观察槲皮素对EAE发病过程的影响。利用流式细胞技术观察脊髓中单个核细胞内TH17, Treg等细胞的变化,同时测定血清中的不同细胞因子水平,确定主要出现变化的细胞类型;在体外研究,观察细胞因子作用下,观察na?ve CD4⁺ T细胞的诱导分化在槲皮素作用下发生的改变,进一步用Western技术观察IL-6-STAT3信号通路在此过程中出现的变化。结果 槲皮素100 mg·kg^-1经口给予小鼠后,会减缓EAE模型出现体征的时间,同时临床得分在槲皮素干预组也明显低于EAE模型组。EAE模型动物的脊髓中TH17细胞数明显增高,给予槲皮素干预后,TH17细胞数明显降低。同时发现,EAE模型动物的脊髓中Treg细胞并没有明显降低,但是槲皮素干预组的Treg细胞却比对照和EAE模型组明显升高。对小鼠血清中的细胞因子检测发现,槲皮素能降低EAE模型动物的IL-6水平。进一步的体外研究发现,nave CD4⁺ T 细胞在TGF-B和IL-6刺激下的分化,会受到槲皮素的抑制,TH17细胞比例下降。这表明,槲皮素通过抑制TH17细胞的分化,减轻EAE模型动物的临床体征。进一步通过Western检测发现,STAT3的磷酸化、JAK1磷酸化和JAK2的磷酸化在槲皮素作用下,都出现抑制,而同一信号通路上的gp130并未出现明显的变化。推测JAK家族是槲皮素发挥作用的细胞内作用靶点,但是槲皮素具体如何抑制JAK及其磷酸化,依然还需要进一步的研究。结论 槲皮素对MOG肽诱导的自身免疫性脑脊髓炎模型有抑制作用,该抑制效应主要是通过抑制TH17细胞的分化,影响细胞内JAK及其磷酸化来发挥作用。
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  T20.23 红系相关基因甲基化水平在苯酚和氢醌处理K562细胞的变化

  李扬;苏日咕嘎;李怡然;余春红;姜良;唐恪雅;易宗春

  2013, 27(S1): 369-370.

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  目的 观察DNA甲基化抑制剂对苯代谢苯酚和氢醌抑制K562细胞红系分化的干预作用,以及经苯酚和氢醌处理K562细胞的红系相关基因甲基化水平变化。方法 K562细胞经苯酚或氢醌处理24 h后,加入DNA甲基化抑制剂5-aza-CdR共同作用48 h,洗去药物后用氯化高铁血红素诱导48 h后,用联苯胺染色法和反转录PCR分析细胞的血红蛋白阳性率和红系相关基因(包括α-, β-和γ-珠蛋白、血红素合成相关酶PBGD和ALAS2以及转录因子GATA-1)的mRNA表达水平;此外,K562经苯酚或氢醌处理72 h后,应用Sequenom MassARRAY分析技术定量分析红系相关基因的甲基化水平。结果 K562细胞未经氯化高铁血红素诱导的血红蛋白阳性率低于1%,经氯化高铁血红素诱导的血红蛋白阳性率升高到40%,红系相关基因mRNA表达也在诱导后显著提高;K562细胞经苯酚800 μmol·L^-1或氢醌40 μmol·L^-1处理72 h再经氯化高铁血红素诱导的血红蛋白阳性率分别下降到31.60%和29.37%,红系相关基因mRNA表达均显著低于对照组;而K562细胞经苯酚或氢醌处理的后48 h加入5-aza-CdR共同作用后经氯化高铁血红素诱导的血红蛋白阳性率均恢复到对照水平,5-aza-CdR同样完全阻止了苯酚或氢醌抑制红系相关基因mRNA表达。K562经苯酚800 μmol·L^-1处理72 h后,α-珠蛋白基因的启动子和外显子1区域有4个CpG分析单位(即-455与-450 CpG位点,-344, -339, -336与-332位点,-256与-253位点,+159与+154位点)的甲基化水平显著升高,α-珠蛋白远端调控序列HS40的2个CpG位点的甲基化水平也有显著升高;β-珠蛋白基因启动子-414 CpG位点的甲基化水平显著提高,但γ-珠蛋白基因启动子甲基化水平没有明显变化,β-珠蛋白簇远端调控区HS-1的2个CpG位点和HS-4的1个CpG位点甲基化水平均显著升高,而HS-2和HS-3甲基化水平没有明显变化;PBGD基因外显子1的+47 CpG位点和GATA-1启动子-122 CpG位点甲基化水平显著提高。K562经氢醌40 μmol·L^-1处理72 h后,α-珠蛋白基因的启动子和外显子1区域甲基化水平没有明显变化,不过HS40的2个CpG位点的甲基化水平显著升高;β-珠蛋白基因启动子-125 CpG位点的甲基化水平显著降低,而γ-珠蛋白基因启动子、HS-1和HS-2甲基化水平没有明显变化,但HS-3和HS-4各有1个CpG位点甲基化水平显著升高;PBGD基因外显子1的甲基化水平没有明显变化,但GATA-1启动子-222 CpG位点甲基化水平显著提高。结论 甲基化抑制剂可有效阻止苯酚和氢醌抑制红系分化,苯酚和氢醌还可引起红系相关基因某些CpG位点甲基化水平的变化,提示DNA甲基化在苯酚和氢醌抑制红系分化中扮演重要角色。
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  T20.72 FRY抑癌蛋白在乳腺癌中的表达及意义

  张辰子;赵进明;陈华军;杜日昌;孙侠;黄威;任海涛;杨林;费帆;林忠宁;任雪峰;唐小江

  2013, 27(S1): 396-397.

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  目的 研究乳腺非癌病例和不同分期的乳腺癌病例中FRY抑癌蛋白表达情况及其与临床病理参数之间的关系。方法 间接酶联免疫吸附实验(ELISA)及Western blot实验检测自制抗人FRY多克隆抗体特异性,并对20例乳腺癌病例用自制FRY多克隆抗体与商品化FRY抗体分别进行免疫组化检测,验证抗体的可行性;用自制FRY多克隆抗体对11例纤维囊性乳腺病及63例不同分期分级的乳腺癌病的中FRY蛋白表达情况进行检测,用χ²检验(或精确概率法)比较FRY蛋白表达情况与不同临床病理参数的关系。结果 间接ELISA和Western blot实验结果显示自制FRY多克隆抗体可较特异识别目的FRY蛋白,且自制抗体和商品化抗体对20例乳腺癌病例检测结果一致(χ²=0.417,P>0.05);11例纤维囊性乳腺病与63例乳腺癌病例中FRY阳性率分别为63.64%和26.98%,差异有统计学意义(χ²=5.741,P<0.05);63例乳腺癌病例中,FRY的表达在不同肿瘤直径大小、不同淋巴结转移情况、TNM分期、不同雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达水平之间均有显著性差异(P<0.05);而在其他临床病理参数间无明显差异(P >0.05)。结论 FRY蛋白在乳腺非癌病例中表达高于癌症病例,并且其与乳腺癌恶性程度及激素受体水平有联系,验证了其可能具有的抑癌作用。
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  T20.73 硫柳汞通过抑制PI3K/AKT/存活蛋白通路诱导小鼠成肌细胞C2C12凋亡

  李文学;杨光宇;朱伟

  2013, 27(S1): 397-397.

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  目的 探讨硫柳汞对肌肉组织可能存在的毒性及其作用机制。方法与结果 C2C12暴露于极低浓度的硫柳汞(125~500 nmol·L^-1)24, 48和72 h后,WST-1检测发现其增值明显受到抑制。采用流式分析技术发现硫柳汞诱导了S期的阻滞和凋亡。同时采用Hochest和Western blot进一步验证结果,Hochest实验结果显示细胞出现明显的凋亡现象,Western blot检测多种凋亡相关蛋白包括:胞浆细胞色素C含量,胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的活化,发现硫柳汞能够诱导多种凋亡蛋白的表达,同时胱天蛋白酶的抑制剂能够抑制硫柳汞诱导的凋亡效应。我们进一步发现硫柳汞降低了凋亡抑制相关的关键蛋白AKT的磷酸化和存活蛋白的表达水平,Wortmannin,AKT磷酸化的特异性抑制剂,明显抑制了AKT的磷酸化和存活蛋白的表达,促进了硫柳汞诱导的凋亡作用,而通过mIGF-1(50 ng·ml^-1)激活了AKT磷酸化,增加了存活蛋白的表达,从而抑制了硫柳汞诱导的凋亡。进一步使存活蛋白高表达同样也可以抑制硫柳汞的凋亡诱导作用。这些数据说明PI3K/AKT/存活蛋白抗凋亡通路在硫柳汞诱导的凋亡过程中起着重要的作用。结论 极低剂量的硫柳汞能够诱导C2C12成肌细胞S期阻滞最终诱导其出现凋亡,这一过程可能是通过抑制抗凋亡通路PI3K/AKT/存活蛋白激活线粒体凋亡途径而发生的。
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  T20.74 咖啡酸苯乙酯活化Nrf2途径拮抗细胞纤维化样反应

  刘瑞;柏桦;张伟;张晓迪;李文丽;海春旭

  2013, 27(S1): 397-398.

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  目的 探讨咖啡酸苯乙酯(CAPE)是否可以通过调控核因子E2相关因子2(Nrf2)及抗氧化酶的表达而实现对肺成纤维细胞内氧化应激的改善,从而阻止其异常增殖与胶原分泌。这对于深入探讨肺纤维化的发病机理与防治策略具有重要意义。方法 给予小鼠肺成纤维细胞L929细胞H₂O₂ 10 μmol·L^-1及不同浓度的CAPE(1~50 μg·ml^-1)预处理,24 h后应用RT-PCR与蛋白印迹法分别检测细胞内Nrf2、抗氧化酶γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GCS)、血红素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)基因与蛋白表达水平的变化;应用荧光分光光度计法检测细胞GSH含量,HO-1, SOD, CAT的活性;DCFH-DA荧光探针标记结合流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平变化;MTT法与碱水解法检测不同浓度CAPE处理后H₂O₂对细胞增殖与胶原产物羟脯氨酸含量的作用。结果 H₂O₂ 10 μmol·L^-1可刺激L929细胞增殖与胶原分泌(P<0.05),而12.5 μg·ml^-1以上CAPE处理后能明显诱导细胞核内转录因子Nrf2积聚,并增加细胞内GSH含量,提高HO-1, SOD及CAT的表达与活性,细胞内ROS水平显著降低(P<0.05)。CAPE组与空白对照组比较,细胞活力也有所升高,胶原产物含量无显著差异;但与单纯H₂O₂组比较,细胞活力与胶原产物含量均下降(P<0.05)。结论 抗氧化剂CAPE可以通过诱导的转录因子Nrf2与相关抗氧化酶基因的表达,调节细胞内活性氧水平,减少氧化应激,对维持成纤维细胞的正常生长与胶原分泌功能起到重要作用。
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  T20.77 环境镉暴露人群尿液中特异性小分子代谢物表征

  汤柳英;高燕红;王晶;许瑛华;陈文才;梁旭霞;杨杏芬

  2013, 27(S1): 399-399.

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  目的 寻找环境镉暴露相关的女性尿液中内源性小分子特征性代谢物,为环境镉暴露人群健康损害的早期监测提供科学依据。方法 采用反相高效液相色谱串联飞行时间质谱(HPLC-QTOF)进行代谢组学分析,分别在正离子(ESI⁺)和负离子(ESI^-)模式下获得环境镉暴露区和对照区60名45~70岁女性尿液代谢轮廓,运用主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘-判别法(OPLS-DA)分析两组人群尿液中内源性小分子代谢物表征的差异性,采用MPP(MassHunter Profiler Proffesional)对差异性代谢产物进行识别和确认,根据模型中各变量的VIP值,结合非参数检验和z值筛选环境镉暴露相关的潜在标志物。结果 ESI⁺和ESI^-模式下,暴露组与对照组人群尿液代谢轮廓不同;OPLS-DA模型能够将暴露组和对照组人群完全区分;将暴露组中4个显著变化的变量作为环境镉暴露相关潜在标志物,其受试者特征曲线下面积为0.67~0.71。结论 通过代谢组学方法比较环境镉暴露区和对照区女性人群尿液中内源性小分子代谢物,初步获得了镉暴露相关的4个小分子代谢物的信息,且所用方法能够完全区分环境镉暴露人群和对照区人群的尿样。
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  T20.78 CTR1和ATP7A在铅诱导的血-脑脊液屏障铜代谢紊乱中的作用

  郑刚;张洁琼;宋晗;沈学锋;陈景元

  2013, 27(S1): 399-400.

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  目的 研究铅暴露对血-脑脊液屏障(BCB)铜离子转运的影响,以及CTR1和ATP7A等铜转运体蛋白在该过程中的作用。方法 大鼠脉络丛上皮细胞系Z310体外培养,铅暴露剂量分别为1, 2.5, 5, 10 μmol·L^-1。⁶⁴Cu吸收实验检测铅暴露对细胞铜吸收的影响;Real-time PCR、Western blot法检测铅对铜离子转运体1(CTR1)、二价金属转运体1(DMT1)、ATOX1和ATP7A表达水平的影响;siRNA干涉技术观察CTR1和ATP7A在铅诱导的细胞铜过载中的作用;进一步采用tetracycline(Tet)可诱导CTR1高表达细胞系iZCTR1,在加入Tet作用4 h后,使细胞吸收过量铜离子造成细胞内铜过载,研究细胞铜水平的增加对CTR1和ATP7A表达水平的影响。结果 不同剂量铅暴露引起脉络丛Z310细胞内铜过载;铅暴露后细胞CTR1表达水平显著增加,ATP7A表达水平下降,而ATOX1和DMT1的水平无显著变化。采用siRNA阻断CTR1的表达可以抑制细胞铜吸收,并抑制铅诱导的细胞铜过载;ATP7A siRNA可抑制细胞铜的外排,造成细胞内铜的蓄积,且阻断ATP7A后,铅暴露未能诱导细胞内铜水平的进一步增加。上述结果提示CTR1表达的增加和ATP7A表达的降低可能是铅诱导BCB细胞铜转运紊乱的重要原因。另外,细胞外铜浓度的增高引起CTR1蛋白水平的反馈性下调,而对ATP7A蛋白的水平无显著影响。我们采用基于Z310细胞建立的Tet可诱导CTR1高表达细胞系iZCTR1,用Tet诱导CTR1高表达而造成细胞铜过载,进一步研究了细胞内铜水平增高对ATP7A表达水平的影响。结果显示:铜过载24 h后,细胞内铜含量为对照组的6.5倍,而铜过载后铅暴露24 h可对细胞铜的排出产生更显著的抑制作用。Real-time PCR和Western blot结果显示:细胞内铜过载对ATP7A的表达水平无显著影响,而铜过载后铅暴露引起ATP7A水平显著降低。结论 铅可以引起脉络丛上皮细胞铜吸收的增加和铜排出的抑制。其中铜吸收的增加可能与铅引起的CTR1水平增高密切相关,而细胞铜水平的增加可以负向调控CTR1的水平;铅暴露后细胞ATP7A表达的降低可能是细胞铜排出受到抑制的主要原因,而且ATP7A的表达水平并未受细胞内铜水平的影响,而是铅暴露的直接作用结果。
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  T20.79 氢醌诱导小鼠卵黄囊造血干细胞氧化应激过程中PKM2的作用

  朱洁;熊北斗;王巍;李真;李超;王丽萍;白玉娥;张少尊;范宁娜;周胜;王红;毕勇毅

  2013, 27(S1): 400-400.

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  目的 观察氢醌(HQ)导致的氧化应激与PKM2蛋白表达的联系,进而了解ROS与PKM2的表达在苯致白血病中的作用,为预防和治疗苯导致的血液中毒提供新的依据。方法 颈椎脱臼8~10 d昆明孕鼠取其卵黄囊,运用淋巴分离液及免疫磁珠法分(MACS)选出小鼠卵黄囊胚胎造血干细胞,种板于七种不同浓度氢醌的无血清培养基中染毒6 h完成各种实验,流式细胞仪检测ROS的产生,real-time PCR检测Nrf2及其靶基因NQO1, GCLM/GCLC和HMOX-1的mRNA表达,Western blotting检测PKM2, Nrf2, Nqo1和hmox-1以及细胞内过氧化物酶、超氧化物歧化酶的蛋白表达。结果 流式细胞仪检测ROS结果显示随着氢醌浓度升高,小鼠卵黄囊造血干细胞内ROS水平逐渐增加。real-time PCR结果显示随着氢醌浓度增加,Nrf2及其靶基因NQO1, GCLM/GCLC和HMOX-1的mRNA表达升高。Western blotting结果显示随着氢醌浓度升高,小鼠卵黄囊造血干细胞中PKM2的表达逐渐降低,Nrf2及其靶基因NQO1和HMOX-1表达逐渐升高。细胞内过氧化物酶、超氧化物歧化酶随着氢醌浓度的升高逐渐降低。结论 HQ可诱导ROS的产生,并抑制PKM2蛋白的表达,而Nrf2靶基因NQO1, GCLM/GCLC和HMOX-1的表达增加。NADPH1氧化酶的表达也相应地增多。细胞内过氧化物酶、超氧化物歧化酶的表达明显受到抑制。
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  T20.80 氨基酸R410和Y411的变构调控影响全氟辛磺酸结合人血清白蛋白

  曹慧明;孙玉贞;蔺远;冯鸿儒;傅建捷;张爱茜

  2013, 27(S1): 400-401.

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  目的 探讨全氟辛磺酸(PFOS)在血清中与脂肪酸相互作用机制。方法 本研究基于PFOS高浓度条件下与HSA形成复合物的X射线衍射结构,综合大量荧光淬灭实验结果,利用分子动力学模拟手段,在经典的amber-ff03立场下,模拟了PFOS在HSA的两个性质不同的脂肪酸结合位点的动态结合过程。在此基础上,进一步采用mmpbsa.py模块测试了PFOS在这两个位点的相对结合能力,并将结合自由能分解到有相互作用的关键氨基酸,计算了每个氨基酸对结合能的贡献;同时我们亦考察了PFOS结合对HSA二级结构稳定性的动态影响。结果 分子动力学模拟结果显示,PFOS结合在HSA的脂肪酸结合位点6(FA6)的结合自由能弱于结合在部分脂肪酸结合位点3/4(FA3/4)。结合自由能贡献分解指出R209和K351对PFOS在FA6的结合能力起主要作用,而在FA3/4则为R410。并且PFOS结合在FA6对HAS的二级结构稳定性的影响强于结合在FA3/4。荧光氨基酸TRP214周围微环境的微扰主要是由PFOS结合在FA6引起的。结论 结合一分子PFOS在位点FA6后,氨基酸R410和Y411通过变构调节,打开门控开关,允许第二分子PFOS结合进入HSA的位点FA3/4。确定在低浓度时的结合位点位于传统定义上的脂肪酸结合位点6。
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  T20.81 Rg1通过激活芳烃受体削弱TCDD对CYP1A的诱导作用

  王宇光;陈强;李晗;马增春;梁乾德;肖成荣;谭洪玲;汤响林;张伯礼;高月

  2013, 27(S1): 401-401.

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  以HepG2细胞为研究载体,考察人参中的主要皂苷成分Rg1对干预 2,3,7,8-四氯代二苯并-对-二噁英(TCDD)诱导CYP1A1作用的影响mRNA、蛋白及酶活性三个层面影响进行了研究,同时对CYP1A1转录因子芳烃受体(AhR)表达也进行了考察,目的在于考察Rg1是否通过与TCDD共同作用于AhR,从而实现干预前致癌物如TCDD诱导CYP1A的能力,进而减少通过CYP1A1代谢活化产生致癌作用。分别以TCDD 5 nM单独作用或与Rg1(1.0,10.0,100.0 μmol·L^-1)共同作用于HepG2细胞24 h。溶剂对照组为二甲亚砜。利用RT-PCR法和Western blot法检测不同药物处理后HepG2细胞中CYP1A1,AhR的mRNA和蛋白质表达水平的变化,同时采用EROD法测定不同处理组细胞CYP1A1酶活性。 结果显示, TCDD能剂量依赖性诱导CYP1A1基因、蛋白表达,同时使其酶活性水平上升;,Rg1与TCDD共处理时,CYP1A1,AhR在mRNA和蛋白质表达水平均较TCDD单独处理时明显下降(P<0.01);同时CYP1A1酶活性也较单独TCDD处理组明显降低(P< 0.01)。人参皂苷Rg1能明显削弱TCDD致HepG2细胞CYP1A1诱导在mRNA、蛋白表达及酶活性三个层面的能力。
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  T20.83 Polη缺陷对氢醌所致肝细胞DNA损伤的影响

  胡恭华;黄海燕;高艳芳;邹丽君;方道奎;张锦周;庄志雄

  2013, 27(S1): 402-402.

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  目的 探讨Polη缺陷对氢醌(HQ)所致肝细胞DNA损伤的影响。方法 将L02-POLH-nsc细胞(Polη表达正常的L-02肝细胞)和L02-POLH-sh细胞(Polη表达缺陷的L-02肝细胞)用HQ 0, 10, 20和40 μmol·L^-1处理24 h后,采用彗星实验检测DNA损伤状况,并采用图像分析软件CASP-1.2.2对之进行分析,每个剂量组共分析100个细胞,以彗星的尾部DNA含量(TD)、尾长(TL)、尾距(TM)和Olive 尾矩(OTM)为评价指标;采用细胞免疫荧光实验联合激光共聚焦显微术检测γ-H2AX焦点形成状况。结果 彗星实验结果显示,HQ作用于L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh细胞24 h后均能以剂量依赖性的方式诱导DNA损伤水平的增加。在相同的HQ作用剂量(10, 20或40 μmol·L^-1组)条件下,L02-POLH-sh细胞的TD, TL, TM和OTM值均明显地大于L02-POLH-nsc细胞,差别具有统计学意义(P<0.01)。细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示,HQ作用24 h后,L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh细胞内的γ-H2AX焦点数均有随着HQ作用剂量的增加而增加的趋势,并呈现一定的剂量依赖性,10, 20和40 μmol·L^-1组的γ-H2AX焦点数均明显地多于对照组(P<0.05);并且,在相同的HQ作用剂量(10, 20或40 μmol·L^-1组)条件下,L02-POLH-sh细胞内的γ-H2AX焦点数明显多于L02-POLH-nsc细胞(P<0.05)。结论 Polη缺陷会明显增强HQ诱导的遗传毒性,并且肝细胞可能拥有Polη依赖性的机制来处理HQ所诱发生成的DNA双链断裂损伤。
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  T20.85 LncRNA作为镉恶性转化16HBE细胞的表达标签及其对DNA修复基因的调控作用

  周志衡;刘海柏;黄钦海;王敏;魏莲;雷毅雄

  2013, 27(S1): 403-404.

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  目的 探讨镉的致癌机制以及长链非编码RNA(lncRNA)在镉毒性调控机制的作用。方法 运用LncRNA和mRNA基因芯片技术、生物信息学技术分析lncRNA在镉恶性转化人支气管上皮(16HBE)第35代细胞和非转化人支气管上皮(16HBE)中的表达谱,运用qPCR技术选择10个差异表达的lncRNA检测其在镉恶性转化人支气管上皮细胞中的表达规律;采用RNA干扰技术,分析LncRNA(ENST00000414355和ENST00000446135)对DNA修复基因的调控作用,检测200名镉作业工人相关指标,验证LncRNA在镉毒性中的作用。结果 使用具有33 045个LncRNA的芯片进行检测,在本研究提供的细胞中检测出其中的21 409个LncRNAs。与非转化人支气管上皮比较,镉恶性转化人支气管上皮第35代细胞中lncRNAs表达上调的比表达下调的多,其中有369个lncRNAs表达上调,有90个lncRNAs表达下调(≥2.0倍, P<0.05)。qPCR检测显示,与非转化人支气管上皮比较,镉恶性转化人支气管上皮第35代细胞中ENST00000477387, ENST00000394732, ENST00000485873, ENST00000497538, uc002odz.1, AK023660, NR_023938, BC019085,ENST00000414355和ENST00000446135出现异常表达(P<0.05);生物信息学分析显示,以上10个lncRNAs具有调控功能;LncRNA(ENST00000414355和ENST00000446135)沉默之后,20个DNA修复基因在正常16HBE细胞和氯化镉转化16HBE成瘤细胞中的表达均出现改变,其中LncRNA ENST00000414355沉默后DDB1和DDB2表达水平变化在16HBE细胞(0.58)中最明显,均呈高表达;hOGG1在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中表达水平变化最明显,呈高表达。检测镉作业工人血液标本检测结果显示,ENST00000414355和ENST00000446135的表达水平与DNA修复基因的表达水平具有相关性。结论 镉恶性转化人支气管上皮细胞中存lncRNAs异常表达谱,LncRNA(ENST00000414355和ENST00000446135)在镉恶性转化16HBE细胞中调控了DNA修复多个途径的基因表达;LncRNA可能是镉恶性转化16HBE细胞新的分子机制之一,而LncRNA(ENST00000414355、ENST00000446135)可以作为镉致癌早期诊断的分子标记物的参考指标,也适合高危人群的筛检,本研究为进一步阐明镉致癌机制提供了一个新的思路。
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  T20.86 毛细管电泳法检测耐米托蒽醌乳腺癌细胞系全基因组甲基化水平

  袁建辉;邓婷婷;黄艳华;黄海燕;李子刚;胡章立;庄志雄

  2013, 27(S1): 404-404.

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  目的 构建对盐酸米托蒽醌不同耐药程度的乳腺癌MCF-7耐药细胞系,并检测野生型及不同耐药程度细胞全基因组DNA甲基化水平,探讨多药耐药基因ABCG2差异表达的表观遗传学机制。方法 用0, 0.005, 0.01和0.02 μmol·L^-1的盐酸米托蒽醌染毒细胞,建立对盐酸米托蒽醌不同耐药程度的MCF-7/Mit耐药细胞系,采用流式细胞术检测各染毒组MCF-7细胞内药物蓄积量,确定耐药细胞系的建立;提取各组MCF-7细胞的DNA,利用毛细管电泳法检测野生型及各染毒组细胞全基因组DNA甲基化水平。结果与对照组野生型MCF-7细胞相比较,随着药物染毒浓度的加大,MCF-7细胞内药物的蓄积量逐渐减少,野生型对照组、0.005、0.01和0.02 μmol·L^-1染毒组的平均依次为16.1±0.04, 14.3±0.12、13.3±0.07和(9.7±0.08,0.02)μmol·L^-1染毒组较对照组显著减少,细胞耐药性增强,差异有统计学意义(P<0.05);与野生型相比,细胞基因组DNA甲基化水平逐渐降低,野生型对照组、0.005、0.01和0.02 μmol·L^-1染毒组的平均依次为(42.25±0.64)%, (37.97±1.18)%, (34.27±0.14)%和(31.16±0.80)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 基因组整体甲基化水平降低是乳腺肿瘤产生耐药的表观遗传学机制之一。
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  T20.87 丙烯酰胺对硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶活性的影响

  高小博;马旭;陆彩玲;

  2013, 27(S1): 404-404.

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  目的 谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶为切入点,探讨丙烯酰胺对机体内硒蛋白活性的影响,阐明丙烯酰胺神经毒性、生殖毒性及致癌的分子机制。方法 用不同剂量丙烯酰胺分别处理人宫颈癌HeLa细胞系和人表皮癌A431细胞系,实时荧光RT-PCR方法检测硫氧还蛋白还原酶mRNA含量,Western印迹检测谷胱甘肽过氧化物酶表达水平。用DTNB测试法测定硫氧还蛋白还原酶活性,酶偶联法检测谷胱甘肽过氧化物酶的活性。结果 研究表明在丙烯酰胺处理HeLa细胞时,虽然丙烯酰胺显著诱导了硫氧还蛋白还原酶mRNA水平的上调,但是硫氧还蛋白还原酶的活性明显受到抑制,而且丙烯酰胺也显著下调了人表皮癌细胞系A431硫氧还蛋白还原酶的活性,具有剂量依赖性。Western印迹表明,丙烯酰胺没有明显改变HeLa细胞中谷胱甘肽过氧化物酶的表达水平,但是随着丙烯酰胺处理剂量的增加,谷胱甘肽过氧化物酶活性呈逐渐下降趋势。结论 这些研究表明丙烯酰胺可能通过下调硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶等硒蛋白活性导致毒性效应。
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  T20.89 脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊乙酰胆碱受体信号通路分子mRNA表达水平的影响

  李艳;王立山;刘景丽;王军;肖杭;高蓉

  2013, 27(S1): 405-406.

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  目的 探讨脱氧鬼臼毒素 (DOP)对美洲大蠊Periplaneta americana神经系统乙酰胆碱受体信号通路的影响。方法 从美洲大蠊头部克隆乙酰胆碱受体信号通路上的关键信号分子nAChR α6亚基、CaM和 CaMKⅡ的部分mRNA,并测定其序列。应用荧光定量PCR技术分别观察注射不同浓度DOP(10,45,80,115和150 g·L^-1)24和48 h后上述3种基因表达水平的变化。结果 测序结果显示,克隆出的美洲大蠊nAChR基因部分序列(539 bp)与赤拟谷盗Tribolium castaneum nAChR α6亚基基因的核苷酸序列一致性为84%;美洲大蠊CaM基因(435 bp)与雕木蝉Graphocephala atropunctata CaM基因的核苷酸序列一致性为85%;美洲大蠊CaMKⅡ基因(513 bp)与黑腹果蝇Drosophila melanogaster CaMKⅡ基因的核苷酸一致性为77%。实时定量荧光PCR实验表明:DOP处理48 h后对美洲大蠊nAChR α6亚基、CaM和CaMKII基因表达水平大体表现出低剂量激活,高剂量抑制的特点。45~80 μg·μl^-1 DOP浓度范围内3种基因表达水平达到高峰,80~150 μg·μl^-1浓度范围内表现为抑制作用,基因表达水平呈下降趋势。结论 DOP需要在美洲大蠊体内蓄积一定时间才有明显的作用,能与nAChR结合引起CaM-CaMKⅡ级联反应,使3种基因在低浓度组上调,高浓度组抑制,进而对美洲大蠊产生潜在的毒杀作用。
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  T20.84 孕烷X受体诱导活化参与PP2A不同亚基基因转录调控

  高艳芳;廖昆;张玉静;夏斌;殷花;何承勇;林忠宁;林育纯;

  2013, 27(S1): 402-403.

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  目的 探讨孕烷X受体(PXR)作为转录因子对PP2A不同亚基基因的转录调控作用及其对外源化学物诱导肝细胞毒性转归的影响。方法 采用人肝L02细胞转染NR1I2基因构建PXR稳定高表达的L02-PXR细胞,以L02-pB空载体细胞为对照,给予已知的PXR诱导活化剂利福平(Rif,100 μmol·L^-1)处理48 h;Trizol法提取总RNA,qRT-PCR检测细胞中NR1I2和CYP3A4 mRNA水平代表PXR转录和活化水平,同步检测PP2A不同亚基基因mRNA水平反映PXR对PP2A各亚基表达的调控作用。结果 与L02-pB细胞相比,L02-PXR细胞中NR1I2mRNA显著增高且CYP3A4 mRNA水平增高1.43倍(P<0.05),并且在Rif处理组L02-PXR细胞中CYP3A4 mRNA水平增高17.75倍(P<0.05),显示肝细胞中PXR的诱导活化。L02-PXR细胞中PPP2CA, PPP2R2A, PPP2R5C和PPP2R1A mRNA水平分别是L02-pB细胞中的1.11, 1.02, 0.72和0.81倍,未见显著性差异(P>0.05);但PPP2R2D mRNA是0.17倍,呈显著性降低(P<0.05)。L02-PXR细胞中,Rif处理组PPP2CA, PPP2R2A, PPP2R5C和PPP2R1A mRNA水平分别是未处理组的3.7, 4.57, 2.46和2.14倍,差异有统计学意义(P<0.05),但PPP2R2DmRNA未见显著性增高(1.29倍,P>0.05)。Rif处理组L02-PXR细胞中PPP2CA, PPP2R2A, PPP2R5C和PPP2R1A mRNA水平分别是L02-pB细胞中的3.67, 3.44, 3.54和2.35倍,均呈显著性增高(P<0.05);但PPP2R2D mRNA是0.59倍,呈显著性降低(P<0.05)。结论 PXR诱导活化可上调PP2A不同亚基中PPP2CA, PPP2R1A, PPP2R2A和PPP2R5C基因转录和下调PPP2R2D基因转录;提示PP2A不同亚基可能参与PXR诱导活化介导的细胞功能调节。
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  T20.88 砷对大鼠肝microRNA表达的影响

  任雪峰;Dan GAILE;宫志宏;葛怡琛;黄陈平;闫洪涛;邬红梅

  2013, 27(S1): 405-405.

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  目的 探讨砷对肝脏microRNA表达的影响,筛选出敏感、稳定的应答microRNA,为后续研究提供基础数据。方法 SD雄性大鼠分别给予0,0.1,1,10及100 mg·L^-1亚砷酸钠的饮用水,染毒60 d后,收集肝。每个剂量组选取3个样本,共15个样本,应用高通量RNA测序技术对所选取样本的microRNA表达进行定量。依照microRNA的表达谱对15个样本运用无监督层次法进行聚类分析,并且进行主成分分析。应用趋势检验分析microRNA的表达水平与砷浓度的关系。选取具有显著性差异表达的6个microRNA,应用实时定量PCR对其表达水平进行测定,验证RNA测序结果与实时定量PCR结果的一致性。结果 对15个样本进行聚类分析发现,聚类分组与砷接触浓度有统计学显著性关系(P=0.0012)。剔除1个离群值,对其中14个样本的microRNA表达谱进行了主成分分析,结果表明砷接触水平对变异具有显著的贡献。对不同砷剂量组间的microRNA表达水平进行了分析,与对照组相比,miR-148b,mIR-151,mIR-183, miR-192,miR-26a,及miR-423的表达水平发生明显改变,并且该变化与砷浓度呈明显的剂量-反应关系(趋势检验P< 0.01)。运用实时定量PCR对上述6个microRNA的表达水平进行验证,结果表明miR-151,miR-183,miR-26a及miR-423 的表达水平随砷浓度变化具有显著的趋势性(P<0.05),miR-148b的趋势性检验结果在界值附近(P=0.0669),miR-192的表达不随砷浓度的变化而变化(P>0.1)。对具有差异表达的microRNA的功能预测及文献结果分析表明,这些microRNA在功能上与砷毒性的形成与肿瘤的发生发展有关。结论 大鼠接触砷污染饮用水,可以引起肝脏microRNA表达的改变。
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  T20.90 Apoptosis and apoptosis related genes effect of polysaccharide isolated from Volva of Bamboo-sun on murine hepatic carcinoma cell line H22

  XIAO Jia-yan;YE Jian-fang;LUO Peng

  2013, 27(S1): 406-406.

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  OBJECTIVE To study the anti-tumor activity mechanism of bamboo-sun(B-SPV). METHODS H22 were divided into two groups:control group (cells in serum-free culture medium), B-SPV treated group(cells in serum-free culture medium with 100, 500, 1000) . The logarithmic growth phase cells were equally distributed to 6 well plate, cultured under the same condition for 48 h. The percentages of apoptosis were determined using a fluorescein-activated cell sorting (FACS) technique. The expression of bax, bcl2, fas, faxL were analyzed by q-RT PCR in different groups. RESULTS FACS technique results showed that the percentage of the apoptosis cells was higher in B-SPV treated group than in the control group(P<0.05). The inhibition ratio was dependent on B-SPV concentration. The expression of fas and fasL mRNA was similar in two groups. But the expression of bax and bcl2 were elevated in H22 by treating with B-SPV. The ratio of bax/bcl2 expression was much higher in B-SPV treated than in the control group(P<0.05). CONCLUSION B-SPV was shown to induce H22 apoptosis and affect the expression of some apoptosis-related genes of H22. many details of the molecular mechanism regulating apoptosis remain to be elucidated.
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  Adverse Outcome Pathways in aquatic environmental risk assessment：Progress & research challenges

  Tom HUTCHINSON

  2013, 27(S1): 411-412.

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  The historical approach to protecting human health and ecosystem quality from the adverse effects of chemicals is focused primarily on whole animal toxicity testing with individual chemicals of interest. As observed recently by the OECD (2013), due to the costs and time involved it is neither practical nor feasible to comprehensively test all synthetic chemicals that could affect human health and ecosystem quality using this traditional approach. Aquatic eco-toxicology developed internationally since the 1960s primarily using a whole organism approach, combined with expertise in chemistry, ecology and microbiology in order to restore polluted ecosystems and prospectively undertake toxicity testing on individual chemicals using individual model species. For example in European regulatory ecotoxicology, aquatic toxicity testing has often focused upon freshwater fish, crustaceans and algae and the combined results used to derive Predicted No Effect Concentrations (PNEC) for both freshwater and marine ecosystems. PNECs are then typically compared with Predicted Exposure Concentrations (PEC) and Measured Exposure Concentrations (MEC) in order to undertake an initial environmental risk assessment of the single chemicals of concern. In some cases refining the environmental risk assessment may require aquatic toxicity testing using a wider range of freshwater or marine species according to the pattern of use of the chemical of interest or in view of enhanced environmental exposure information (Hutchinson et al, 2013). Extrapolation from the model species included in the OECD Test Guidelines (eg chironomids, daphnids, zebrafish, etc) to the wider ecosystem of interest is recognised to pose a major scientific challenge. A notable example of the scientific weaknesses of this historical approach is the unexpected long-term reproductive impacts on fish and invertebrates of oestrogens and other endocrine disrupting chemicals often discharged into lakes, rivers and coastal ecosystems. Over the past decade therefore the OECD Test Guidelines programme has markedly grown in order to address developmental and reproductive toxicity in amphibians and fish, while new test guidelines to assess the effects of chemicals on freshwater and marine molluscs are currently undergoing validation by several OECD member countries. In parallel with these developments to broaden the range of species used in aquatic ecotoxicity testing, there been major advances in recent years in the availability and application of toxicogenomics and other molecular tools in fish and other aquatic species. An excellent example is the increasing use of zebrafish in both biomedical research and in eco-toxicology, utilising the rapidly developing toolbox of genomic and cellular techniques available for this species. Encouraged by the progress being made in chemical safety testing to protect human health, many scientists working in eco-toxicology and environmental risk assessment and now embracing the Adverse Outcome Pathway (AOP) methodology to support regulatory toxicity testing and risk assessment (Ankley et al, 2010). It is important to recognise that the AOP concept uses existing techniques and links them with systems biology rather than being a completely new testing approach. In this context an AOP is defined as "a conceptual construct that portrays existing knowledge concerning the pathway causal linkages between the molecular initiating event and a final adverse effect at the biological level of organisation that is relevant to a regulatory decision" (Ankley et al, 2010;OECD 2013). Toxicogenomic tools are now available for a number of aquatic species used in the OECD test guidelines programme, notably fathead minnow, medaka, Xenopus laevis and zebrafish. However a critical challenge is the need for phenotypic anchoring data linked to the genomic responses in these species following defined exposures to a range of chemical classes of interest (eg agrochemicals, industrial chemicals and pharmaceuticals). The second major challenge is the need for the development and validation of toxicogenomic tools for use with freshwater and marine invertebrates. Finally in the field of aquatic eco-toxicology there is the need to continue to improve the basis for predicting and monitoring population impacts of chemical exposures based on single species laboratory studies (Hutchinson et al, 2013). A number of chemical case studies illustrating the progress being made for AOPs in aquatic organisms will be presented.
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  Molecular initiating events in Adverse Outcome Pathways——The chemistry perspective

  Paul J RUSSELL

  2013, 27(S1): 412-412.

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  Consumer and environmental safety decisions are based on exposure and hazard data interpreted using risk assessment approaches. The Adverse Outcome Pathway (AOP) conceptual framework has been presented as a logical sequence of events or processes within biological systems which can be used to understand adverse effects and refine the current risk assessment practice. Although originally described as an approach to ecotoxicology risk assessment, this has now been extended into the human safety area. The AOP shifts the risk assessment focus from traditional toxicological apical endpoints to the development of increased mechanistic understanding of a chemical's interactions and effects at a molecular level. Within the AOP framework the molecular initiating event (MIE) is defined as the first point of chemical-biological interaction within an organism which starts the adverse outcome pathway. Fundamentally MIEs can be considered as molecular interactions occurring in a dynamic and complex matrix system. The properties of the matrix will strongly influence the kinetics of the reaction and the mechanisms involved through variations in pH, lipophilicity, protein content, etc. These interactions will in turn define the qualitative and quantitative aspects of the MIE along with the biokinetic and biodynamic profile of a chemical. Identification of key MIEs can be approached from either an exposure or chemical driven approach or via a chemical's biological effect. For the former, predictive chemistry techniques including quantitative structural activity relationships can be developed based on existing data and through mapping networks of chemicals, MIE's and subsequent pathways. To develop a retrospective response based approach, in-vitro assays can be used to provide a biological signature for a chemical. This data can be used to inform a risk assessment both from a hazard perspective and also to provide additional evidence for read-across to toxicologically similar chemicals of established pathways. To obtain this level of detail in a pathway, chemistry in all its disciplines has a key role to play. Measurement techniques will be important in understanding chemical characterisation, free concentration and exposure at the site of interest. Such measurements will be vital in developing structure based toxicological alerts and informing predictive models. A thorough understanding of the physical chemistry will inform the mechanisms involved and help identify those key experimental or predicted values required to build a model.
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  ToxCast approaches to high throughput risk assessments：Pathways-based TK/TD

  Richard JUDSON

  2013, 27(S1): 413-414.

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  A [JP2]significant challenge in toxicology is the "too many chemicals" problem. Humans and environmental species are exposed to as many as tens of thousands of chemicals, few of which have been thoroughly tested using standard in vivo test methods. This talk will discuss several approaches to dealing with this problem being developed by the U.S. EPA, under the umbrella of the ToxCast program (http://epa.gov/ncct/toxcast/). The overall problem is broken into several tasks: (1) identifying biological pathways, that when perturbed can lead to toxicity;(2) developing high-throughput in vitro assays to test chemical perturbations of these pathways;(3) identifying the universe of chemicals with likely human or ecological exposure;(4) testing as many of these chemicals as possible in the relevant in vitro assays;(5) developing hazard models that take the results of these tests and identify chemicals as being potential toxicants;(6) generating pharmacokinetic data on these chemicals to predict the doses at which these hazard pathways would be activated;and (7) developing exposure models to identify chemicals for which these hazardous dose levels could be achieved. This overall strategy will be described and briefly illustrated with examples from the ToxCast program. Further details of these steps are as follows: 1. Candidate pathways of toxicity, also referred to as Modes of Action (MOA) or Adverse Outcome Pathways (AOPs), were derived from surveys of the literature and discussions with experts. Many of the pathways tested involve pharmaceutical targets, which could lead to adverse effects if improperly activated (off-target toxicity) (Ankley et al 2010;Boobis et al 2008;Meek et al 2003). 2. In vitro assays were obtained from commercial testing laboratories, from in-house labs at the EPA, from collaborators at the U.S. NIH Chemical Genomics Center (NCGC) and from academic partners. In total, there are over 700 assays being used as part of the ToxCast program. These cover a large range of technologies, including cell-free biochemical assays;assays targeting nuclear and other receptors and other molecular targets;assays measuring downstream integrated cell processes;and model organisms (especially zebrafish)(Chandler et al 2011;Dix et al 2007;Houck et al 2009;Judson et al 2010;Knight et al 2009;Knudsen et al 2011;Rotroff et al 2013;Sipes et al 2013). 3. Chemicals for testing were nominated by U.S. agencies: EPA, NIH, FDA;various stakeholder groups (industry, academia and non-governmental organizations);international governmental agencies;and working groups of the OECD. These chemicals include pesticides, pharmaceuticals, food additives and food-contact substances, cosmetics ingredients, personal care ingredients and industrial chemicals(Judson et al 2012). 4. A total of 1800 chemicals are in the ToxCast library. These, plus an additional 6400 chemicals are also being tested by the NCGC in a selected subset of assays. This complete data set is being released publicly by the EPA in Fall 2013. [JP3]The data consists of concentration-response profiles for each chemical-assay pair, as well as a "hit-call", or determination of whether or not the chemical was active in the assay (http://epa.gov/ncct/toxcast/chemicals.html). 5. The in vitro data from ToxCast is being combined with in vivo toxicity data from guideline studies in the EPA Toxicity Reference Database (ToxRefDB, http://epa.gov/ncct/toxrefdb/). Using these two data sets, we are developing models that predict in vivo effects from in vitro assay measurements. Several preliminary models have been published, including ones for reproductive and developmental endpoints and cancer (Kleinstreuer et al 2013;Kleinstreuer et al 2011;Martin et al 2011;Reif et al 2010;Sipes et al 2011). These models use a combination of statistical and biologically-based modeling approaches. Currently, these models are being tested and refined using the newest ToxCast data. 6. In order to quantitatively predict in vivo toxicity, it is necessary to have an appropriate pharmacokinetic model. Here, we are using a method called Reverse Toxicokinetics (RTK) to make first order predictions of the scaling from ingested dose to blood concentration of the chemical. This approach requires that two experimental in vitro measurements be carried out: clearance of the parent chemical in primary hepatocytes, and the fraction unbound in the presence of plasma protein. These measurements have been carried out using both human and rat hepatocytes and plasma. The end result of the RTK process is a prediction of the oral dose at which each biological pathway will be activated (Rotroff et al 2010;Thomas et al 2013;Wetmore et al 2013;Wetmore et al 2012). 7. These biological pathway activating dose values (BPAD (Judson et al 2011)) can then be compared with estimated exposure levels. If individuals are exposed to levels in excess of the BPAD, then one could prioritize that chemical for further toxicity testing. On the other hand, if there is a wide safety margin (exposure is much less than the BPAD), then the chemical is of less concern. We are developing high-throughput exposure models for this type of application, under the EPA ExpoCast program. An important aspect of these models accurate estimation of uncertainty (Wambaugh et al 2013)
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  Future platforms for in vitro-based toxicity testing

  Mary MCBRIDE

  2013, 27(S1): 414-415.

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  ]Toxicity testing typically involves studying adverse health outcomes in animals subjected to high doses of toxicants with subsequent extrapolation to expected human responses at lower doses. The system relies on the use of a 40+-year-old patchwork of animal tests that are expensive (costing more than $3B per year), time-consuming, low-throughput and often provide results of limited predictive value for human health effects. The low-throughput of current toxicity testing approaches (which are largely the same for industrial chemicals, pesticides and drugs) has led to a backlog of more than 80 000 chemicals to which humans are potentially exposed whose potential toxicity remains largely unknown. In 2007, the National Research Council (NRC) released the report "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy", that charted a long-range strategic plan for transforming toxicity testing. The major components of the plan include the use of predictive, high-throughput cell-based assays (of human origin) combined with high-content multi-omics measurements, computational systems biology models and pharmacokinetic tools to evaluate perturbations in key cell-signaling pathways and to conduct targeted testing against those pathways. By integrating all of these tools -termed "integrated systems toxicology" it may be possible to map and annotate toxicity pathways, conduct systems analysis of pathway function, and link pathway perturbations to cell and tissue responses thereby enabling both dose-response modeling and in vitro to in vivo extrapolation. This approach will greatly accelerate our ability to test the vast "storehouses" of chemical compounds using a rational, risk-based approach to chemical prioritization, and provide test results that are far more predictive of human toxicity than current methods. Toxicity pathways are simply normal cell signaling pathways that are susceptible to chemically-induced perturbations. [JP2]Typical toxicity pathways include stress responses-such as DNA damage, oxidative stress, hypoxia, endoplasmic reticulum damage, metal stress, etc-and receptor-mediated responses-such as that occurring through nuclear hormones, among others. Although a number of toxicity pathways have already been identified, most are only partially known and no common annotation exists. Mapping the entirety of these pathways (ie the Human Toxome) will be a large-scale effort, perhaps on the order of the Human Genome Project. Agilent Technologies has partnered with key toxicology thought leaders to establish a research consortium comprised of life science tools providers, industrial companies, academics and not-for-profit organizations to conduct a project intended to demonstrate how a deep knowledge of cell signaling pathways could be directly used to conduct human health risk assessments. Using a case study approach focused on a few key prototype nuclear receptor and stress-response pathways, we are applying an integrated systems toxicology approach to map and model these pathways. The goals of this program are to: (1) develop in vitro assays for relevant compounds in appropriate cells/tissues;(2) use a suite of tools to create a dense data stream on dose response;(3) apply bioinformatics tools to infer pathway circuitry while generating a computational systems biology model of the circuitry, and 4) create dose-response curves for the various assayed endpoints. In a related effort, a consortium of researchers led by Dr. Thomas Hartung at The Johns Hopkins University, have begun to map estrogenic pathways in human breast cancer cells using a combination of transcriptomics and metabolomics (http://altweb.jhsph.edu/news/current/caatnihgrant.html). In this talk, we describe these research consortia in more detail. We also describe the suite of technology platforms used in these studies and show how these tools are being and have been applied in our studies. We can now identify specific technologies and experiments that will accelerate completion of the first-phase of pathway mapping and modeling. We also discuss how these integrated data packages are shaping, informing and modifying our conventional views of toxicity pathways.
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  From integrated signaling networks to high content microscopy：Systems approaches for TT21C

  Erik HJ DANEN

  2013, 27(S1): 415-416.

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  Toxicogenomics has played a major role in the past decade to uncover cellular stress responses that underlie chemical-induced adverse reactions at the cellular as well as organ level and subsequently apply transcriptomics-based classifiers to predict adverse outcome. The question remains what functional role these stress response pathways as well as the individual genes that underlie these stress responses play in the onset of adversity. We have integrated transcriptomics, phosphoproteomics, and RNA interference (RNAi) approaches and used time-resolved live cell high content imaging of cellular stress responses to identify critical cell signaling components that determine the breaking point from adaptation to cell stress versus maladaptation and onset of cell death. In pluripotent stem cells, DNA damage triggers loss-of-pluripotency and apoptosis as a safeguard to exclude damaged DNA from the lineage. An intricate DNA damage response (DDR) signaling network ensures that the response is proportional to the severity of the damage. We combined an RNAi screen targeting all kinases, phosphatases, and transcription factors with global transcriptomics and phosphoproteomics to map the DDR in mouse embryonic stem cells treated with the DNA crosslinker cisplatin. Integrated networks derived from canonical pathways shared in all three datasets, were implicated in DNA damage repair, cell cycle and survival, and differentiation. Experimental probing of these networks identified, amongst others a novel, p53-independent mode of DNA damage-induced Wnt signaling that limits apoptosis. Our findings reveal a balance between p53-mediated elimination of stem cells, through loss-of-pluripotency and apoptosis, and Wnt signaling that attenuates this response to tune the outcome of the DDR. We currently explore several other newly identified signaling networks that modulate the outcome of the DDR. To further reveal the complexity of dynamic toxicity-related signaling events we have developed systems microscopy technologies. Here, quantitative live cell confocal imaging of dynamic cell biology processes is followed by quantitative multiparameter image analysis to provide cell-to-cell dynamic data for systems biology modeling. A range of BAC-GFP reporters has been developed and expressed in HepG2 lines for this purpose. We have used this approach to study the complex signaling involved in drug-induced liver injury (DILI), an important clinical problem that involves crosstalk between drug toxicity and the immune system. Transcriptomics analysis established critical drug-induced toxicity pathways that act in synergy with the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor α (TNFα) to cause cell death of liver HepG2 cells. Live cell imaging of oscillatory NF-kB cytoplasmic-nuclear translocations and activation of distinct gene reporters provided further insight into the joint regulation of these pathways by TNF and compounds associated with DILI in humans. Focused RNAi experiments and pharmacological inhibition is currently employed to probe these pathways for critical hubs in liver cells that are targeted by drugs and pro-inflammatory cytokines and control life/death decisions.
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  Mitochondrial toxicity and new China goals for TT21C/Adverse Outcome Pathways

  PENG Shuang-qing;GUO Jia-bin;YUAN Hai-tao;ZHANG Ting-fen;HOU Ming-yue;ZHAO Jun;LI Jin;Paul CARMICHAEL

  2013, 27(S1): 416-416.

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  Mitochondria are major sources of cellular energy and reactive oxygen species (ROS), playing fundamental roles in regulation of cell survival and death under pathological conditions. Numerous chemicals have shown to significantly induce mitochondrial toxicity in targeted organ such as liver and heart. Early identification of mitochondrial toxicity for chemicals is important for avoiding hazard exposure in human or environment. However, due to the complexity of mitochondrial toxicity which may involve multiple mechanisms, the assessment of mitochondrial toxicity based on animal test is unsatisfactory. The release of Toxicity Testing in the Twenty-First Century: Vision and A Strategy by the US National Research Council brings new perspectives to the strategy and methods on the assessment of chemical-induced mitochondrial toxicity. The development of toxicity testing of mitochondrial toxicity is also transforming expensive and lengthy traditional in vivo animal tests to in vitro high-throughput alternative methods with quantitative parameters analysis and mechanistic exploration. Recently, many in vitro alternative methods have been established for accessing chemical-induced mitochondrial toxicity, such as high content screening, mechanism-based toxicity testing (eg, mitochondrial membrane potential, ATP production, oxygen consumption rate, oxidative phosphorylation, and mitochondrial superoxide generation). In particular, adverse outcome pathway (AOP) for mitochondrial toxicity is highlighted to get a better mechanistic understanding and in vitro to in vivo extrapolation. Mitochondrial AOP integrates from chemical characterization to molecular initiating event (MIE) and population response. A significant effort has been made by Chinese scientists to establish and develop Chinese TT21C/AOP. Based on previous studies in toxicological alternatives, many new projects have been carried out using TT21C strategies to access toxicity of various chemicals.
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  RTCA实时无标记细胞分析技术在毒理研究中的应用

  唐炜

  2013, 27(S1): 417-417.

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  研究外源因素(化学、物理、生物等因素)对生物机体的损害作用及其作用机理是毒理学研究的一个重要方面。RTCA技术能实时、动态地检测细胞存活和药物毒性，获取细胞对外源因素的动态应答图谱。借助动态细胞应答图谱能够全面分析外源物质的毒性及其作用机理，为外源物质的细胞效应提供综合的分析工具。基于RTCA技术的毒理学研究已广泛应用于环境毒素的评估、微生物病原体的检测及化妆品工业中的毒性检测等领域。
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  基于RTCA实时动态心肌细胞功能检测的药物心脏安全性研究

  吴洁颖

  2013, 27(S1): 417-417.

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  在过去的20多年中，有相当数目的药物因为具有心脏毒性而被撤出市场。药物研发的早期对先导化合物或者候选药物进行心脏毒性评价对降低新药研发的财务风险、提高新药研发的成功率有着极其重要的意义。基于阻抗的RTCA Cardio实时心肌细胞功能分析技术，采用无标记、非侵入的方法，实时动态监测心肌细胞的搏动，在相对生理条件下对先导化合物的进行临床前心脏安全评估，具有良好的灵敏度和预测性。RTCA Cardio分析系统的实时数据采集、对心肌细胞律动活性的动态检测及96孔高通量检测等特点，可同时提供化合物对心脏的毒性及其作用机制等方面的信息。
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  药物研发过程概述及毒理学在其中的作用

  张海洲

  2013, 27(S1): 417-418.

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  创新药物的研发是一个漫长而且昂贵的过程。根据最新统计，一个创新药物从其早期研究到最终上市要花大概10年左右的时间，而与其相关的研发费用平均大约要10亿美元。此外，创新药物的研发还是一个需要不同学科合作的复杂的系统工程。毒理学是这项系统工程中所需学科之一。从传统意义上来看，毒理学通常是在创新药物研究阶段的中晚期才开始介入，但近年来毒理学逐渐越来越早地介入药物的研究阶段，大部分创新药物研发项目在立项时就进行毒理学的评价。在过去的10多年中，这种毒理学应用的新趋势以及新技术和新方法在毒理学中的不断应用有效地帮助药物研发机构降低由于药物安全所造成的创新药物研发的失败。本演讲介绍了创新药物的研发过程，同时也总结了毒理学在药物研发过程不同研发阶段中的作用，非常适用于刚刚进入药物研发机构的毒理学家和对药物研发感兴趣的其他科研人员。
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  药物候选物剔除决策：国内制药公司的经验

  袁开红

  2013, 27(S1): 418-418.

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  本报告主要包括4个方面的内容,一是药物候选物剔除的基本简况,药物剔除过程可能发生于新药研发的各个阶段，包括临床前，如药学、药效、药代、安全性以及临床研究阶段，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床中；二是介绍hERG活性检测在化合物早期筛选中的作用；三关于CYP450在化合物早起筛选中的作用；最后对6个临床研究终止案例进行分析。
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  T2.22 沙尘天气细颗粒物对缺血性心血管疾病日门诊人数的影响

  杨振华;张月霞;张全喜;卢彬;张剑;孟紫强

  2013, 27(S1): 37-37.

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  目的 研究沙尘天气大气细颗粒物(PM_2.5)与缺血性心血管疾病每日门诊人数的联系。方法 采用半参数广义相加泊松回归模型(GAM),在控制了时间长期趋势、季节趋势、气象因素、日历效应等混杂因素影响的基础上,分析2004年3月1日-5月31日沙尘暴频发区甘肃省武威市大气PM_2.5与缺血性心血管疾病每日门诊人数的关系。结果 (1) 单污染模型发现,PM_2.5对男、女性缺血性心血管疾病门诊人数的影响分别在lag1和lag5有统计学意义;NO₂对男性缺血性心血管疾病门诊人数的影响在lag2有统计学意义;SO₂对男性缺血性心血管疾病门诊人数的影响在lag3和lag5有统计学意义。(2) 双污染模型分析结果表明,引入NO₂后,PM_2.5对男性缺血性心血管疾病门诊RR的影响有所下降,但仍有统计学意义;在引入NO₂或PM_2.5之后,SO₂对男性心血管病门诊RR的影响仍具有统计学意义。对于女性缺血性心血管病门诊人数,在引入PM_2.5之后,SO₂的影响仍具有统计学意义。(3) 多污染模型分析也指出, 对于男性心血管病门诊人数,在引入PM_2.5与NO₂后,SO₂的影响仍具有统计学意义;在引入其他污染物后,PM_2.5或SO₂或NO₂对女性缺血性心血管疾病门诊RR的影响均无统计学意义。(4) 沙尘天气PM_2.5浓度分类分析表明,从正常清洁天、轻度污染天到扬沙天气、沙尘暴天气,随着PM_2.5浓度水平的增大,缺血性心血管疾病门诊RRL也随之增高,且呈现一定的剂量效应关系。结论 (1) 沙尘天气细颗粒物可引起暴露居民缺血性心血管疾病门诊人数增加,且表现为滞后效应。(2) PM_2.5浓度与缺血性心血管疾病门诊相对危险度(RR)存在一定的剂量效应关系。(3) 男性与女性居民缺血性心血管疾病日门诊相对危险度随沙尘天气的强度增大而增大:正常清洁天<轻度污染天<扬沙天<沙尘暴天。(4) 以大气PM_2.5浓度水平划分沙尘天气类型比以能见度划分更为科学可靠。
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  T2.54 亚慢性铝暴露大鼠脑RARβ调节α-ADAM10分泌酶的机制

  胡佳丽;王林平;牛侨

  2013, 27(S1): 54-54.

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  目的 经麦芽酚铝对大鼠亚慢性染毒,探讨铝是否通过RARβ受体调节α-ADAM10分泌酶的机制。方法 健康雄性SD大鼠腹腔注射Al³⁺ 0.4,0.8和1.2 mg·kg^-1·d^-1,连续5 d,休息2 d,共2月。处死大鼠,取大脑皮质和海马分开保存于-80℃。Western blot法检测RARβ受体和α-ADAM10分泌酶的表达。结果 铝可以使大鼠皮质和海马蛋白表达呈明显下降趋势,与对照相比差异有统计学意义(P<0.05)。RARβ受体受到铝影响而抑制表达,从而使大鼠皮质和海马α-ADAM10分泌酶表达呈下降趋势,与实验对照相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 铝的神经毒性可能是因为AL³⁺抑制RARβ蛋白表达从而进一步使在Aβ溶解途径中起关键作用的α-ADAM10分泌酶受到抑制有关。
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  T2.55 壬基酚对秀丽隐杆线虫的生殖毒性

  杨栋;刘冉;尹立红

  2013, 27(S1): 54-54.

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  目的 评价壬基酚(NP)对秀丽隐杆线虫的急性毒性和生殖毒性。方法 实验所用秀丽隐杆线虫为雌雄同体野生株(N₂),将同步化后的L4期线虫暴露在含有不同浓度NP(100, 10和1 mg·L^-1, 100, 10和1 μg·L^-1、溶剂对照、空白对照)的OP₅₀琼脂培养基上,24 h后在体视显微镜下计算线虫的LC₅₀;在同样的暴露条件下,暴露结束后每条线虫单独一个培养皿,每隔12 h后线虫转至新的培养皿,直至产卵结束,体视显微镜下统计该线虫所产的总后代数目;线虫暴露后,获取线虫所产的一个后代,记下该时间点,观察该后代产卵时间点,两时间点时间之差即为世代时间。结果 急性毒性实验结果显示,线虫存活数目在NP暴露的各个剂量组与对照组之间均无统计学差异(P>0.05),提示在现有最高染毒剂量下秀丽隐杆线虫未表现出急性毒性;生殖毒性试验结果显示,线虫的后代数目在各个剂量组之间无统计学差异(P>0.05),均数在132~163个之间;线虫暴露的剂量组与空白对照组的世代时间相比较有统计学差异,最高剂量组与空白组比较世代时间差小于3 h,由于最高剂量组的暴露水平远高于壬基酚的环境暴露水平,这一统计学差异未体现出显著的生物学意义。结论 秀丽隐杆线虫暴露于NP的LC₅₀大于100 mg·L^-1,参考急性毒性染毒数据推测NP对秀丽隐杆线虫的急性毒性属于低毒;此外,环境暴露水平的NP对秀丽隐杆线虫未显示显著的生殖毒性评价NP的生殖毒性,尚不能表明对其有明显的生殖毒性。
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  T2.24 SO₂暴露对哮喘大鼠Th1/Th2平衡及TNF-α和Foxp3表达的影响

  李瑞金;孟紫强

  2013, 27(S1): 38-38.

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  目的 探讨SO₂暴露对哮喘大鼠肺Th1/Th2型细胞因子干扰素γ(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和叉头状转录因子3(Foxp3)表达以及血清免疫球蛋白E(IgE)水平的影响。方法 将健康雄性清洁级Wistar大鼠随机分为正常组、SO₂暴露组、卵蛋白(OVA)致敏哮喘组、SO₂和OVA联合作用组,采用荧光实时定量RT-PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot方法研究吸入SO₂对哮喘大鼠肺或肺泡灌洗液(BALF)IL-4, IFN-γ, TNF-α和Foxp3基因表达的影响,并采用ELISA测定各实验组大鼠血清中IgE水平。同时,采用HE染色法观察大鼠肺组织病理学变化。结果 与对照组相比,哮喘组大鼠肺IL-4和TNF-α mRNA和BALF中IL-4和TNF-α水平和血清中IgE水平显著或极显著升高,肺IFN-γ和Foxp3 mRNA和BALF中IFN-γ和肺中Foxp3蛋白水平显著或极显著下降(P<0.05)。SO₂和OVA联合作用后,与哮喘组相比,IL-4和 TNF-α表达和血清中IgE水平显著或极显著提高,IFN-γ和Foxp3表达水平显著或极显降低(P<0.05)。SO₂暴露组IL-4和TNF-α表达水平和血清中IgE水平的增加以及IFN-γ和Foxp3表达水平的减少与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。OVA组大鼠肺组织出现支气管腔狭窄、黏膜上皮细胞增多、黏液分泌、肺泡间实质间隔面积明显扩大、炎性细胞浸润等病理学变化。SO₂+OVA组病理学变化更为严重。结论 SO₂暴露可上调哮喘大鼠IL-4和TNF-α转录和翻译水平,下调IFN-γ和Foxp3转录和翻译水平,具有增强Th2、抑制Th1细胞反应的作用,引起Th1/Th2失衡,增加IgE水平和气道炎症,加剧哮喘大鼠的病理学症状;SO₂致Th1/Th2失衡、增加哮喘风险的机制可能是SO₂吸入提高促炎因子TNF-α水平,TNF-α又介导Foxp3水平下降,而Foxp3蛋白表达的抑制,进一步增加IL-4表达,降低IFN-γ表达,增加血清IgE水平,加重哮喘大鼠气道Thl/Th2失衡;Foxp3是Thl/Th2平衡的上游调控因子,而Foxp3表达受到TNF-α调节,这可能是SO₂加重哮喘的免疫学机制之一。
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  T2.25 浅谈水生生物急性毒性限度实验浓度设计与我国GHS国标分类标准

  杨彩霞;张霞

  2013, 27(S1): 39-39.

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  我国环保部新化学物质环境管理办法(7号令)申报过程中,要求利用物质本身或其配制品的水生生物急性毒性测试结果,根据我国GHS国标进行分类。本文根据水生生物急性毒性OECD测试导则中关于限度实验浓度设置的要求和实测浓度与理论浓度的偏差,就目前申报过程中遇到的分类问题进行探讨。对于水生生物急性毒性实验,根据OECD和化学品测试方法,当预实验的结果表明物质在浓度100 mg·L^-1或者其在实验用水中的最大溶解度时无毒,那么应进行浓度为100 mg·L^-1(活性成分)或者饱和溶解度的限度实验,以确定LC₅₀/EC₅₀是否大于100 mg·L^-1。实验室的操作是配制理论浓度为100 mg·L^-1(活性成分)的实验液或理论浓度为100 mg·L^-1的饱和溶液进行限度实验。然而在依据限度实验结果进行危害分类时,根据要求,急性毒性LC₅₀/EC₅₀>100 mg·L^-1时,物质分类为低毒;如需实测浓度达到100 mg·L^-1,那么在进行限度实验时,需要根据物质的水溶解度、在水中的稳定性等特性重新计算限度实验的设置浓度。如对于溶解度大于100 mg·L^-1且在实验条件下稳定的的化学物质,限度实验处理组浓度可设置为130 mg·L^-1;那么如果物质在水中的溶解度<100 mg·L^-1,限度实验时只能以理论浓度为100 mg·L^-1的实验介质中的饱和溶液进行。实验期间,实测浓度必定小于100 mg·L^-1,那么此时以实测100 mg·L^-1进行分类就可能判定为中等毒性。OECD 201 (2006) 第39条和OECD 202(2004) 第23条以及化学品测试方法中均指出,如果有证据表明在测试过程中,受试物的实际浓度能维持在理论浓度或初始测定浓度的20%范围内,则可以基于理论浓度或初始测定浓度进行结果分析。如果受试物实际浓度和理论浓度或初始测定浓度的偏差超过20%,则应基于整个测试过程中的几何平均浓度或根据物质的浓度衰减模型进行结果分析。值得注意的是,当实验结果表明受试物对水生生物有毒性,并得到了相应的半数致死浓度或效应,根据实测浓度进行分类是科学的。但如果实验结果表明受试物对水生生物无毒性,那么若依据限度实验的实测浓度进行结论,就有可能高估化学物质的毒性进而需要将水生生物急性分类为中等毒性(类别3)。根据新化学物质危害性鉴别导则环境管理类别划分,水生生物急性毒性类别1~3均作为危险类化学物质进行管理,这样必将加重管理部门的工作负担和造成企业的人力物力资源的浪费。因此,在此建议相关专家考虑受试物的实际浓度偏差在20%之内即可依据理论浓度进行GHS分类的处理方式。
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  T2.70 应用EGFP评价方法研究环境样品的去甲基化表观遗传毒性

  王先良;朋玲龙;王菲菲;吕占禄;钱岩;满江红

  2013, 27(S1): 62-63.

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  目的 研究地表水、地下水、土壤等环境样品综合表观遗传毒性。方法 通过EGFP方法对淮河流域局部癌症发病关注地区的2个地表水、3个地下水、2个土壤、2个底泥样品的重金属提取液进行去甲基化表观遗传毒性测试。EGFP去甲基化表观遗传毒性评价方法基本原理为,pEGFP-C3质粒通过人工甲基化处理获得荧光蛋白基因启动子区处于高甲基化状态的C3质粒,并将其转染进人类HepG-2肝癌细胞株,随后以该改造细胞株(EGFP HepG2)为主要工具载体,与受试物进行共培养,依据细胞绿色荧光强度来定量评价受试化学物的去甲基化功能的强弱。同时通过电感耦合等离子体质谱法(ICP/MS)对提取液的成分进行扫描检测分析,探索影响样品综合去甲基化能力的主要组成成分。结果 在9个测试样中,有7个显示出可以观察到的去甲基化表观遗传毒性,占测试样品的78%。其去甲基化表观遗传毒性当量介于0.065~0.257 μmol·L^-1的5-Aza-CdR之间。其中一个底泥样品毒性最高,毒性当量为0.257 μmol·L^-1的5-Aza-CdR;重金属检测发现这个样品中Cd的浓度为1.62 mg·kg^-1,超过土壤中的标准限值1.00 mg·kg^-1;一个地下水样品的毒性较高,毒性当量为0.142 μmol·L^-1的5-Aza-CdR;重金属检测发现其中的Mn的浓度为4868.87 μg·L^-1,超过土壤中的标准限值300 μg·L^-1。在4个存在超标的土壤或底泥样品中,有3个被检测出具有可以观察到的去甲基化表观遗传毒性。环境样品表观遗传毒性检测结果也与环境分析结果具有基本一致的趋势。结论 部分环境样品去甲基化能力较强,具有不容忽视的表观遗传毒性。
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  T2.71 氧化石墨烯联合砷对小麦生态毒性

  胡献刚;康佳;卢凯成;周启星

  2013, 27(S1): 63-63.

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  目的 分析氧化石墨烯联合砷(As⁵⁺)对小麦种子及幼芽的生态毒性的作用,并探讨氧化石墨烯对砷生物吸收的影响。方法 实验利用小麦发芽实验在培养箱中使小麦萌发。砷设置空白组和污染组(10 mg·L^-1), 联合毒性设置氧化石墨烯浓度为0, 20和200 mg·L^-1。 5 d培养结束后用根冠仪分析小麦的生长发育情况, 运用紫外分光光度计显色反应分析叶绿素浓度、抗氧化酶活性,最后利用液相色谱串联电感耦合等离子质谱仪分析生物体内的砷的浓度及形态。结果 少量的砷(10 mg·L^-1)促进了种子的萌发,不同浓度氧化石墨烯对种子萌发影响并不显著,然而氧化石墨烯联合砷显著地抑制了小麦种子的萌发(P<0.01)。与对照组相比,氧化石墨烯与砷能限制抑制小麦幼苗体内叶绿素的合成。单污染物及复合污染暴露均使丙二醛及抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶)活性发生了提高,其中复合污染提高的更加明显(P<0.05),说明种子萌发过程中对砷和氧化石墨烯复合污染发生了显著氧化应急。种子萌发过程中能吸收大量的砷,且氧化石墨烯加剧了小麦对砷的吸收。另外,在复合污染过程中,砷的形态发了变化,5价砷向3价和甲基砷发生了转化。结论 氧化石墨烯对小麦萌发有一定的毒性,并能显著增强砷对小麦萌发的毒性,应注意氧化石墨烯与其他污染物的协同作用。
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  水环境基准与流域水质目标管理

  孟伟

  2013, 27(S1): 2-2.

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  流域水质目标管理技术强调以追求人体健康和水生态系统安全为水环境目标,以"分区、分级、分类、分期"为理念的水环境管理模式,包括流域水生态功能分区、水环境质量基准与标准、水环境容量总量控制、水环境风险与预警、最佳可行技术等。水环境基准是流域水质目标管理的基础和根本。我国早期水环境基准研究基础薄弱,现行环境质量标准主要是参照国外水质基准与标准研究成果而制定,基于我国严峻的水环境污染形势,"十一五"启动了系统的水质基准研究,目前取得了重要研究进展:(1)基本建立我国水环境基准技术框架体系。建立了特征污染物筛选、水生生物基准、水生态学基准、营养物基准、沉积物基准等技术方法,拟出版我国第一版《水环境基准绿皮书》;(2)初步建立我国水环境基准研究平台。提出了"3门6科"我国最少毒性数据需求原则及"4门10种"受试水生生物名单,突破"生物效应比"、"水效应比"等水质基准关键技术,筛选驯养了麦穗鱼、中国青鱂等我本土基准研究受试生物,初步具备了研制本土水环境基准的能力和平台;(3)结合我国水环境特征及辽河流域区域特征,研究提出氨氮、重金属等重点污染物的国家、流域及区域(清河、太子河、辽河口等)水环境基准阈值,探索了水环境基准向标准转化的技术方法,支持了我国地表水水质标准(GB3838-2002)的修订,基于基准阈值制定的流域区域TMDLs方案为辽河流域的水质目标管理示范提供了技术支持。
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  现代毒理学在环境与健康研究中的作用

  江桂斌

  2013, 27(S1): 2-2.

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  与快速发展的科学技术相比,我国在民生领域特别是环境健康领域的研究十分薄弱。由于经济的快速发展,发达国家百年发展过程经历的不同污染阶段所产生的健康问题在我国集中显现,污染导致的重大疾病日趋严重且原因不明。由于环境污染的自身特点,污染所致健康危害与发达国家差异显著,环境与健康研究无法照搬国外模式。当前,环境与健康研究关心的科学问题集中在以下四个方面:① 恶性肿瘤等区域重大疾病高发的环境暴露组;② 污染物与生物分子交互作用及污染暴露毒性作用的分子机制;③ 污染所致机体损伤和疾病发生的基础。④ 预防和控制重大疾病的思路与措施。在研究层面,针对我国当前环境污染暴露所产生的健康危害研究,探讨环境污染与健康效应研究的理论和方法;通过探讨污染物与生物分子交互作用的毒性通路干扰机制而建立新方法与新模型;研究污染诱发的遗传/表观遗传损伤特征;研究环境污染所致的可逆表观遗传修饰成为污染致病早期预警信号的可行性。通过交叉合作研究,揭示区域疾病高发的环境污染原因,确定污染与健康损伤的分子机理,是本领域研究的重要课题。在技术途径和方法学层面,现代毒理学是跨接环境与健康的桥梁,是解决环境与健康若干科学问题的重要工具。通过现代毒理学和暴露组学的系统研究,能够准确地把握和确定环境的污染水平、演变趋势、生物效应和剂量-效应关系,从而开展符合实际的健康风险评估并制定有效的预防、干预和控制措施。
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  T1.5 肥大细胞在噁唑酮诱导的结肠炎中的作用

  褚洪迁;吴双;尚兰琴;郝卫东;魏雪涛

  2013, 27(S1): 12-13.

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  目的 探讨肥大细胞在噁唑酮诱导的大鼠结肠炎中的作用。方法 将SPF级BN大鼠用450 μl 3%噁唑酮[溶于AOO(4份丙酮1份橄榄油)中]涂抹背部致敏, 第8天用300 μl 1%噁唑酮(溶于50%乙醇中)灌肠, 制备模型。建模成功后,将模型组随机分成模型对照组和曲尼司特组,用0.5 ml 20 mg·kg^-1曲尼司特(溶于1.5%羧甲基纤维素钠中)灌肠,连续给药5 d,观察疾病活动指数(DAI)、结肠组织病理学变化、血清和结肠组织匀浆炎性因子IL-13与TNF-α的变化以及髓过氧化物酶(MPO)活性。结果 模型对照组DAI、组织学评分明显高于正常对照组和曲尼司特组(P<0.01);模型对照组结肠组织匀浆IL-13, TNF-α水平,MPO活性高于正常对照和曲尼司特组(P<0.05);模型对照组血清IL-13水平高于正常对照和曲尼司特组(P<0.05);正常对照组血清IL-13水平高于曲尼司特组(P<0.05);正常对照组MPO水平低于曲尼司特组(P<0.05);正常对照组结肠组织匀浆IL-13水平与曲尼司特组无统计学差异。组织病理学显示,模型对照组结肠可观察到杯状细胞破坏和炎症细胞浸润,曲尼司特组有轻微炎症细胞浸润,正常对照组无明显改变。结论 肥大细胞参与噁唑酮诱导的BN大鼠溃疡性结肠炎,肥大细胞膜稳定剂曲尼司特能够减轻噁唑酮诱导的BN大鼠溃疡性结肠炎。
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  T1.6 活性炭对阿维菌素经口急性中毒的疗效评价

  陈宵;李斌;张宏顺;郭翔;肖经纬;孙承业

  2013, 27(S1): 13-13.

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  目的 通过模拟人体体内环境、建立动物模型,评价不同条件下活性炭对阿维菌素的吸附效果并探讨口服活性炭对急性阿维菌素中毒家兔的治疗效果,为临床急性阿维菌素中毒的救治提供理论依据。方法 ① 体外实验:用人工胃液、人工肠液配制浓度为10, 5和2.5 g·L^-1的阿维菌素溶液,设活性炭组和对照组,于孵育10 min, 30 min, 1 h, 2 h和4 h后离心,紫外可见分光光度法测上清液中阿维菌素浓度,计算阿维菌素随时间的残留率和活性炭对阿维菌素的吸附率;② 动物模型:将家兔随机分为6组,每组6只:A组,低剂量染毒未干预组;B组,低剂量染毒20 min干预组;C组,低剂量染毒2 h干预组;D组,高剂量染毒未干预组;E组,高剂量染毒干预组;F组,溶媒对照组。低剂量为中毒剂量,是不引起受试对象(实验动物)出现死亡的最高剂量,即最大可耐受剂量(maximal tolerance dose, MTD或LD₀或LC₀),染毒剂量为5 mg·kg^-1;高剂量为致死剂量,在该剂量下,动物多在6h内死亡,染毒剂量为10 mg·kg^-1。低剂量组各组家兔于染毒后不同时相采集血液并获取全脑组织,用高效液相色谱-荧光检测法检测血浆及脑中阿维菌素浓度,绘制并计算毒代动力学曲线和相关参数,同时进行血清生化指标分析;观察高剂量组家兔中毒体征和死亡情况并做出相关评分。结果 ① 体外实验:人工胃液与肠液环境中,活性炭对阿维菌素均有吸附作用,且吸附效果随炭药比(活性炭与阿维菌素质量比)增加而增强? ② 动物模型:低剂量组A, B, C三组家兔间阿维菌素血浆浓度变化趋势和主要代谢动力学参数均有显著差异(P<0.05),其中B和C两组的曲线下面积分别只有A组的69%和58.8%,但清除率较A组提高了将近一倍,在峰浓度方面,B和C两组数值也比A组明显减低,差异有显著性;高剂量染毒组中,D组家兔中枢神经系统抑制体征严重,步态评分、肌束颤动评分、抽搐首发时间、抽搐分级以及死亡时间、死亡率等均明显高于E组。结论 活性炭在体外吸附阿维菌素效果良好,且与炭药比相关;在动物模型中口服活性炭明显减少阿维菌素在家兔体内的吸收,并加快阿维菌素在家兔体内的代谢,从而减轻家兔中毒体征,降低死亡率。
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  T1.8 芥子气对家兔的急性眼损伤作用

  张靖;李丽琴;鹿晓晶;石童;王陈

  2013, 27(S1): 14-15.

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  目的 通过芥子气对家兔的急性眼刺激性实验,观察并评价芥子气对眼部组织和结构的损伤作用。方法 芥子气用无菌生理盐水溶液稀释,超声乳化。向后倾斜固定家兔头部,轻轻提起一侧眼睑,将芥子气适当剂量直接滴于眼角膜上,染毒后松开双睑,任其自然闭合,染毒时尽量避免瞬间覆盖角膜;同时,将无菌生理盐水直接滴于另一侧眼角膜上,作为对照,双侧眼睛于24 h内不冲洗。实验设0.25, 0.15, 0.10和0.05 μg·cm^-2四个剂量组,每组4只兔(雌雄各半),给药体积为0.1 ml/只。染毒后定时观察,根据观察指标的反应性质及其可逆性进行评价,获得眼刺激性各观察指标的评分,根据评分进行眼刺激程度的分级评价。结果 0.25 μg·cm^-2剂量组的平均加权分数为:总积分91.75>50,且第7天>20,属于重度刺激性。0.15 μg·cm^-2剂量组的平均加权分数为:总积分71.25>50,且第7天≤20,半数以上动物第7天>10,且无任何一只动物第7天>30,属于重度刺激性。上述两个剂量组在给药后初期动物出现抓眼,眼睛严重流泪;在前6 h时主要为清水状泪液,致使眼周围和眼下大面积潮湿;6 h时眼睑结膜水肿严重、红肿较轻、有脓性分泌物产生、眼睑完全闭合或半闭合,通过2%的荧光素钠检查,可见角膜损伤,此时开始眼睑结膜和球结膜水肿减轻,但血肿和溃疡加重;1~2周出现眼睑瘢痕,但严重程度不同,并出现不同程度的对光反应迟钝甚至完全消失,继而出现失明。0.10 μg·cm^-2剂量组的平均加权分数为:总积分27.75,第7天≤20,半数以上动物第7天≤10,属于中度刺激性。0.05 μg·cm^-2剂量组的平均加权分数为:总积分14.25,属于轻度刺激性。结论 家兔眼部染毒芥子气的剂量高于0.15 μg·cm^-2时,对兔眼具有强腐蚀性和刺激性,会导致家兔眼角膜以及晶状体的严重损伤,多数动物出现角膜增厚、浑浊,严重的可导致失明。家兔眼部染毒芥子气的剂量低于0.10 μg·cm^-2时,对兔眼具有轻至中度刺激性,可引起轻度水肿,对眼部有轻微损伤作用。
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  T2.27 基于EST模型的全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用及其蛋白组学研究

  张莹莹;汤磊磊;黄玉洁;郑蓓;朱丹雁

  2013, 27(S1): 40-40.

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  目的 利用胚胎干细胞测试(EST)模型评价全氟烷基化合物全氟辛烷磺酸(PFOS),全氟辛酸(PFOA)和全氟丁基磺酸(PFBS)对小鼠胚胎干细胞(mESC)定向分化为心肌细胞的发育毒性作用。并利用氨基酸进行稳定同位素标记(SILAC)定量蛋白质组学探讨PFOS 致心肌发育毒性作用机制。方法 利用悬滴培养法建立EST模型,检测PFOS, PFOA和PFBS对mESC定向心肌细胞分化的影响获得产生50% mESC细胞分化抑制作用的浓度ID₅₀D3;采用MTT法检测受试物对mESC和3T3细胞产生50%细胞毒性作用的浓度IC₅₀D3和IC₅₀3T3,并依据发育毒性判定标准评定受试物的发育毒性等级和构效关系。利用SILAC定量蛋白质组学考察PFOS干预 mESC定向分化心肌细胞前后差异表达蛋白图谱,并根据每个鉴定蛋白至少包含两段鉴定多肽,且差异1.5以上的标准来筛选差异蛋白。用GO分析法对差异蛋白进行功能分类,通过网络数据分析确定蛋白功能,揭示PFOS 致心肌发育毒性作用靶标。结果 PFBS, PFOA 和PFOS的IC₅₀D3分别为4139, 470和291 μmol·L^-1, IC₅₀3T3分别为5980, 484和435 μmol·L^-1, ID₅₀D3分别为808, 223 和40 μmol·L^-1,心肌发育毒性等级分别为一级、二级、二级,且毒性强弱顺序为PFOS>PFOA>PFBS。具有一定构效关系,即碳链越长心肌发育毒性越大,末端磺酰化心肌发育毒性大于未磺酰化。SILAC标记蛋白组学显示,PFOS作用组筛选出176个差异蛋白,其中67个蛋白上调和109个蛋白下调。对差异蛋白进行GO分析显示,在分子功能方面有13个分类,细胞定位方面有12个分类,细胞生物学过程方面有10个分类。KEGG通路分析,共筛选到31个统计学上有显著意义的信号通路,主要涉及信号转导、脂代谢、能量代谢及酶代谢相关通路。在网络分析图中,差异蛋白对应基因与基因组中其他基因的相互作用共涉及到118个蛋白1296个相互作用。结论 基于EST模型全氟烷基化合物致心肌发育毒性强弱顺序为PFOS>PFOA>PFBS。通过SILAC 标记蛋白组学建立了PFOS 对mESC定向分化为心肌细胞蛋白质差异表达图谱,共鉴定出176个差异蛋白,其中67个蛋白上调和109个蛋白下调。差异蛋白涉及31个生化和信号通路,蛋白质相互作用网络图中共包含118个蛋白1296个相互作用。
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  T2.28 环境二噁英暴露人群中TNF-a和IL-6启动子区甲基化与体质量指数的相关性分析

  张晨;霍倩;李翠珍;于茂辉;吴庆

  2013, 27(S1): 41-41.

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  目的 探讨环境二恶因暴露人群外周血DNA中TNF-a和IL-6启动子区甲基化水平与体质量指数(BMI)的关联。方法 从垃圾焚烧厂周围某社区中随机选择无慢性病史及长期服药史的男性对象82名。采用半定量RT-PCR的方法检测研究对象外周血中CYP1A1基因mRNA水平作为二噁英等污染物内暴露的评价指标。同时,采用焦磷酸测序(pyrosequencing)技术测定外周血DNA中TNF-a和IL-6启动子区甲基化水平。运用多重回归模型分析BMI与细胞因子甲基化水平的相关性,以及CYP1A1基因的表达水平与基因甲基化的交互作用。结果 在二噁英暴露人群中,超重及肥胖组(BMI: 24 kg·m^-2~)的TNF-a启动子区甲基化水平为(11.77±2.05)%,较体重指数正常组(BMI: 18.5~23.9 kg·m^-2)的(12.83±2.26)%明显降低(P<0.05)。而IL-6启动子区甲基化水平在超重及肥胖组为(45.14±5.19)%,较体重指数正常组(42.67±4.83)%明显升高(P<0.05)。在多重回归分析中,调整年龄、吸烟、CYP1A1表达等因素后,仅TNF-a启动子区甲基化与BMI呈负相关(β=-0.75,95%CI:-1.35~-0.15;P<0.05),且与CYP1A1基因的表达水平之间存在交互作用(β=-0.95,95%CI:-1.65~-0.26;P<0.01)。结论 长期环境二噁英暴露的人群中,炎性细胞因子TNF-a基因甲基化水平的变化与超重和肥胖发生密切相关。
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  T2.57 pH和温度对丁硫克百威水解速率的影响

  邹品田;邵书念;陈珊;李双

  2013, 27(S1): 55-56.

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  目的 鉴定丁硫克百威的水解产物,研究温度和pH对其水解的影响,并推测可能的降解途径和机理。方法 丁硫克百威1mg/mL、克百威99.8%。 在不同pH值(5,7和9)和温度(25℃,37℃,50℃)下,经过不同的反应时间,利用Waters TQ MS液质联用仪鉴定水解产物。利用Waters Acquity H-Class超高效液相色谱对丁硫克百威和主要产物克百威进行浓度分析,并利用一级动力学方程C_t= C₀e^-kt计算水解速率常数K及半衰期T_1/2(h)。结果 对丁硫克百威水解产物进行一级质谱扫描,得到各主要产物的准分子离子峰(丁硫克百威和克百威为[M+H]⁺峰,克百威酚为[M+Na]⁺峰)。由动力学方程拟合计算得25℃ 时pH为5, 7和9的水解速率常数K分别为0.1414, 0.0030和0.0007,半衰期T_1/2分别为4.90, 231.47和1003.04 h;37℃ 时,三个pH条件下的K值分别为0.5822, 0.0106和 0.0051,T_1/2分别为1.19, 65.42和136.78 h;50℃时三个pH条件下的K值分别为1.3703, 0.0228和0.0055,T_1/2分别为0.51, 30.40和125.38 h。结果表明丁硫克百威的水解随温度的升高而加快,符合van't Hoff规则,每升高10℃,反应速度增加2~4倍。但阿累尼乌斯活化能随着温度的升高而下降,表现为37~50℃间水解反应速度的增加比25~35℃间有所减缓。同时在本文研究的pH值范围内,丁硫克百威的水解反应速率随pH的降低而增加;其一级水解产物克百威的水解速率则与溶液pH值成正相关。这种差异是由丁硫克百威和克百威不同的分子结构引起的。丁硫克百威的水解遵循SN2(双分子反应)机理,限制性步骤是氢氧负离子(OH^-)对氨基甲酸酯上的脂羰基的进攻,水解速度取决于OH^-浓度、苯并呋喃的特性以及生成酚的程度。靠近脂羰基的N-S键上的电荷受到苯并呋喃和脂羰基的影响,电荷密度减少,十分不稳定,因而N-S键最先受到攻击而断裂,表现为在酸性条件下的不稳定性,在中性和偏碱性条件下则水解缓慢。克百威的水解遵循E1Cb(共轭碱单分子消除反应)机制,限速条件为酚的pKa,即水解速度主要取决于OH^-浓度,实验结果也证实了在pH9的条件下,克百威迅速水解成克百威酚。结论 丁硫克百威在酸性条件下容易水解成克百威,在中性和偏碱性条件下水解缓慢,温度升高有利于促进水解。碱性条件下主要水解产物克百威易进一步水解为克百威酚。
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  T1.16 阿魏酸钠与苦参素联合用药对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

  裴晓坤;王伟;徐萌欣;张春雷;孙萌萌;孙松梅;刘志峰

  2013, 27(S1): 18-19.

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  目的 研究阿魏酸钠(SF)与苦参素(OMT)联合用药对小鼠酒精性肝损伤的作用。方法 小鼠随机空白对照组、酒精模型组、谷胱甘肽对照组、SF组、OMT组、三个复方组SF+OMT(3.1+6.9, 6.2+13.8, 12.3+27.7 mg·kg^-1·d^-1),小鼠灌胃酒精6 g·kg^-1造模,于造模前1 h和造模后8和23 h灌胃给药,24 h后取血,分离肝脏,测定生化指标。结果 与模型组比较,复方高、中剂量组小鼠肝干湿比明显降低,血清ALT, AST, TG水平明显降低,血清和肝组织SOD活性明显增高(血清高、中剂量组分别为48.72和43.12 U·ml^-1,模型组39.73 U·ml^-1;肝组织高、中剂量组分别为9.06和7.99 kU·g^-1蛋白模型组7.33 kU·g^-1蛋白,P<0.05),血清和肝组织MDA水平明显降低(血清高、中剂量组分别为5.45和7.54 μmol·L^-1模型组9.12 μmol·L^-1;肝组织高、中剂量组分别为1.10和1.26 μmol·g^-1蛋白模型组1.58 μmol·g^-1蛋白,P<0.01),血清和肝组织CRP水平明显降低(血清高、中剂量组分别为279.37和292.17 μg·L^-1模型组333.87 μg·L^-1;肝组织高、中剂量组分别为42.01和46.47 μg·g^-1蛋白模型组54.31 μg·g^-1蛋白,P<0.01),血清和肝组织IL-6水平明显降低(血清高、中剂量组分别为82.00和95.10 ng·L^-1模型组155.17 ng·L^-1;肝组织高、中剂量组分别为12.40和14.72 ng·g^-1蛋白模型组18.94 ng·g^-1蛋白, P<0.01),血清和肝组织NF-κB明显降低(血清高、中剂量组分别为436.46和475.74 ng·L^-1模型组530.16 ng·L^-1;肝组织高、中剂量组分别为86.73和93.85 ng·g^-1蛋白模型组105.02 ng·g^-1蛋白, P<0.01)。结论 SF和OMT联合用药对酒精性肝损伤有明显的保护作用,机制可能与其抗氧化和抗炎作用有关。
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  T1.17 组蛋白修饰在亚砷酸钠抑制细胞双链断裂修复中的作用

  章征保;李道传;牛林梅;陈雯

  2013, 27(S1): 19-19.

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  目的 筛选出参与亚砷酸钠抑制DNA双链断裂(DSB)修复过程的组蛋白H3甲基化和乙酰化修饰位点并初步探讨组蛋白修饰参与DSB修复的机制。方法 用0.1 μmol·L^-1,0.25, 0.5和1 μmol·L^-1的亚砷酸钠处理16HBE细胞24 h,检测处理组中组蛋白H3乙酰化和甲基化位点修饰的变化情况及相应的组蛋白修饰酶的改变。进行不同剂量亚砷酸钠处理细胞24 h后,使用喜树碱(CPT)处理16HBE 2 h后撤掉药物,通过检测γH2AX的恢复时间检测砷处理对于细胞的DSB损伤修复效应。利用不同剂量的亚砷酸钠染毒处理DSB修复检测系统:非同源末端重组修复能力检测细胞株140C和同源重组修复能力检测细胞株97A,明确亚砷酸钠抑制DSB修复的类型。选取砷染毒后差异修饰位点,用逆转录病毒感染方法在16HBE细胞中对这些位点进行突变并敲除特异性修饰酶,建立特定位点修饰缺陷的细胞模型,并进行γH2AX的恢复时间试验和DSB修复能力检测,明确特定位点修饰对于DSB修复的影响。结果 亚砷酸钠处理16HBE细胞可以引起H3K4me2,H3K9me3的明显升高,并能引起相应修饰酶NSD3和SUV39H1的表达改变。亚砷酸钠的处理可以引起16HBE细胞CPT处理后γH2AX的恢复时间延长,表明砷可以影响细胞DSB的损伤修复过程。DSB修复能力检测发现砷染毒降低了细胞HR的修复能力,表明砷可能通过影响HR通路抑制DSB修复过程。在16HBE细胞中构建了H3K4和H3K9突变细胞株分别为16HBE-H3K4A和16HBE-H3K9A,并检测发现2个突变细胞中H3K4me2和H3K9me3出现明显的下降,而相应的乙酰化修饰H3K4ac和H3K9ac在突变株中并未受到影响;同时在16HBE中构建了H3K4me2和H3K9me3的主要甲基修饰酶NSD3和SUV39H1的敲除细胞模型16HBE-siNSD3与16HBE-siSUV39H1,通过检测相应的H3K4me2和H3K9me3修饰验证敲除模型构建成功。γH2AX的恢复时间试验检测组蛋白修饰缺陷细胞株结果发现16HBE-H3K9A与16HBE-siSUV39H1的γH2AX的恢复时间与对照细胞相比均升高并且DSB修复能力检测显示他们均可抑制HR修复过程。结论 组蛋白修饰参与亚砷酸钠抑制细胞DSB修复过程。亚砷酸钠可以通过促进组蛋白修饰酶SUV39H1的表达提高细胞整体的H3K9me3修饰水平,从而抑制细胞HR的修复能力。
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  T9.10 表面电荷和氧化应激反应在氧化石墨烯导致的人肺纤维细胞的细胞毒性和遗传毒性中的作用

  王安欣;朱毅敏

  2013, 27(S1): 218-219.

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  目的 研究氧化石墨烯(GO)的安全性和毒性进行评估。方法 ① 从Alfa Aesar公司购买石墨片,应用Hammer的方法合成GO,对GO进行聚乙二醇(PEG)、乳糖酸(LA)和聚乙烯二胺(PEI)修饰,对所合成的GO及其衍生物用原子力显微镜和粒度仪等进行表征;② 使用的人肺纤维细胞(HLF)是培养在DMEM和 10%的胎牛血清中;③ 利用MTT检测方法评估细胞的活力;④ 流式分析检测细胞的凋亡情况;5 运用彗星实验检测材料的遗传毒性;6.通过测量细胞的超氧化物歧化酶(SOD)和反应性自由基(ROS)的水平检测细胞的氧化应激反应。结果 ① 原子力显微镜的结果显示GO的厚度为1~2层,直径在200~500 nm之间,其他衍生物的直径和厚度也在这个范围之内,GO的zeta电位是-65.1 mV,GO的LA衍生物的电位是18.4 mV,PEG衍生物是-8.86 mV,而PEI衍生物的电位是60.5 mV左右;② GO对HLF细胞活力的影响具有浓度依赖性,GO 50 mg·L^-1可以显著地降低细胞活力;③ 经过24 h的200 mg·L^-1 GO的处理,HLF细胞处于sub-G₁期的细胞明显增多,具有显著性的差异;④ 彗星实验证明在非常小的剂量 (1 mg·L^-1),GO就会引起明显的DNA损伤;⑤ GO处理过的HLF细胞,其SOD水平降低,ROS水平升高,应用N-乙酰半胱氨酸可以逆转GO引起的氧化应激反应;6 PEG和LA修饰的GO对HLF细胞的细胞毒性和遗传毒性,相对GO来说,有所降低,但是PEI修饰可以加重GO的毒性作用。结论 GO对HLF细胞具有显著的细胞和遗传毒性。
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  T13.11 二硫化碳对共培养大鼠睾丸支持-生精细胞凋亡线粒体途径相关基因表达的影响

  张振;王为;董煜;黄晓彧;郭寅生;周义军;陈国元

  2013, 27(S1): 248-249.

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  目的 研究二硫化碳(CS₂)染毒对共培养大鼠睾丸支持-生精细胞凋亡线粒体途径相关基因表达的影响,探讨CS₂染毒致雄性大鼠生殖损伤的分子生物学机制。方法 选用22~24 d龄清洁级雄性SD大鼠,建立睾丸生精-支持细胞体外共培养体系,细胞分对照组和CS₂ 1, 2和4 mmol·L^-1组,提取RNA,应用荧光实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测Cyto C,Apaf-1,胱天蛋白酶3,胱天蛋白酶9,Aif,EndoG,Smac,IAPS,Bax,Bcl-2 mRNA表达水平。结果 各染毒组大鼠睾丸支持-生精共培养细胞中Cyto C,Smac,IAPS和Bax mRNA的表达水平均有明显的升高(P<0.05),同时Apaf-1 mRNA的表达水平有明显的下降(P<0.05);中,高浓度的CS₂染毒可以导致大鼠睾丸支持-生精共培养细胞中Aif和EndoG mRNA表达水平的下降(P<0.05),同时Bax与Bcl-2 mRNA表达水平之比明显升高(P<0.05); 高浓度的CS₂染毒可以导致大鼠睾丸支持-生精共培养细胞中胱天蛋白酶3 mRNA表达水平的上升(P<0.05),同时使Bcl-2 mRNA表达水平下降(P<0.05)。结论 CS₂染毒可影响细胞凋亡线粒体途径相关基因的表达,并且这一机制与CS₂染毒对支持-生精细胞共培养体系造成的损伤相关联。
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  T9.14 不同尺寸碲化镉量子点对AML-12细胞活性氧的影响

  胡媛媛;张婷;詹庆龄;薛玉英;唐萌

  2013, 27(S1): 220-221.

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  目的 探讨量子点的细胞损伤机制。方法 荧光倒置显微镜下观察2种量子点对AML-12细胞形态改变;用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法检测对AML-12细胞增殖活性影响;用DCFH-DA法检测细胞内活性氧(ROS)产生,用AnnexinⅤ-FITC法检测量子点对细胞凋亡的影响。结果 荧光倒置显微镜下观察,正常AML-12细胞形态均一,贴壁生长。碲化镉量子点(CdTe)量子点处理组,贴壁细胞数量明显减少,细胞皱缩变小,大小不一,贴壁不牢,悬浮细胞增多。单独使用两种不同尺寸CdTe量子点染毒24 h后,AML-12细胞均有明显的生长抑制作用。随着染毒剂量增加,量子点对细胞活力抑制作用增强;细胞内ROS水平增加。对2种尺寸CdTe QD引起细胞内ROS水平比较,2.2 nm组较3.5 nm组ROS水平更高,且两种粒径各剂量组细胞内ROS含量与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。经PDTC预处理后的细胞,细胞内ROS水平显著下降,与同剂量未用PDTC处理的实验组结果比较,有统计学意义(P<0.05)。2种尺寸CdTe QD引起细胞凋亡结果显示,随着染毒剂量升高,细胞凋亡发生率明显增加,各剂量组细胞早期凋亡率与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。经PDTC预处理后的细胞,细胞早期凋亡率显著下降,与同剂量未用PDTC处理的实验组结果比较,有统计学意义(P<0.05)。结论 CdTe可以抑制AML-12细胞活力,诱导细胞内ROS产生,产生氧化应激,促进细胞凋亡发生,其粒径大小是引起细胞毒性的关键因素。经过PDTC预处理的细胞,细胞内ROS发生率降低,早期细胞凋亡率减少。PDTC能够降低量子点引起的细胞损伤效应,提示量子点可能通过NF-κB信号通路导致细胞损伤。
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  T9.20 亚慢性纳米氧化铝暴露对ICR小鼠学习记忆能力及氧化应激水平的影响

  郭卫伟;杨俊林;张雨宇;张勤丽

  2013, 27(S1): 223-224.

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  目的 初步探讨纳米氧化铝颗粒对ICR小鼠学习记忆能力及氧化应激水平的潜在神经毒性。方法 取ICR小鼠40只,按体重随机分为生理盐水对照组,纳米氧化铝25, 50和75 mg·kg^-1·d^-1组,采用滴鼻染毒方式,每次10 μl,每日3次,连续染毒一个月。染毒结束后,Morris水迷宫观察学习记忆能力的变化;处死后,检测大脑海马氧化应激因子。结果 各组小鼠的运动能力无显著差异。随着训练天数的增加,四组小鼠的逃避潜伏期明显缩短,差异具有统计学意义(P<0.05);而同一天,与对照组相比,各剂量组小鼠逃避潜伏期变化差异无统计学意义。与对照组相比,高剂量组小鼠目标象限停留时间和穿越平台次数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。SOD活性与MDA含量呈现剂量效应关系。与对照组相比,纳米高剂量组SOD活性显著降低(P<0.05),MDA含量显著增加(P<0.05)。结论 纳米氧化铝引起脑的氧化应激损伤,可能是小鼠学习记忆能力下降的因素之一。
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  T9.22 纳米TiO₂诱导滑膜细胞RSC-364的凋亡作用

  马家伟;王江雪;李辉;樊瑜波

  2013, 27(S1): 224-225.

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  目的 研究不同晶型纳米TiO₂诱导滑膜细胞RSC-364凋亡。方法 本文使用的材料为锐钛矿和金红石纳米TiO₂颗粒,材料悬液浓度为30和300 mg·L^-1,分为5组进行实验(含对照组)。实验采用Calcein-AM/PI荧光染色法和AnnexinⅤ-FITC/PI荧光染色法定性分析了锐钛矿和金红石纳米TiO₂诱导滑膜细胞凋亡的情况;借助流式细胞技术,定量分析了纳米材料诱导细胞凋亡的程度;并且,利用透射电镜观察了纳米TiO₂诱导细胞凋亡的形态学变化。结果 Calcein-AM/PI荧光染色实验显示,纳米材料刺激后,细胞活性下降,死细胞数量增多,另外显微镜下可观察到细胞结构破坏、细胞内容物外泄现象。AnnexinⅤ-FITC/PI荧光染色实验观察到了各实验组纳米TiO₂颗粒均诱导了滑膜细胞凋亡,并且高浓度的纳米TiO₂能够诱导更多的细胞凋亡和坏死。流式细胞术定量分析发现,300 mg·L^-1锐钛矿和金红石纳米TiO₂诱导的细胞晚期凋亡及坏死,其比率分别达到了(12.21±1.44)%和(7.89±1.78)%,显著高于30 mg·L^-1纳米颗粒组的(5.39±0.92)%和(3.46±0.52)%。在透射电镜下,能够看到纳米颗粒在细胞内呈集中分布,并且刺激后的细胞可观察到明显的凋亡形态学特征,如细胞皱缩、染色质边集、形成凋亡小体等。结论 钛矿和金红石纳米颗粒均存在细胞毒性,锐钛矿型纳米颗粒的细胞毒性要高于金红石型纳米颗粒,这可能与锐钛矿纳米颗粒能够产生更多的ROS有关。
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  T9.31 不同表面修饰的多壁碳纳米管对RAW264.7细胞的毒性及影响因素探讨

  张婷;唐萌;浦跃朴

  2013, 27(S1): 229-229.

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  研究表明,碳纳米管呼吸进入人体可引起严重的肺部疾病,包括肉芽肿肺部炎症等,还有发现碳纳米管能引起明显的免疫毒性作用,但是这些毒性作用影响因素和分子机制仍然缺乏相关的研究。本论文选择在本实验室条件可控的情况下合成的功能化MWCNT(f-MWCNT)与未修饰的MWCNT(p-MWCNT),以RAW264.7细胞为体外免疫毒性研究模型,研究了三种不同类型的MWCNT对细胞活力,细胞膜完整性、细胞摄取、细胞内活性氧(ROS)生成、细胞凋亡发生和炎症反应发生的影响及剂量-效应关系,在此基础上进一步研究MWCNT引起细胞免疫相关毒性效应的分子机制。并结合MWCNT自身性质特点,分析了不同类型纳米材料引起生物效应和毒性效应的差异产生的原因。研究结果显示不同表面修饰的MWCNT对巨噬细胞的毒性作用随着暴露时间和暴露浓度的增加而增加,细胞的增殖在100 mg·L^-1浓度下就受到明显抑制(P<0.05);p-MWCNT引起明显的细胞增殖抑制和细胞膜损伤,MWCNTs-COOH引起细胞内活性氧(ROS)含量的明显升高,炎性细胞因子(IL-1, IL-6和TNF-α) 释放增加,三种MWCNT均未引起明显的细胞凋亡发生;修饰前表面性质不相同的MWCNT在金属杂质含量无差别情况下,ROS的产生与炎症反应的发生强度与细胞摄取材料的数量呈正相关。证明了MWCNT通过对线粒体结构的破坏,引起线粒体功能障碍,诱发细胞内ROS生成增加,并引起下游炎症因子生成,引发一系列炎症反应的作用机制。基于该机制提示表面功能化修饰改变MWCNT的水溶性的同时,修饰基团表面性质引发的细胞摄取能力增加可能引起不易被观察到的毒性反应,进而引发潜在的负效应。
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  T7.28 脑红蛋白与谷胱甘肽cross-talk在1-溴丙烷致CNS损伤中的作用

  郭盈;袁华;曾涛;寇蕊蕊;张翠丽;王硕;赵秀兰

  2013, 27(S1): 197-198.

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  目的 观察具有神经系统保护作用的携氧球蛋白脑红蛋白(Ngb)在1-溴丙烷(1-BP)染毒大鼠大脑中表达的变化趋势,及其与还原型谷胱甘肽(GSH)水平和动物中枢神经系统(CNS)损伤的相关关系。方法 SPF级雄性Wistar大鼠50只,体质量180~220 g,随机分为5组(n=10):正常对照组和1-BP染毒组(100, 200, 400和800 mg·kg^-1),连续经口染毒12 d。1-BP染毒第8~12天,采用Morris水迷宫定位航行试验和空间探索试验测定大鼠学习和记忆能力。水迷宫实验结束后次日断头处死大鼠,取大脑皮层,分别测定匀浆中GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量,谷胱甘肽还原酶(GR)和γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)活性,并采用Western blotting检测Ngb含量,及4-HNE(4-hydroxynonenal)和MDA蛋白质加合物水平的变化。结果 水迷宫结果显示,与对照组相比,1-BP 400和800 mg·kg^-1染毒组的逃避潜伏期、游泳总路程显著延长,穿越平台次数显著降低。生化结果显示,各染毒组GSH含量明显低于对照组,呈剂量依赖性降低;200, 400和800 mg·kg^-1组GCL活力明显低于对照组; GR活力呈"单峰"状,200 mg·kg^-1组GR活力明显升高,800 mg·kg^-1组GR活力低于对照组。Western blotting结果显示,各染毒组MDA蛋白质加合物相对含量与4-HNE蛋白质加合物相对含量明显高于对照组。实验观察到1-BP染毒能导致大鼠大脑皮层Ngb呈剂量依赖性减少,各染毒组均明显低于对照组;Ngb相对含量的降低与GSH含量的变化趋势一致,两者呈正相关(r=0.557,P<0.01);Ngb相对含量也与大鼠学习能力和记忆能力相关,其中与学习能力的相关程度随学习时间的延长而增加,1~4 d与游泳总路程的相关系数依次为0.481, 0.425, 0.703和0.747(P<0.01);与大鼠记忆能力亦呈显著正相关(r=0.48,P<0.01)。结论 1-BP能够导致动物大脑Ngb呈剂量依赖性降低,Ngb的变化趋势与GSH的降低趋势一致,呈显著正相关,提示GSH和Ngb之间存在某种cross-talk,共同参与了1-BP致CNS损伤过程。
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  T7.29 三邻甲苯磷酸酯诱导的迟发性神经病中自噬功能的变化

  宋福永;谢克勤

  2013, 27(S1): 198-198.

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  目的 研究三邻甲苯磷酸酯(TOCP)诱导的迟发性神经病 (OPIDN)母鸡神经组织中自噬功能的动态变化,探索OPIDN发生的分子机制。方法 以TOCP为OPIDN诱导剂染毒母鸡建立OPIDN动物模型,分别在TOCP染毒后1, 5, 10和21 d时间点处死动物,取脊髓和胫神经,利用透射电镜观察脊髓超微病理变化,SDS-PAGE和Western blotting检测脊髓和胫神经中自噬标志分子LC-3, p62/SQSTM1和自噬调控蛋白ATG 1, AMBRA 1, ATG 5, ATG 7, ATG 12, beclin-1和VPS34等相对含量的变化。结果 经口一次染毒750 mg·kg^-1 TOCP可诱导母鸡出现典型的OPIDN症状,透射电镜观察可见TOCP染毒第10和21天时动物脊髓组织内神经元轴突发生变性,有髓轴突和无髓轴突中出现自噬泡大量堆积现象。Western blotting结果显示TOCP染毒引起母鸡脊髓和胫神经组织中自噬标志分子LC-3表达显著下降,自噬降解底物-p62/SQSTM1含量进行性增加。与对照相比,母鸡脊髓LC-3含量在TOCP染毒后第5和10 天分别降低28.6%和23.2%,胫神经LC-3含量在染毒后第1, 5, 10和21天分别降低38.2%, 49.1%, 34.3%和15.5% (P<0.05),且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著下降;母鸡脊髓中p62/SQSTM1在染毒后第1, 5, 10和21天分别增加46.2%, 107.9%, 108.5%和133.5%,胫神经中 p62/SQSTM1在染毒后第10和21天分别增加93.1% 和260.8%(P<0.05)。同时,TOCP染毒显著影响了神经组织中自噬通路中关键自噬调控蛋白的表达。与对照相比,TOCP染毒母鸡脊髓和胫神经中ATG 1, AMBRA 1, ATG 5, ATG 12和beclin-1表达均显著下降,此外,母鸡胫神经中ATG 7和VPS34表达也显著降低。结论 TOCP染毒干扰了母鸡神经细胞中自噬的基础活性,这可能与OPIDN发生机制有关。
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  T7.25 氯胺酮自身给药对大鼠心脏和肾的影响

  黄坤玉;郑文慧;黄娴妮;杨澍均;吕秀依;刘昱

  2013, 27(S1): 195-196.

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  目的 探究氯胺酮自身给药对大鼠心脏和肾的损害作用。方法 给予成年SD大鼠颈静脉插管手术及术后护理;对手术恢复良好的大鼠进行氯胺酮静脉自身给药行为的训练以及自身给药行为的维持,维持期14 d;维持期结束后对大鼠进行心脏灌注处理,取心脏和肾脏组织,进行固定、包埋、切片、HE染色、免疫组化检测,分析心肌Fas、FasL和肾脏损伤分子(KIM-1)阳性蛋白的表达情况;观察心脏和肾脏病理切片,统计、分析处理实验数据。结果 95%以上大鼠能够成功获得氯胺酮的自身给药行为且在维持期内自身给药行为仍然稳定;HE染色镜检发现给药组较对照组心肌细胞排列不规则、出现纤维化,并伴有水肿、严重的变性等,给药组肾脏病理切片出现肾小球炎症、肾小管萎缩、单核细胞浸润;免疫组化检测发现心肌Fas和FasL阳性蛋白表达给药组较对照组明显增加,差异显著,肾脏损伤分子(KIM-1)的表达给药组较对照组也是明显增加,且差异显著。结论 大鼠能够获得稳定的氯胺酮自身给药行为,氯胺酮自身给药引起大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的增加和肾脏组织的病变,说明滥用氯胺酮对大鼠的心脏和肾有损伤。
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  T9.30 食品相关纳米材料对Caco-2细胞增殖的影响

  陈汉清;汪冰;柴之芳;赵宇亮;丰伟悦

  2013, 27(S1): 228-229.

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  目的 纳米材料具有独特的物理、化学和生物学性质,在工业、农业、环境及生物医学领域具有广泛的应用前景。特别是纳米颗粒具有粒径小、易吸收的特性,在农业生产、食品包装、食品加工、食品保质以及食品添加剂等方面得到了广泛的应用。胃肠道系统除了消化吸收功能外,还是人体重要的防御屏障,因此,高通量的评价食品相关纳米颗粒的胃肠道安全性是保障纳米材料安全应用的重要内容。方法 分化的Caco-2细胞具有类似成熟体内小肠细胞的形态和生化特征,广泛用于体外模拟体内肠道上皮细胞转运与吸收外源性物质的研究。本研究通过罗氏xCELLingence RTCA DP系统高通量、实时、非标记方法,评价了10种主要的食品纳米材料,包括:氧化石墨烯(GO)、单壁碳纳米管(SWCNT)、多壁碳纳米管(MWCNT)、银纳米颗粒(nano-Ag)、二氧化钛纳米颗粒(nano-TiO₂)、氧化硅纳米颗粒(nano-SiO₂)、氧化铁纳米颗粒(nano-Fe₃O₄)、氧化锌纳米颗粒(nano-ZnO)、二氧化铈纳米颗粒(nano-CeO₂)及金纳米颗粒(nano-Au),在1,10和100 g·ml^-1浓度暴露下对分化和未分化的Caco-2细胞增殖的影响。结果 研究发现GO和nano-Fe₃O₄可以显著地促进分化与未分化的Caco-2细胞增殖(P<0.05),且具有浓度效应。nano-Au可以轻微地促进Caco-2细胞的增殖。SWCNT, MWCNT和nano-SiO₂显著地抑制未分化的Caco-2细胞的增殖(P<0.05),但SWCNT在1 g·ml^-1浓度下可以促进单层的Caco-2细胞的分化。在1和10 g·ml^-作用浓度下,nano-Ag和nano-ZnO显著地抑制Caco-2细胞的增殖(P<0.05),当浓度提高到100 g·ml^-1,细胞增殖曲线急剧下降。nano-TiO₂能够刺激未分化Caco-2细胞增殖,但对于分化的Caco-2细胞的作用不明显。nano-CeO₂在1 g·ml^-1浓度下能够刺激分化与未分化Caco-2细胞增殖(P<0.05),但是一旦浓度提高到10 g·ml^-以上,nano-CeO₂能够显著地抑制Caco-2细胞的增殖(P<0.05)。结论 纳米材料的肠道细胞毒性与纳米材料本身的物理化学性质有关,同时也与纳米材料的暴露剂量有关。GO, nano-Fe₃O₄和nano-Au对于肠道细胞具有较好的生物相容性,有可能作为潜在的食品相关纳米材料及纳米药物载体。
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  T9.32 四氧化三铁纳米材料暴露对果蝇卵子发生和胚胎发育时序的影响

  汪冰;陈汉青;周晓艳;郑令娜;秘晓林;丰伟悦

  2013, 27(S1): 229-230.

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  研究表明,纳米材料如量子点和富勒烯能够通过小鼠胎盘屏障转移到胎仔,并引起胎仔发育异常。然而,迄今为止,纳米材料暴露对卵子发生过程和胚胎发育时序的影响还不清楚。果蝇的卵子发生过程和胚胎发育过程易于进行广泛的遗传筛选和克隆分析,是研究发育生物学中一些基本问题的良好模型。本文研究了三种氧化铁纳米材料(10 nm):未修饰的四氧化三铁(UN-Fe₃O₄),柠檬酸修饰的四氧化三铁(CA-Fe₃O₄),和氨基硅烷修饰的四氧化三铁(APTS-Fe₃O₄)暴露对子代果蝇发育时序的影响: 包括卵子发生、成卵、化蛹,及成虫羽化。研究结果表明,亲代雌雄果蝇饮食摄取三种氧化铁纳米材料(300和600 μg·g^-1)均导致雌果蝇的产卵率显著降低。而且,与表面负电的CA-Fe3O4和Fe₃O₄相比,表面正电的APTS-Fe₃O₄对果蝇的产卵率影响更为明显。对卵子发生过程的研究表明,纳米材料暴露能够诱导果蝇的卵室发育停滞在第8阶段。对幼虫化蛹及成虫羽化研究表明,与对照组相比,APTS-Fe₃O₄暴露导致幼虫的化蛹率和羽化率显著降低,表明胚胎发育停滞在化蛹和羽化阶段。此外,氧化铁纳米材料暴露还导致雌果蝇卵巢发育异常(如出现空的卵巢管和卵巢体积减小)及卵室体积变小。通过同步辐射微束X射线荧光技术,发现氧化铁纳米材料暴露导致果蝇胚胎内微量元素Ca, Cu和Fe沿前-后轴线的分布发生了改变。
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  T7.31 二十二碳六烯酸对1-溴丙烷致大鼠中枢神经系统损伤的保护作用

  袁华;郭盈;赵秀兰

  2013, 27(S1): 199-199.

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  目的 观察二十二碳六烯酸(DHA)对1-溴丙烷(1-BP)致中枢神经系统(CNS)损伤的保护作用。方法 体质量200~220 g的SPF级雄性Wistar大鼠40只,随机分为4组:正常对照组、1-BP染毒组、低剂量DHA干预组和高剂量DHA干预组,每组10只。低、高剂量DHA干预组预先分别经口补充250和500 mg·kg^-1的DHA,正常对照组和1-BP染毒组给予等体积玉米油,给予DHA第11天,1-BP染毒组和低、高剂量DHA干预组灌胃染毒800 mg·kg^-1的1-BP,正常对照组给予等体积玉米油,持续12 d,染毒容积均为2 ml·kg^-1。动物染毒1周后,采用Morris水迷宫测定各组大鼠的学习记忆能力,连续5 d。水迷宫检测结束后次日断头处死大鼠,迅速剥离大脑皮层,冰浴中制备组织匀浆。分光度法检测大脑匀浆中还原型谷胱甘肽(GSH)及氧化型谷胱甘肽(GSSH)的含量、谷胱甘肽还原酶(GR)活性。采用Western blotting方法检测大脑皮层脑红蛋白(Ngb)表达。结果 Morris水迷宫试验显示,1-BP染毒组大鼠游泳总路程和逃避潜伏期比对照组明显延长(P<0.05);与1-BP染毒组动物相比,补充DHA能明显降低大鼠的游泳路程和逃避潜伏期(P<0.05)。与对照相比,1-BP染毒组平台周边时间/总时间比值明显减少,补充DHA组平台周边时间/总时间比值明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。1-BP染毒组动物大脑皮层GSH/GSSH比值与对照组相比,降低了35.1%(P<0.05),补充DHA 250和500 mg·kg^-1均能够明显逆转1-BP导致的GSH/GSSH比值的降低(P<0.05);1-BP染毒组大鼠大脑皮层GR活性比对照组大鼠GR活性明显降低(P<0.05),与1-BP染毒组相比,补充DHA均能使大脑皮层GR活性显著升高(P<0.05),DHA能够增强大脑GR活性。Western blotting实验结果显示1-BP染毒组动物与对照相比,Ngb表达明显减少(P<0.05),与1-BP染毒组相比,补充DHA 250和500 mg·kg^-1均能够明显增加Ngb的表达。结论 DHA能够在一定程度上减轻1-BP暴露导致的大鼠学习能力的损伤,DHA激活GR活性,增加大脑GSH含量;增强Ngb表达,可能是其保护机制之一。
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  T7.33 多巴胺转运蛋白对可卡因成瘾的影响

  刘诣

  2013, 27(S1): 200-200.

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  目的 通过计算机分子模拟、基因点突变和细胞亲和力等实验方法,研究多巴胺转运蛋白(DAT)与可卡因成瘾性相关的活性氨基酸位点,从而为临床研究治疗可卡因等药物依赖成瘾提供实验依据。方法 运用计算机分子模拟,对DAT与可卡因结合的活性位点进行预测。应用基因点突变方法,以野生型小鼠DAT为模版,将计算机分子模型预测的85位和475位上氨基酸进行点突变。将突变后的DAT蛋白和野生型DAT蛋白转染于COS-7细胞,使其表达增加。通过同位素标记的细胞亲和力大小评价突变蛋白与可卡因之间的结合与野生型蛋白是否存在差异,并以此判断该氨基酸是否为可卡因结合的活性位点。另通过同位素标记的多巴胺重摄取实验来评价突变后DAT蛋白的功能。结果 同位素标记的细胞亲和力实验表明,85位上氨基酸突变后,其与可卡因的结合较野生型DAT下降了约75%;475位上氨基酸突变后,其与可卡因的结合较野生型DAT下降了约90%。而将这两个位点上氨基酸做互换突变以后,其与可卡因的结合较野生型上升了约80%。多巴胺重摄取实验表明突变后的DAT蛋白基本丧失了多巴胺转运的能力。结论 DAT上85位和475位氨基酸很可能为可卡因结合的活性位点。
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  T20.63 表遗传调控miR-200c阻滞上皮间质转化在砷抑制三阴乳腺癌细胞转移侵袭中的作用

  司璐;蒋菲;穆娟;叶献青;王星星;宁士龙;李忠

  2013, 27(S1): 391-392.

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  目的 探讨As能否通过脱甲基作用激活miR200s,阻滞上皮间质转化(EMT),进而抑制三阴乳腺癌细胞的转移侵袭未见报道。方法 检测细胞转移侵袭能力:细胞划痕和Transwell实验;检测细胞EMT指标:细胞形态观察、RT-PCR及Western blot检测E钙黏蛋白、N钙黏蛋白和vimentin的表达水平;检测miR-200s表达:qRT-PCR;敲除/高表达miR-200c:anti-miR-200c或miR-200c-mimics转染;检测基因组甲基化水平:免疫荧光检测5-甲基嘧啶(5mC)表达;检测miR-200c启动子区甲基化水平:甲基化特异性PCR(MSP);体内观察As处理对肿瘤组织miR-200s和EMT指标的影响:裸鼠皮下致瘤实验、qRT-PCR、Western blot和免疫组化。结果 As处理三阴乳腺癌MDA-MB-231和BT-549细胞可抑制其划痕修复及转移侵袭能力;As处理MDA-MB-231细胞可上调E钙黏蛋白的mRNA和蛋白表达水平,而下调N钙黏蛋白和vimentin水平,诱导细胞形态发生上皮样改变;As处理MDA-MB-231细胞可上调miR-200a, miR-200c, miR-141表达水平,As处理BT-549细胞也可上调miR-200c表达水平;As处理的MDA-MB-231细胞中基因组整体甲基化水平下降,且As可通过下调miR-200c启动子区甲基化水平进而上调MDA-MB-231和Hs-578T细胞中miR-200c表达;在MDA-MB-231细胞中高表达miR-200c可上调E钙黏蛋白的mRNA和蛋白表达水平;转染anti-miR-200c可阻滞As处理所致MDA-MB-231细胞E钙黏蛋白表达升高以及细胞形态发生的间质-上皮样改变;转染anti-miR-200c可阻滞As处理所致MDA-MB-231和BT-549细胞转移侵袭能力下降;将MDA-MB-231细胞接种至裸鼠皮下成瘤后再用As处理,结果发现与对照组肿瘤组织相比,As处理可抑制肿瘤的生长,上调肿瘤组织miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141和E钙黏蛋白的mRNA及蛋白表达水平,下调N钙黏蛋白和vimentin的表达水平。结论 As通过脱甲基作用上调miR-200c的表达进而阻滞EMT在其抑制三阴乳腺癌细胞转移侵袭过程中发挥重要作用。
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  T20.65 ERK1/2与雌激素受体α交互作用在中草药提取物刺激乳腺癌细胞增殖中的作用

  叶献青;蒋菲;穆娟;司璐;王星星;宁士龙;胡春艳;李忠

  2013, 27(S1): 392-393.

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  目的 探讨植物类雌激素是否具有通过质膜上ERs与胞内细胞信号相互作用发挥非经典的雌激素效应。方法 采用MTS实验检测中草药提取物对雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞株活性的影响;采用RT-PCR检测提取物对雌激素受体α(ERα)靶基因的影响;通过Western blot 检测提取物对ERα、 胞外信号调节激酶(ERK1/2)蛋白表达的影响和ERα及ERK1/2蛋白分别在浆核中的表达情况;应用免疫荧光检测ERα及ERK1/2分别在胞浆/核的定位;采用免疫共沉淀实验检测ERα和ERK1/2蛋白是否相互结合。结果 对八种植物提取物(当归、布渣叶、甘草、金银花、菊花、仙草、鸡蛋花、夏枯草)进行检测,在雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞中,MTS实验结果显示:与对照组相比布渣叶、当归提取物在一定浓度下能够诱导MCF-7细胞增殖,且这种作用能够被ERα的拮抗剂ICI和ERK1/2抑制剂U0126所抑制,这些结果表明ERα和ERK1/2 信号通路参与了布渣叶和当归提取物介导的细胞增殖能力增加;Western bolt显示当归和布渣叶在MCF-7细胞中能够下调ERα蛋白的水平,且能够介导ER的靶基因pS2 mRNA表达的增加,加入ICI或者U0126之后,上述提取物介导的pS2 mRNA升高水平显著下降,结果提示ERα和ERK1/2信号通路在布渣叶和当归提取物诱导雌激素样效应过程中发挥重要作用;进一步研究发现ICI对布渣叶和当归提取物介导的ERK1/2激活没有影响,且当归和布渣叶能够促进ERα的核转位,诱导磷酸化的ERK1/2和ERα蛋白的结合,说明ERK1/2信号通路在布渣叶和当归提取物激活ERα过程中发挥重要作用。结论 当归和布渣叶具有雌激素效应,该作用是通过ERα介导的,且ERK1/2的激活是当归和不布渣叶介导的雌激素效应所必须的。
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  Applying Adverse Outcome Pathways to the protection of human health

  Maurice WHELAN

  2013, 27(S1): 407-409.

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  Regulatory toxicology is undergoing an exciting transformation. Whereas in the past the emphasis has primarily been on observation of toxicological effects of substances using animal models, nowadays the aim is to combine a variety of different models to determine the mechanistic basis of those effects. Moreover, this push towards more systematic use of mechanistic knowledge and reasoningin regulatory toxicological opens the door for predicting potential toxicological effects of a substance rather than having to measure them directly.So how do we go about establishing a knowledge-based framework for safety assessment decision making in relation to human health, and what practical steps can we take to harvest the knowledge we need and make it available in a form that can be exploited for regulatory purposes? Although there is already a phenomenal amount of mechanistic toxicological information available in the literature, researchers continue to dig deeper and deeper. But with a gain in knowledge resolution, the trade-off is usually a loss in coverage, and eventually a loss of coherence. Thus an uncomfortable paradox is emerging where the more toxicological knowledge we generate as a scientific community, the more difficult it is to exploit for regulatory purposes. But if we assume that in fact most of the knowledge on mechanisms and modes of toxicological action that we need to make informed safety assessment decisions actually exists, then efforts should be directed towards the collection, curation and dissemination of relevant knowledge to ensure that it is fully exploited in regulatory toxicology processes. In doing so it is likely that on occasion knowledge gaps will be identified which should trigger knowledge-discovery related research activities. However such considerations are of secondary concern in the short-term. Important now is the establishment of methodology and tools for the gathering and management of knowledge on mechanistic toxicology on an international scale, similar in a way to global initiatives undertaken in the last decade in relation to warehousing and sharing of data on substanceproperties and test results. Rising to the challenge of how to work with mechanistic knowledge, to embrace the opportunity of establishing a knowledge-based framework for regulatory toxicology, the Organisation for Economic Cooperation and Development (OECD) launched in January 2013 the Adverse Outcome Pathway (AOP) Development programme, managed within the OECD Extended Advisory Group on Molecular Screening and Toxicogenomics (EAG-MSTG). An AOP is reductionist at the (toxicological) process level, describing a sequential chain of causally linked‘key events’occurring at different levels of biological organisation that lead to an adverse health or ecotoxicological effect. Thus an AOP is a unique instrument to capture and organise mechanistic knowledge in an explicit and structured manner, rendering it more amenable to evaluation, elaboration, communication, and exploitation. AOPs can vary in resolution and expanse and can include both qualitative and quantitative descriptions of key events and the causal relationships that link them. Initial development and elucidation of an AOP can start at the apical Adverse Outcome (ie the regulatory health effect of concern) and work upstream towards the initial cause, or at the Molecular Initiating Event, or at any key event in between. Ultimately however the aim is to postulate the continuous chain of key events that comprise the full AOP and importantly, to provide the evidence that substantiates the AOP to ensure that it can stand up to scrutiny before gaining acceptance. AOPs canserve multiple uses and provide the blueprint for a computational prediction model, design of an integrated assessment and testing strategy, or the basis for structuring information for a weight-of-evidence analysis. The AOP Development programme at OECD is well underway and has a dynamic work plan comprising different categories of projects including AOP development projects, AOP case studies, AOP guidance, and AOP knowledge management tools. In April 2013 the OECD published its "Guidance document and a template for developing and assessing adverse outcome pathways" which AOP developers should follow to ensure consistency in their approach and compliance with AOP standards related to content, structure and presentation. A wiki-based AOP Knowledge Base (AOP-KB) has also been developed recently which is currently undergoing a beta-testing phase before being publically released in early 2014. This AOP-KB provides a web-accessible collaboration-space for AOP development teams to work together in an efficient and convenient manner. It will also serve to crowd-source knowledge on a global scale to refine existing AOPs and trigger the development of new ones where gaps in the AOP landscape are identified. Of course the AOP-KB will also be the primary hub for the regulatory science community to rapidly and efficiently access AOP knowledge to serve their needs.
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  T1.19 ERK/MAPK信号通路在急性百草枯中毒大鼠肺损伤中的作用

  菅向东;刘晓冰;王洁茹;于光彩;孙婧

  2013, 27(S1): 20-21.

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  目的 研究ERK/MAPK信号通路在急性百草枯中毒大鼠肺损伤中作用,观察TGF-β₁抗体对百草枯急性肺损伤的治疗效果。方法 雄性Wistar大鼠50 mg·kg^-1的剂量一次性灌胃给予百草枯0.5 h后皮下注射肝给予TGF-β₁抗体(浓度1 mg·ml^-1),然后每周皮下注射给予TGF-β₁抗体0.1 mg·kg^-11次。分别于染毒后第7, 14, 21, 28天经麻醉后处死,对照组在实验结束后处死。并同时留取右侧肺叶的肺泡灌洗液和左侧肺组织进行病理学和免疫组织化学等检测。免疫组化染色检测ERK1/2, P-ERK 蛋白,免疫印迹蛋白定量分析ERK, P-ERK,TGF-β₁、羟脯氨酸的测定按照试剂盒说明书要求进行。结果 治疗组较染毒组TGF-β₁, ERK, P-ERK和羟脯氨酸降低,染毒组较对照组的TGF-β₁, ERK, P-ERK和羟脯氨酸升高,差异均有统计学意义。光学显微镜观察,肺组织在早期随着实验天数的增加炎性细胞浸润程度也逐渐加重,而后期炎性细胞浸润逐渐减轻代之以肺泡间隔纤维化的逐渐形成。同期的治疗组与染毒组大鼠的肺组织比较,炎症及纤维化程度减轻。染毒组大鼠在实验开始出现活动减少和精神萎靡,部分大鼠出现口鼻出血以及呼吸困难等缺氧表现,治疗组大鼠较同期染毒组反应明显减轻,用药5~7 d后活动较同期染毒组逐渐增多,呼吸平稳,缺氧症状明显减轻。结论 百草枯急性肺损伤中TGF-β₁/Smads与ERK/MAPK信号通路存在交互作用;TGF-β₁抗体具有治疗百草枯中毒肺损害的作用。
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  Developing in vitro test methodologies sufficient for chemical safety assessments in the 21st century

  Melvin E ANDERSEN

  2013, 27(S1): 3-3.

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  The past 50 years witnessed steadily increasing pressures to reduce animal testing in assessing the safety of chemicals and drugs. Initially, the major concerns were ethical due to the large numbers of animals used in these tests. The European Union (EU) has maintained this strong emphasis on ethics, enacting reduction/elimination of animals for much toxicity testing into law. In North America, there was a realization that a regulatory system layering in-life study on in-life study was costly, expensive and slow: there were too many chemicals requiring testing and too few resources to get the testing done. The US Environmental Protection Agency (EPA) proactively developed plans for increased use of computational and molecular/cellular technologies in their computational toxicology framework paper in 2004. A US National Academy of Sciences (NAS) committee in 2007 then recommended a new testing strategy that would require only in vitro test methods. The past 5 to 6 years has seen the completion of early phases of high throughput (HT) screening, appearance of new methods for comparing in vitro bioactivity results with anticipated human exposures, and a flurry of activity-research, scientific meetings, and product commercialization-to hasten change from in life testing. This talk emphasizes a group of initiatives to make in vitro test results sufficient for safety assessment and notes some of the looming challenges. The US EPA's ToxCast^TM efforts on HT-screening, HT-exposure assessment with evolving tools for HT-provisional risk assessment has provided data sets to ignite a broad debate on the future of these technologies. Evolving genomic approaches support both dose response and identification of modes of action of chemicals. These tools may permit a transitional tiered-approach, triaging out many chemicals before moving to in life studies. At Hamner, we are pursuing case studies of compounds with known modes of action in order to develop the full suite of tools necessary for safety assessments. These tools include designed-for-purpose in vitro tests, in vitro-in vivo extrapolation, and computational systems biology pathway models for dose response. Our first efforts have focused on the mdm2-p53 DNA damage stress pathway and peroxisomal proliferating receptor-alpha nuclear receptor signaling. A major challenge with in vitro tests is assessing toxicity of metabolites. New approaches for rapid metabolite identification after incubations with cells and using bioreactors to produce a mix of parent compound and metabolite over extended times are in late stage development. The talk outlines progress with these various activities and concludes with comments on an on-going challenge-the global coordination necessary to enhance education in these new methods and to train the next generation work force in their application.
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  T2.30 单细胞凝胶电泳实验和Ames实验对饮用水遗传毒性的检测

  张崇华;王春莲;句立言

  2013, 27(S1): 42-42.

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  目的 比较单细胞凝胶电泳实验 (彗星实验,SCGE) 和Ames实验在水质遗传毒性检测中的灵敏性与优缺点,建立水质遗传毒性检测体系。方法 正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、二甲基亚砜、肌氨酸钠、乙二胺四乙酸二钠、Tris、TritionX-100,鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA98与TA100。采用Ames实验和小鼠原代肝细胞凝胶电泳实验分别对H市的S和M两处水源水的有机浓集物的遗传毒性进行检测,对结果进行分析。结果 M水源两种方法检测结果与阴性对照组间无显著性差异,无遗传毒性。S水源Ames实验于试样浓度为7 L/皿时表现为阳性结果, 而SCGE在水样量为0.25 L时出现阳性结果(与阴性对照比P<0.01),前者的浓度是后者的28倍。说明S水源具有遗传毒性。对于遗传毒性的检测, SCGE比较敏感,适用于低剂量致变因子遗传毒性的检测分析。Ames 实验方法成熟、结果可靠,是水体有机物致突变性潜在危害的首选实验。结论 SCGE对DNA的损伤更敏感,可反映低剂量致变剂在较短时间内造成的DNA损伤。而Ames则反映致变剂的最终损伤作用,其结果稳定可靠,两种方法结合进行检测, 可更全面、准确地反映环境致突变因子的遗传毒性。
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  T2.31 高砷煤烘玉米粉对大鼠血尿中25项参数的影响

  姚茂琳;张爱华;于春;徐玉艳;黄华;潘化兵

  2013, 27(S1): 42-43.

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  目的 研究燃煤砷污染对血液系统、泌尿系统等的影响。方法 采用健康断乳Wistar大鼠40只,按体重用随机数字法分为4组(正常对照组,低砷、中砷和高砷粮食污染组),每组10只。正常对照组大鼠喂饲不含砷的标准饲料,各粮食砷污染组大鼠分别喂饲含砷25, 50和100 mg·kg^-1的饲料(通过调整饲料中高砷煤烘玉米粉所占比例控制含砷量),染毒时间3个月。采用F820型半自动血细胞分析仪检测全血中红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、白细胞计数(WBC)、淋巴细胞百分比(W-SCR)、中性粒细胞百分数(W-LCR)、淋巴细胞绝对值(W-SCC)、中性粒细胞绝对值(W-LCC)、血小板(PLT)等15项指标;优利特-200(A)型自动尿液分析仪检测尿液中亚硝酸盐(NIT)、糖(GLU)、比重(SG)、隐血(BLD)、蛋白质(PRO)、胆红素(BIL)、酮体(KET)和白细胞(WBC)等10项指标。血细胞参数多组间均数比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK法;尿常规指标采用完全随机设计多组比较秩和检验,检验水准α=0.05。结果 血细胞参数检测结果显示,与正常对照组比较,中砷粮食污染组大鼠RBC,中砷、高砷粮食污染组大鼠HCT,高砷粮食污染组大鼠PLT均显著降低,中砷、高砷粮食污染组大鼠WBC和W-LCC显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),其余指标各组间差异无统计学意义(P >0.05)。尿常规检测结果显示,随着染毒剂量的增加,PRO阳性率增加,高砷粮食污染组尿中PRO与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),尿pH值和BIL阳性率有增加的趋势,但差异无统计学意义(P >0.05);其余指标各组间差异均无统计学意义(P >0.05)。结论 燃煤砷暴露对大鼠血液系统有一定影响,可引起中、高砷粮食污染组大鼠RBC、HCT和PLT下降,HGB有下降趋势,这些改变可能与砷引起红细胞机械性脆性增加,造成红细胞在循环过程中容易被破坏而溶解,使红细胞数量减少有关;砷剂量组大鼠WBC和W-LCC升高可能与无机砷可诱发异常炎性反应有关。燃煤砷暴露可致大鼠尿蛋白异常率明显升高,结合血液生化检测中发现染砷大鼠尿素氮含量明显升高,提示燃煤砷暴露可引起大鼠肾脏损害。
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  Characterizing the exposome to complement the genome

  Martyn SMITH

  2013, 27(S1): 4-4.

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  The exposome is defined as the totality of environmental exposures from conception onwards. It offers a conceptual leap towards understanding the environmental causes of human disease through comprehensive studies of the internal chemical environment using repeated blood and other biological samples taken during critical life stages. It augments the chemical-by-chemical approach to finding causes of disease as it includes both endogenous and exogenous exposures. From a toxicological viewpoint it is the chemicals present in biological fluids, such as the plasma, that the body's cell and tissues encounter that then cause aberrant health conditions. Hence, it is the internal exposome that represents the total target dose of chemical agents in the body, no matter what their source or how they are derived. This includes chemicals arising from inflammation, oxidative stress and other endogenous sources. Several ‘omic’ technologies can be applied to characterize the exposome of specific diseases and may promote discovery of the key exposures responsible for chronic diseases. Characterizing the human exposome represents a challenge similar to the human genome project, which began when DNA sequencing was in its infancy and has generated by some accounts $140 for every $1 invested. Given the magnitude of the exposome challenge international participation is of paramount importance. Thus, we have formed the Exposome Alliance (http://www.exposomealliance.org) to promote investment in a human exposome project. The European Union recently took the first steps in this regard by funding a European Exposome Initiative that will support several international projects.
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  我国农药健康及环境风险评估技术研究进展

  陶传江;张丽英;曲甍甍;孟宇晰;闫艺舟;李敏;陶岭梅

  2013, 27(S1): 5-5.

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  农药的使用为充足的食物供应提供了重要的保障,但其安全性也成为社会关注的热门话题,主要体现在对人及生态环境健康安全等方面。农药风险评估已经成为欧美评价农药安全性的主要技术手段。我国农药风险评估技术研究起步较晚,"十一五"期间及"十二五"期间,借助国家科技支撑课题及公益性行业科研专项,农药风险评估技术研究开始启动并全面开展。 膳食风险评估技术研究主要引用FAO/WHO和OECD等评估方法,即根据毒理学试验评价结果,推导每日允许摄入量(ADI);通过残留田间试验结果及膳食结构推算每天通过食物摄入的农药量;通过二者的比较来表达风险大小。近年来国内科研机构加大力度对我国特有的膳食结构、小宗作物残留、加工因子等课题开展研究。施药人员风险评估技术研究主要借鉴美国环保局方法,主要考虑吸入及经皮两种暴露途径。通过对经皮、吸入毒性等关键毒理学数据的评价,推算施药人员每日可承受的安全剂量;通过全身法测试单位施药量导致的吸入或经皮暴露量,进一步结合每天的施药量,推算吸入或经皮暴露量。通过暴露量与安全剂量的比较来表达风险大小。目前施药人员风险评估技术研究主要集中在背负式喷雾器施药方式上。 卫生用农药风险评估技术研究重点针对蚊香类、气雾剂等产品,借鉴美国环保局风险评估方法,考虑吸入、经皮、经口(儿童)等暴露途径。通过对经皮、吸入毒性等关键毒理学数据的评价,推算居民每日可承受的安全剂量;通过模型模拟农药的释放及附着,模拟农药空气中的浓度及物体表面附着量的动态变化,进一步推算人在室内活动或睡眠时吸入、接触及儿童吸吮手指或玩具的经口暴露量。通过暴露量与安全剂量的比较来表达风险大小。环境风险评估技术研究主要借鉴欧盟风险评估方法,地下水、地表水、鸟、蜜蜂、桑蚕风险评估方法基本建立。以PEARL为基础改编的北方旱作地下水模型,可以预测农药使用后,通过降雨淋溶至地下水中的浓度。以降雨及土壤性质为主要驱动因子,以第99百分位为保护程度,在北方旱作区选取了6个典型场景点;将6个场景点的气候、土壤、作物、农业操作等数据编入模型,建立了China-PEARL模型。南方水稻区下地下水模型Paddy-PEARL也以PEARL模型为基础,选择了2个场景点。Paddy-PEARL可以同时模拟大量降雨后水稻田漫溢的情况,进一步与TOXWA模型组合,可以模拟预测地表水(池塘)中浓度。桑蚕风险评估考虑桑树施药及邻近农田施药漂移两种场景。
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  化学物毒性作用的非编码RNA机制

  蒋义国

  2013, 27(S1): 5-6.

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  近年来,生命科学界对RNA 的认识迅速从一种简单信息分子转变到一类具有重要基因表达调控作用的多重功能分子,许多具有功能意义非编码RNA的发现,挑战和完善了传统的遗传中心法则,展现了细胞内基因表达调控多层次的网络系统。近几年科学家们对小分子RNA(<200 nt)尤其是微小RNA (miRNA,≈20 nt)倾入了大量研究,阐明了体内miRNA对基因具有非常重要的调控作用,与正常的生理生化过程和疾病尤其是肿瘤发生密切相关。miRNA在毒理学领域的研究自首次报道至今约5年时间,研究发展相当迅速,已体现在毒理学研究的每一个方面。众多研究发现,miRNA具有调节外源化合物代谢、影响外源性化合物的肝脏毒性、生殖和发育毒性等功能,miRNA表达具有调控化学物质神经毒性等作用。我们的系列研究证实了miRNA在化学物诱导癌变作用中具有重要意义。在非编码RNA中,大分子长链非编码RNA(lncRNA,>200 nt)占有相当大的比例,已发现lncRNA数量是miRNA的10倍以上,且lncRNA序列长、结构丰富,其中必然蕴藏着大量生物学信息和意义,对这些数量更多、序列信息更丰富的大分子长链非编码RNA意义的关注更显重要,十分有必要拓展和加强lncRNA研究。目前,毒理学中的lncRNA研究正处于起步阶段,已有的报道了证明了化学物暴露对lncRNA的表达可产生重要影响,我们的研究发现lncRNA的异常表达和调控是化学致癌的重要机制之一。非编码RNA不仅在外来化学物对机体损伤中具有重要机制性作用,我们还发现在循环系统中非编码RNA分子同时还具有重要的暴露损伤标志物意义,非编码RNA为有害物质早期暴露损伤标志检测提供了新的手段。外来化学物毒性作用的非编码RNA机制及其标志物是将来若干年内表观毒理学的重要研究内容和发展方向。
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  纳米材料的毒理学效应及其关键影响因素

  陈春英;徐莺莺;王鹏

  2013, 27(S1): 6-6.

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  纳米材料具有特殊的性质, 包括量子尺寸效应、表面效应以及宏观量子隧道效应等。这些特性赋予纳米材料不同于块体材料的新的物理化学性能。随着纳米技术的发展, 越来越多的应用了纳米材料的纳米产品开始进入人们的日常生活, 纳米材料的毒性因此成为人们日渐关注的问题。对纳米材料的毒性效应研究衍生出纳米科学的一个重要分支学科: 纳米毒理学。纳米毒理学的概念在2003-2005年间提出, 这一领域主要研究纳米材料与生物体系, 包括组织、器官、细胞、亚细胞结构以及生物大分子的相互作用及其引起的毒性效应。阐明纳米材料对生物体的影响及其作用机制, 对于纳米材料的合理设计和安全应用具有重要的指导意义。近年来, 纳米材料毒性的研究取得了很大进展, 包括体内和体外实验研究纳米材料与生物大分子、细胞、器官和组织的相互作用以及其引起的毒性。大多数纳米材料通过诱导氧化应激和炎症反应等机制产生一系列毒性效应。例如,在诸多影响碳纳米管毒性评价的因素中,碳纳米管的长度和金属杂质被认为是重要因素。我们发现不同种类金属残留物可诱导自由基的生成,造成细胞的氧化损伤;在动物肺部吸入实验中,短的碳纳米管毒性比较小,长的碳纳米管激活巨噬细胞并通过TGF-β/Smad信号通路促进肺纤维化。纳米材料对细胞自噬的抑制或激活也是纳米材料毒性效应的一个重要方面。目前已经报道多种纳米材料可以诱导细胞自噬, 包括各种金属氧化物、贵金属Au, 树枝状聚合物、富勒烯C60, SWCNT等。自噬与很多细胞功能相关联, 包括免疫、炎症和细胞凋亡等。纳米材料本身的物理化学性质,包括尺寸、形状、表面电荷、化学组成、表面修饰、金属杂质、团聚与分散性、降解性能以及"蛋白冠"等等对其毒性有决定性的影响。本文对影响纳米材料毒性的关键因素进行了总结和分析, 对近年来纳米材料毒性效应的研究进展进行了综述。通过合理的合成设计, 能够调控纳米材料与生物体的相互作用, 降低甚至消除毒性作用。
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  环境铅暴露致脑发育损伤的机制

  陈景元

  2013, 27(S1): 6-7.

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  随着我国工业化的快速进展,环境铅污染及其带来的健康威胁成为日益严重的公共卫生问题,近年来全国各地多次发生较大规模儿童铅中毒事件,造成了严重的健康危害和恶劣的社会影响。大量研究证实:即使在较低的暴露剂量下,铅也可产生显著的中枢神经系统毒性,导致智力损伤、注意力缺陷、攻击性行为、神经退行性病变等一系列神经系统损害。铅神经毒性的机制目前尚不完全清楚。血脑屏障(BBB)是铅进入大脑的第一道防线,但是,BBB同时也是铅神经毒性的重要靶点。铅暴露可以造成BBB紧密连接(TJ)的结构破坏、屏障通透性增加、以及紧密连接蛋白(TJP)表达水平的下降,其机制可能与诱导多种蛋白激酶(如MAPK, AKT和PKC等)的磷酸化有关。我们最近的研究发现:铅可以通过诱导BBB血管内皮细胞葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的高表达,进而引起Src通路的磷酸化,特异性地引起紧密连接蛋白occludin的表达水平降低。铅诱导神经胶质细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达水平的增高和分泌增多,也参与了铅暴露后BBB TJPs降解的机制。同时,BBB上也存在与铅离子转运相关的转运体蛋白,其中二价金属转运体(DMT1)对于铅通过BBB的转运具有重要作用;铅可以通过诱导蛋白激酶磷酸化而调控铁调节蛋白1(IRP1)的水平,从而可能影响DMT1的表达。铅通过BBB进入大脑后,主要蓄积在海马等部位,除了直接损伤神经元,造成海马神经元凋亡、数量和突触数量减少外,还可引起海马小胶质细胞的显著活化,这种异常的活化现象受到TLR4-MyD88-NFkB信号通路的调控,且伴随有大量炎性因子(如IL-1和TNF-α等)的释放。通过药物抑制小胶质细胞的活化,可以显著减轻铅所诱导的LTP诱导障碍、海马神经元凋亡、以及LDH的释放,表明小胶质细胞的异常活化在铅诱导的神经毒性中起到重要的作用。另外,补充某些元素可以抑制铅的神经毒性。适量补充铁剂可以抑制铅在BBB的转运,降低大脑组织铅含量,减少铅诱导的神经元凋亡;而补硒可能通过抑制铅所引起的氧化应激损伤,而对学习记忆功能起到一定的保护作用。上述研究一方面发现了铅破坏大脑屏障系统、在大脑中转运的新机制,为进一步揭示铅在中枢神经系统的分布规律与其神经毒性之间的关系提供了重要的研究基础;另一方面,发现了小胶质细胞在铅损伤学习记忆机制中的重要作用和分子机制,为从神经胶质细胞角度进行铅神经毒性机制的研究提供了理论依据;同时,通过补充某些微量元素减轻铅神经毒性的探索也为铅毒性防治措施的研究提供了新的思路。
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  Mechanisms of pathological emotional memory：from animal to human

  LU Lin;

  2013, 27(S1): 7-7.

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  Normal emotional memory system is critical for survival across species. However, when individuals are exposed to the traumatic experience or addictive drugs, the emotional memory system is engaged in the pathological learning underlying the related diseases. Our laboratory has been investigating the abnormal synaptic and behavioral plasticity during different pathological memory phases and exploring new pharmacological and behavioral strategies for addiction and post-traumatic stress disorder (PTSD). We discovered that cyclin-dependent kinase 5 activity in basolateral amygdala plays a critical role in the consolidation, retrieval and reconsolidation of cocaine-associated memories protein kinase M zeta is a critical cellular substrate for the maintenance of memories of drug-related cues. Considering that most of the pharmacological compounds used in these studies are not suitable for human use, we developed a new nontoxic behavioral procedure to prevent drug craving and relapse. We found a memory retrieval-extinction procedure can decrease conditioned drug effects and drug seeking in rat models of relapse and drug craving in abstinent heroin addicts. Recently we are exploring a new behavioral procedure-unconditioned stimulus (UCS) retrieval-extinction procedure. Unlike the CS-retrieval-extinction manipulation, the UCS-retrieval-extinction manipulation inhibits drug seeking induced by discrete drug-associated cues not present during extinction training and also inhibits drug seeking induced by other cues. Moreover, we have also applied the UCS retrieval-extinction to target diverse cues associated with an aversive event that have caused fear memories, and disruptive effects of the procedure persist for at least half a year. These findings demonstrate a modified US retrieval-extinction strategy that may lead to new therapeutic approaches for drug addiction and PTSD.
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  组蛋白修饰与细胞DNA损伤修复

  陈雯

  2013, 27(S1): 8-8.

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  组蛋白是一类重要的核蛋白,与DNA共同构成核小体,是染色质的基本构成单位。组蛋白N末端突出于核小体之外,可以形成多种类型的修饰。这些修饰通过改变染色质的构象,对细胞的生理功能产生影响。组蛋白修饰参与细胞DNA复制,DNA损伤修复,基因表达调控,并在生长发育,肿瘤形成等过程中起到重要作用。DNA损伤修复过程是机体维护基因组完整性和稳定性的重要措施,其功能缺陷是环境化学致癌的关键机制。近年来的研究发现,组蛋白修饰对于化学致癌物或促癌物诱导细胞DNA损伤修复过程中起重要作用,因此,研究组蛋白修饰在化学物诱导DNA损伤修复中的作用在明确化学物毒性效应,化学致癌机制,寻找化学物暴露早期效应生物标志等方面具有重要意义。目前研究表明,组蛋白的磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化修饰类型与DNA的损伤修复关系最为密切。本课题组主要研究组蛋白的磷酸化修饰过程对于DNA损伤修复的影响。组蛋白H2AX的磷酸化形成γH2AX是DNA双链断裂修复中非常关键的步骤,可以起到激活相关反应蛋白,募集DNA修复因子的作用,但其去磷酸化过程也同样重要。γH2AX的去磷酸化过程异常会导致其持续磷酸化,影响DNA损伤修复的完成。我们的研究发现蛋白磷酸酶2A(PP2A)参与了γH2AX的去磷酸化过程,并且发现该过程由带有B56亚基的PP2A全酶介导。另外,我们发现PP2A催化亚基(PP2Ac)会与Rad51等蛋白结合,由γH2AX募集于DSB位点,然后由PP2A的结构亚基A与B56亚基形成PP2A全酶,执行γH2AX去磷酸化功能,系统地阐明了PP2A介导的去磷酸化作用在DNA损伤修复中的作用机制。除了组蛋白H2AX的磷酸化,H3的磷酸化也在DNA损伤修复中发挥重要作用。我们用化学致癌物BaP和AFB1对细胞染毒发现,H3的磷酸化出现升高,并且与毒物有剂量反应关系和时间效应关系。用喜树碱CPT处理组蛋白H3的敲除细胞株和H3上11位苏氨酸的突变细胞株后在恢复不同时间,检测γH2AX都显示H3的磷酸化失活会导致γH2AX出现时间延后,表明影响了DNA双链断裂的修复过程,具体机制还需进一步的研究来阐述。我们研究还发现组蛋白H3的甲基化和乙酰化对于一系列化学致癌物的作用均有不同程度的反应,并且许多位点修饰的改变可能影响化学致癌物诱导DNA损伤修复的过程。利用已构建组蛋白H3不同位点修饰缺陷的细胞株,我们发现H3的甲基化和乙酰化修饰改变影响化学致癌物诱导的DNA损伤修复及细胞恶性转化过程。上述研究证明特定的组蛋白修饰控制化学物诱导的细胞生物学效应,进一步的环境或职业暴露人群生物样本的组蛋白修饰检测有助于明确这些特定的修饰否作为化学致癌物暴露早期效应的生物标志。
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  动物使用抗菌药物后的残留与耐药性问题

  沈建忠

  2013, 27(S1): 8-9.

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  我国是世界上最大的畜禽生产和产品消费大国,2011年肉、蛋、奶和水产品产量分别达到7957.8万吨、2811.4万吨、3810.7万吨和5603.2万吨(2012中国统计年鉴)。动物源性产品的生产离不开兽药的使用,仅以抗生素为例,我国每年生产抗生素原料大约21万吨,其中有9.7万吨抗生素用于畜牧养殖业,占年总产量的46.1%(制药工业学会)。严重依赖甚至过度使用抗菌药物,导致了动物源性食品安全两大问题:抗菌药物残留和细菌耐药性,其不仅对畜牧养殖业的健康、持续发展造成危害,而且严重威胁食品安全、人类健康和生态环境。本文概述了造成动物源性食品抗菌药物残留的原因和危害、我国主要监控的抗菌药物种类以及抗菌药物残留检测的关键检测技术及其发展趋势。当前细菌耐药性给食品安全和公众健康带来的危害已成为国内外关注的热点。世界卫生组织已把细菌耐药性问题列为了本世纪最重要的公共安全事件之一。动物源细菌耐药性问题有可能成为继兽药残留之后动物源性食品贸易又一种技术壁垒。我国在有些地区存在的"耐药菌↑-用药量/种类↑↑-耐药菌↑↑↑"恶性循环仍在继续,已成为动物源细菌耐药性较严重的国家,一些病原菌临床分离株可耐受15~20种以上抗菌药物,动物感染性疾病的防治越来越困难。结合本实验室近年来在动物源性食品药物残留和耐药菌的流行病学调查和耐药机制研究方面的工作,提出如下对策和建议:(1) 动物源性食品安全需从养殖源头、运输、屠宰、加工和贮藏等各环节全程监控和管理,其中健康养殖和日常监测至关重要;(2)动物健康和养殖业发展仍离不开抗菌药物,但合理、谨慎使用是关键,目前亟需制定全球兽用抗菌药物使用规则;(3) 人体细菌感染相当一部分来源于动物,食源性耐药病菌可在动物间传播,也可能在动物-食品/环境-人体之间传播,应引起高度重视;(4) 鼓励利用新技术研发抗菌药物替代物,减少兽用抗菌药物使用;(5) 第三、第四代头孢类和氟喹诺酮类是医学临床抗感染至关重要的抗菌药物,需严格监控其耐药性动态;(6) 建立兽用抗菌药物使用和动物病原菌耐药性动态数据库,提供合理给药方案。
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  药源性肝损伤的新型生物标志物研究进展

  马璟;汤纳平

  2013, 27(S1): 9-10.

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  肝脏是人体的主要代谢器官,也是药物代谢的主要场所,因此,在药源性不良反应中,药源性肝损伤(DILI)是最常见不良反应之一。尽管目前难以准确统计人群中药源性肝损伤的发生率,但研究显示,DILI是临床上导致急性肝衰竭的主要原因,也是药物开发失败和批准上市后使用受限或撤市的主要原因。为了解决这一挑战性且常引起争议的问题,科学家们已作出了很多的努力,尤其是在确定DILI新的生物标志物方面,随着近年来生物技术的快速发展,很多新的技术方法如基因组学、蛋白质组学、代谢组学等,已广泛用于发现和评价新的DILI生物标志。基于芯片技术的基因表达谱研究已广泛用于DILI新生物标志物的发现。通过采用相似作用机制或可诱导肝损伤的药物,筛选出一系列与DILI相关的特异表达的基因,尽管这些基因可反应DILI的严重程度或预测DILI的发生,并可解释DILI的作用机制,但通常通过芯片技术筛选出的基因数较多,从众多候选基因的筛选到系统验证,再到应用尚需时日。微RNA芯片技术的应用发现外周血循环中的miR-122无论是特异性还是敏感性都优于传统的生物标志物。另外一些高新技术如全基因组关联分析技术(GWAS)和高度并行化新一代测序技术(NextGen)也为DILI新生物标志物的发现提供了基础,如研究发现HLA-B*5701基因型与氟氯西林诱导的肝损伤以及慢代谢性NAT2(N-乙酰转移酶2)与抗结核药物诱导的肝损伤密切相关。而且美国FDA已经着手对这两者作为DILI潜在的基因组生物标志物进行探索性研究。近年来,蛋白质组学技术在DILI新生物标志物中的应用也取得了突破性进展,如在动物研究中发现血清维生素D结合蛋白(BDP)、对氧磷酶(PON)、视黄醇结合蛋白(RBP)、苹果酸脱氢酶(MDH)、F-蛋白(HPPD)以及嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)可作为潜在DILI生物标志物;人体研究中发现血清Obscurin (isoform 1)、多聚免疫球蛋白受体(pIgR)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STPK 10)、载脂蛋白A-Ⅱ(APOA2)、转甲状腺素蛋白、巨噬细胞集落刺激因子1受体(MCSF1R)、补体C7、维生素D结合蛋白(BDP)、维生素D结合蛋白前体(BDPP)、keratin-18以及HMGB1与DILI密切相关。动物尿液蛋白质组学研究还发现尿液细胞色素C(Cyt C)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、碳酸酐酶3(CA3)以及钙调蛋白(CaM)也可能成为DILI非创伤性生物标志物。代谢组学研究发现可能成为DILI的新生物标志物主要有血清视晶酸(ophthalmic acid)、尿液中的8'-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)和辛酰肉碱 (octanoylcarnitine)以及血浆和尿液中的胆汁酸等。尽管高新技术的应用发现了许多潜在的DILI新生物标志物,但是有些标志物的研究尚处于动物实验阶段,有些尚待更全面系统的联合验证才能用于临床前和临床研究中。另外,研究和开发更加快捷、方便、准确的检测方法也是当前亟待解决的问题。
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  T1.21 Beagle犬实验中的动物福利和人员防护

  杨光;王捷;高明伟;吕耀中

  2013, 27(S1): 21-21.

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  Beagle犬广泛地应用于毒理学等基础医学的研究工作中,在试验过程中动物福利被社会所广泛关注。根据动物福利的5个自由原则:1 生理福利 动物有避免饥渴、饥饿和营养不良等不利因素影响的自由;2 环境福利 动物有获得舒适生活条件的自由;3 卫生福利 动物有脱离痛苦、受伤和疾病的自由;4 行为福利 动物有表达天性的自由;5 心理福利 动物有脱离恐惧和心理压力的自由。结合本单位的具体情况,针对犬的饲养条件,笼具空间,饲料与饮用水,环境丰富化措施,饲养环境和空调系统的管理,犬的检疫和隔离,疾病预防诊断治疗,试验人道终点的选择,动物使用方案的审核与监督等环节制定完善的规章制度并规范各项操作。基础医学研究工作的最终目的是维护人类健康,针对与犬试验过程有关的职业风险因素,为试验人员提供职业风险评估,危害识别,岗前培训,健康检查,控制预防策略和各种防护设备,保证试验人员熟练地掌握各种防护设备的使用方法和各项操作技术。总结动物福利和员工职业保健和安全的相关进展并与实际工作相结合,在实际工作中采取针对性的措施将试验环境和试验操作对动物的应激减至最低,保障动物福利和人员安全,保证试验数据科学性和试验的可重复性。
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  Three pillars of sustainable R&D：Green design, discovery toxicology screening, and proactive product stewardship

  Kathleen SHELTON

  2013, 27(S1): 10-10.

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  In current modern society, there is a growing emphasis on sustainability as a key factor for product competitiveness. Therefore, industrial R&D trend is moving from simply meeting regulatory and legal requirements towards a more sustainable path which minimizesproduct impact on health and the environment, while maximizingthe efficiency and use of renewable resources during its entire life-cycle. Here, we want to argue that green design, discovery toxicology screening, and proactive product stewardship are three pillars of sustainable R&D. Adopting a green design concept throughout all phases of the R&D processes allows a tight integration of "green chemistry/engineering principles" with future products. Reducing product risks to human health and the environment is a key component of "green principles" and is ensured via discovery toxicology screening and proactive product stewardship during product R&D. Via discovery toxicology screening, potential hazardous materials/chemicals towards human health or the environment will be identified and assessed before being considered for further development.Via proactive product stewardship, the entire life-cycle of a product is assessed against product sustainability categories related to environmental performance such as waste generation, energy efficiency, by-product, reduced impact to human health and the environment relative to existing products on the market, etc. All the activities involved in green design, discovery toxicology screening, and proactive product stewardship during product R&D are to ensure an ultimate goal of sustainability.
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  Toxicology program and strategy for supporting combination drugs for IND and NDA application

  JIN Yi

  2013, 27(S1): 10-10.

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  In recent years, more drug development programs involve combination of two or three drugs. This strategy combines two or three drugs with different pharmacological actions in a single pill, or in separate dosage forms, for co-administration and often provides better efficacy than a single drug therapy. Well known examples of combination drug therapy include approved drugs for treatment of hypertension and hepatitis C. The toxicology program and strategy to support combination drugs has become a focus of attention and interest for drug development. Assessment of potential toxicity or synergistic effects as a result of combination of two or three drugs is a key factor for success of the combination. Nonclinical safety data generated from toxicity studies on combination drugs are often considered to be pivotal data for development decisions and for health authorities' approval of human clinical trials and marketing authorization. The new ICH M3 (R2) guidance (2009) provides recommendations on nonclinical safety assessment for combination drug therapy in various situations. Application of the guidance to real situations is often challenging because the determination of need for a combination toxicology to support a program is often unclear. This presentation will discuss the regulatory requirement for the nonclinical safety assessment on combinational drugs, and provide our experience with design of the toxicology program and strategy for successfully supporting IND and NDA applications in US and EU.
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  T1.1 苯并[a]芘诱导的恶性转化对DNA甲基化转移酶表达水平及活性影响

  邓雯文;杨沫;张遵真;吴媚

  2013, 27(S1): 11-11.

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  目的 研究苯并[a]芘(BaP)诱导的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化过程对DNA甲基化转移酶(DNMT)表达水平及活性的影响,为进一步阐明BaP致癌的分子机制提供实验依据。方法 以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(pol β^+/+)和20 μmol·L^-1的BaP(经S9活化)长期多次染毒构建的小鼠胚胎成纤维恶性转化细胞(pol β-T)为研究对象,以gadph作为内参,采用RT-PCR检测两种细胞中dnmts(dnmt1, dnmt3a和dnmt3b) 的mRNA水平;以15 ku的组蛋白H2AFX为内参,用Western蛋白质印迹方法检测细胞中DNMT(DNMT1, DNMT3a和DNMT3b) 的蛋白表达水平,同时用DNA甲基转移酶活性/抑制分析试剂盒检测DNMT的酶活性。结果 pol β-T经转化灶形态观察、细胞迁移实验、软琼脂克隆等实验鉴定,表明pol β-T细胞已具备典型的恶性转化细胞特征。RT-PCR结果显示,polβ-T细胞dnmt1和dnmt3b的mRNA相对表达量分别为0.940±0.033和0.905±0.062,均高于pol β^+/+细胞(0.560±0.031和0.666±0.041),差异有统计学意义(P<0.05),两种细胞dnmt3a mRNA相对表达量的差异不明显,无统计学意义;Western蛋白质印迹结果显示,pol β-T细胞DNMT1和DNMT3b的蛋白相对表达量分别为2.172±0.089和1.134±0.144,亦均高于pol β^+/+细胞(1.311±0.050和0.820±0.106),差异具有统计学意义(P<0.05),两种细胞DNMT3a的蛋白相对表达水平均无显著性差异;酶活性检测结果显示,pol β-T细胞和pol β^+/+细胞A值分别为1.45±0.08和1.92±0.13,pol β-T细胞中DNMT酶活性[(234±23)mg^-1·h^-1]较pol β^+/+细胞中DNMT酶活性[(318±42)mg^-1·h^-1]明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 BaP可能通过诱导肿瘤相关基因甲基化水平的异常,增加基因组的不稳定性,促进肿瘤的发生发展。
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  T1.2 AC认证条件下职业健康与安全的建立和管理

  韩重;杨威

  2013, 27(S1): 11-11.

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  职业健康与安全是AAALAC认证中重要的组成部分,现从职业健康与安全管理委员会的职责、职业健康与安全程序在实验动物研究工作中的建立与实施、危害因素识别、职业健康与安全危害因素的控制和预防策略4个方面,介绍AAALAC认证条件下职业健康与安全建立和管理的相关规定和经验。
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  T1.3 单次暴露纳米二氧化硅及环境纳米微粒的肺毒性效应的观察

  范兰兰;林嫔嫔;林家骅

  2013, 27(S1): 12-12.

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  目的 探讨纳米二氧化硅(nano-SiO₂)微粒可能的生物学危害作用。方法 采用30 nm和40 nm粒径的nano-SiO₂标准品和采集的环境纳米微粒进行体内及体外的肺毒性效应研究。结果 体内实验结果显示,SiO₂标准品经由气管灌注后可见小鼠肺部出现炎症,且灌注30 nm nano-SiO₂的小鼠肺部发炎概率明显高于400 nm SiO₂组,但小鼠肺部炎症病变都非常轻微。体外实验结果显示,400 nm SiO₂诱发的肺毒性作用大于30 nm nano-SiO₂。两种SiO₂对小鼠肺细胞炎症表现的影响并无差异。分析采集的环境纳米微粒发现含有SiO₂纳米粒子。结论 单次暴露nano-SiO₂对肺的毒性作用有限,但不能排除长期的暴露肺毒性作用。
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  T1.10 胚胎干细胞衍生肝组织IL-6炎症模型在恶性转化评价的应用

  李彤;金珂;叶杭涛;张妙勇;张玺城;朱丹雁;项春生;楼宜嘉

  2013, 27(S1): 15-16.

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  目的 利用胚胎干细胞衍生的肝组织富含血窦,库普弗细胞遇到生物或化学刺激,可分泌炎性细胞因子白介素-6(IL-6),制备炎性模型。并探索炎性恶变的网络调控分子事件与信号通路。方法 与结果(1)胚胎干细胞定向分化至第18天,以白蛋白(AlB)阳染细胞为分化成熟的肝细胞,PECAM-1阳染细胞为分化成熟的血管内皮细胞,据此确定胚胎干细胞衍生肝组织体外实验体系制备成功。(2)胚胎干细胞分化初期,加入一定浓度范围的马兜铃酸Ⅰ(AAI)共培养,至分化第18天时,与DMSO组相比,免疫荧光成像确定血窦库普弗细胞被IL-6阳染,同时大量IL-6弥漫浸润在肝细胞周围,据此确定IL-6分泌炎性模型建立。(3)上述炎性模型分别用炎性恶变开关分子免疫荧光染色与AlB阳染共叠加,作为炎症恶性转变信号通路特异分子事件,并以甲胎蛋白(AFP)表达为恶变指标。与DMSO组相比,AAI组研究体系出现下述肝组织炎性恶变网络调控现象:"IL-6分泌上调→多个恶变开关分子上调→AFP上调"。结论 构建胚胎干细胞衍生肝组织IL-6炎性模型,可用于初步评价化学物质致炎恶性转变;AAI处理后,出现炎性恶变的网络调控分子事件与信号通路。
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  T1.11 基于流式细胞仪的银纳米颗粒微生物摄入检测和效应分析

  罗勋;梁俊婷;陈少鹏;吴李君

  2013, 27(S1): 16-16.

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  目的 利用大肠杆菌,探讨和比较银纳米与硫化银纳米进入大肠杆菌的差异分布,及其导致生物学效应的异同。方法 银纳米或硫化银纳米分散后,以10 mg·L^-1的终浓度将其加入含有对数生长期大肠杆菌LB液体培养基中。加入纳米材料后,将混合纳米颗粒、OP50和LB的锥形瓶于振荡培养箱中继续培养16~20 h,取出洗涤后,使用流式细胞仪进行分选,根据细胞所含颗粒度分选出阳性、弱阳性、阴性3个等级。分选后的微生物同时开展SEM与TEM形态学检测,OP50对纳米颗粒的摄入量检测,OP50毒性效应检测。结果与结论 流式细胞仪分选的阳性细胞颗粒度含量是10.7%,弱阳性细胞颗粒度含量是2.2%,阴性细胞颗粒度含量为0;SEM与TEM拍摄的图片显示,大肠杆菌细胞膜有损坏现象,细胞内分布大量的纳米颗粒,能谱显示为银纳米或硫化银纳米;分选的3个等级的OP50-CFU结果均呈显著的生长抑制效应,与摄入纳米粒子有一定的相关性;与银纳米相比,硫化银纳米的毒性效应明显减弱。
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  T1.12 硫丹诱导小鼠GC-1spg精原细胞凋亡的机制

  徐英;郭芳子;施致雄;李艳博;周显青;孙志伟

  2013, 27(S1): 16-17.

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  目的 探讨硫丹诱发小鼠精原细胞凋亡的毒作用机制。方法 实验采用小鼠GC-1spg精原细胞为实验对象,首先设计5个不同浓度的硫丹(3,6, 12, 24, 36 mg·L^-1)进行染毒,观察它们在作用6, 12, 24, 48 h后对精原细胞活性和乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响;在此基础上,选取6, 12和24 mg·L^-1三个硫丹浓度和24 h作用时间,探讨硫丹引发其凋亡的作用机制。采用MTT法测定硫丹对GC-1spg精原细胞活性的影响;比色法测定细胞培养液中LDH的活性、细胞中ATP含量、SDH活性及胱天蛋白酶3, 胱天蛋白酶8, 胱天蛋白酶9活性的改变;AnnexinⅤ-FITC/PI 双染法流式细胞术(FCM)检测凋亡率;FCM检测细胞内ROS水平;Western blotting法检测细胞凋亡信号通路相关因子蛋白的表达。结果 硫丹作用6 h,GC-1spg精原细胞活性在6, 12, 24和36 mg·L^-1组明显低于对照组,硫丹作用12, 24, 48 h,细胞活性在3, 6, 12, 24和36 mg·L^-1组明显低于对照组,呈现明显的时间和剂量依赖关系。细胞外液中LDH的活性随着硫丹剂量的增加逐渐增加,在6, 12, 24和36 mg·L^-1剂量组明显高于对照组和3 mg·L^-1剂量组。硫丹作用24 h, 细胞内ATP含量和SDH活性均随着硫丹剂量的增加逐渐降低,在6, 12和24 mg·L^-1组均明显低于对照组。而ROS水平和细胞凋亡率及胱天蛋白酶3, 胱天蛋白酶8, 胱天蛋白酶9活性均随着硫丹浓度的升高逐渐增加,呈现剂量依赖效应,其中ROS水平、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9活性在硫丹剂量为6, 12和24 mg·L^-1组均明显高于对照组,细胞凋亡率和胱天蛋白酶3活性在硫丹剂量为12和24 mg·L^-1组明显高于对照组。硫丹作用24 h,Bax和细胞色素C(Cyt C)的蛋白表达量随着硫丹剂量的增加而升高,在硫丹剂量为12和24 mg·L^-1组均明显高于对照组,而Bcl-2蛋白表量随着硫丹剂量的增加而下降,在硫丹剂量为12和24 mg·L^-1明显低于对照组。结论 硫丹可能通过诱发氧化应激,激活死亡受体途径中胱天蛋白酶8,导致其下游的胱天蛋白酶3激活;另一方面,氧化应激导致线粒体能量代谢障碍,引起促凋亡因子Bax激活,促进线粒体中细胞色素C进入胞质, 激活胱天蛋白酶9,引发其下游的效应子胱天蛋白酶3激活。这说明,硫丹可能同时激活了细胞凋亡的死亡受体途径和线粒体途径引发了GC-1spg精原细胞凋亡。
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  T1.13 三甲基氯化锡中毒防治研究进展

  周凤;张晋昕;任雪峰;唐小江

  2013, 27(S1): 17-17.

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  三甲基氯化锡(TMT)是甲基硫醇锡热稳定剂合成过程中产生的一种剧毒物质,遇热易挥发,具有脂水两溶性,可经呼吸道、消化道、皮肤进入人体引起中毒事故的发生。目前全球已发生TMT中毒事故72起,中毒1867例,死亡24例。急性中毒主要变现为中枢神经系统症状及低钾血症,慢性中毒的靶器官主要为肾脏,可引起肾结石的发生。TMT主要影响大脑边缘系统,又以海马区为主,造成中枢神经系统症状。TMT可抑制肾氢钾ATP酶,造成低钾血症和代谢性酸中毒,极有可能是引起肾结石发生的主要机制,但仍需进一步的研究。为切实做好TMT中毒的预防,不仅亟需建立专门针对三甲基氯化锡的职业接触限值,同时应开展更深入的研究PVC塑料中TMT对普通人群中健康的影响,开发更加安全、无毒、环保的热稳定剂。
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  T1.14 芥子气血浆代谢产物作为毒剂早期诊断的暴露标志物

  李春正;钟玉环;谢剑炜;李桦

  2013, 27(S1): 17-18.

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  目的 本研究旨在建立同时检测血浆中芥子气代谢产物的定量方法、通过研究血浆毒物动力学过程,评价血浆代谢产物作为芥子气早期暴露标志物的可行性。方法 应用LC-MS/MS技术建立并验证同时检测大鼠血浆中芥子气代谢产物硫二甘醇(TDG)、二羟乙基亚砜(TDGO)、芥子亚砜(SMO)、1,1'-磺酰基-二(2-甲硫基)乙烷(SBMTE)、1-甲基亚磺酰基-2-(2-甲硫基乙基磺酰基)乙烷(MSMTESE)、1,1'-磺酰基-二(2-甲基亚磺酰基)乙烷(SBMSE)和1,1'-磺酰基-双(2-S-(N-乙酰半胱氨酸基))乙烷(SBSNAE)的定量方法。大鼠皮下和皮肤染毒3个剂量的芥子气(1, 3.3和7 mg·kg^-1),染毒前和染毒后于不同时间点采血120 μl,分离血浆,LC-MS/MS法定量测定代谢产物的血浆浓度,用WinNonlin软件的非房室模型进行拟合,得到相应动力学参数,分析暴露参数C_max和AUC与染毒剂量的相关性,确定暴露时间窗。结果 大鼠皮下和皮肤染毒3个剂量芥子气后,0.08~72 h的时间段内,在血浆中可检测到芥子气的代谢产物SMO, TDG, TDGO, SBMTE, SBMSE, MSMTESE和SBSNAE,其中SMO是芥子气染毒后血循环中的主要产物。毒物动力学分析结果表明,SMO, TDGO, SBMSE, MSMTESE和SBSNAE的血浆暴露与剂量之间存在明确并良好的线性相关性,血浆浓度随剂量增大呈线性增高,定量时间窗为染毒后5 min至48 h,可以用作暴露标志物。将定量检测技术用于意外中毒人员生物样品的检测,确证芥子气接触中毒,并为受伤人员的暴露时间及中毒程度判断提供重要的定量化数据。结论 毒剂染毒剂量与标志物血浆暴露水平之间有一定的相关性,可通过血浆标志物种类及其检测时间窗确定暴露物。
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  T1.27 An integrative approach for the prediction of acute systemic toxicity：past and future

  R NOTE;H NOCAIRI;M THOMAS;L BOUROUF;JM MCKIM Jr;V MICHAUT;G OUÉDRAOGO;F LEROY;J COTOVIO

  2013, 27(S1): 24-25.

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  Increasing societal concerns for animal welfare and current legislation constraints have made the industry entre a new phase in its innovation and R&D processes. The challenge is to move from a descriptive to a predictive (mechanistically-based) toxicology, with ultimately the anticipation of the risk in human and decreasing reliance on animal usage. As such, the rapid emergence of new technologies and development of systems biology approaches are thought to offer great promise for filling in current toxicity data gaps and addressing this paradigm shift in a cost/time effective manner and with a sound scientific rationale. Typically, risk assessors could use biological profiling from high-throughput in vitro assays including novel-omic technologies, along with in silico (computer-based) analysis to predict human toxicants. Other bioinformatics or computational alternatives include the development of virtual tissue models which can provide a basis for predicting emergent properties of tissues. There is a growing international effort to develop and ensure the transition of such methods into regulatory practice. In the United States, the US EPA, for example, is actively contributing to this transformative shift through the ToxCast program with an initial focus on providing biological profiles for well-characterized chemicals. In Europe, several research programs are being supported or coordinated by the European Commission (EU) within the framework of the REACh new chemicals legislation and the 7th amendment to the Cosmetics Directive (European Commission, 2003). This directive foresees a marketing ban of cosmetic products containing ingredients or combinations of ingredients which have been tested, among other toxicity endpoints, in acute toxicity studies after March 2009. With regards to acute toxicity, efforts have been gathered over the last years to develop in vitro methods that would be sufficiently robust to reduce or even replace in vivo animal testing. The rationale behind derives from observations, notably arising from the Multi-centre Evaluation of In Vitro Cytotoxicity (MEIC) study, that basal cytotoxicity can be used as a surrogate endpoint for predicting lethal systemic toxicity in vivo. Developing alternatives in this area remains a challenge because of the complexity of the biological processes involved. Because of their strong commitment to alternative to animal testing, l'Oréal and Ceetox have been collaborating since 2007 and demonstrated that applying a realistic approach, based upon the combination of multiple parameters, could provide promising results. We showed that considerations of cell-death data, pharmacological profiles and physico-chemical properties resulted in a significant improvement of the LD₅₀ model originally developed by CeeTox (standard model). The modified approach was applied to 76 non-proprietary compounds previously tested with the standard method. A significant improvement in the prediction of the GHS categories was observed. Indeed, 75% of the chemicals pertaining to GHS 1, 2 and 3 were correctly classified, compared to 50% with the standard model. In addition, at an LD50 threshold of 500 mg·kg^-1, the sensitivity and specificity values were 85% and 89% with the new model against 71% and 83% with the standard model. A validation set that consisted of 17 compounds was subsequently proposed. As such, cytotoxicity and pharmacological parameters were processed in conjunction with specific physico-chemical properties in order to generate LD₅₀ predictions. The results confirmed that the integrative approach was robust and that improvements were made for the predictions of highly toxic chemicals. The results showed that 16 out of the 17 chemicals were correctly categorized. In addition, by pooling the training and validation sets, the overall predictive performance remained high, with sensitivity and specificity of 87% and 89% at an LD₅₀ threshold of 500 mg·kg^-1. This study is a clear demonstration that one way to address acute systemic toxicity is the combination of multiple, mechanism-based parameters and key chemical properties. However, efforts are still required to expand the applicability domain of the model and anticipate the complexity and diversity of consumer products in terms of chemical reactivity and classes of solubility profiles.
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  T1.28 Risk assessment practices applied to consumer product safety in North America and Europe

  Richard J WENNING;ZHOU Xiao-jian;Joseph RODRICKS;Belinda GOLDSWORTHY;Sue BULLOCK;Gavin THOMPSON

  2013, 27(S1): 25-26.

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  This presentation addresses the importance of sound risk assessment methods for addressing consumer product safety issues in North America and the European Union (EU). Product safety concerns are elevated by the news media and focus the attention of regulatory agencies, product manufacturers, and the general public;examples include concerns about phthalates and metal substances in children toys, dioxins in paper products, and child-resistant packaging of household products. In North America and EU, risk assessment is used by government to determine the need for product recall, and by manufacturers to evaluate product designs and life cycles. Several government agencies in Europe and North America are developing robust risk assessment methods to minimize reliance on qualitative product information. Canadian authorities, for instance, are developing a risk assessment framework that includes a prioritization tool for preliminary screening of existing and new products in several consumer categories. In the USA, the Consumer Product Safety Improvement Act of 2008 strengthened risk assessment practices applied to a consumer products used in and around the home or by children. California's Proposition 65 regulation, one of the strictest consumer protection laws globally, requires labeling of consumer products that contain chemicals known to cause cancer or birth defects or other reproductive harm. California also has begun to implement a Green Chemistry Initiative under the Safer Consumer Products Act (SCPA), which will list chemicals as targets for replacement or substitution in consumer products based on identified hazards. The SCPA will require assessments of chemical substitutes using a risk assessment approach that includes potential exposures to workers, handlers, and consumers. In the E.U., manufacturers and governments rely upon risk assessment guidelines for non-food consumer products developed under the General Product Safety Directive, which mandates manufacturers to demonstrate that consumer products that under normal or reasonably foreseeable conditions of use presents no risk, or only the minimum risk compatible with the product's use, and which is consistent with a high level of protection for consumers. Since inception in 2007, the REACH program under EU regulations has had an enormous influence on consumer product manufacturing, mandating the safe use of chemicals through the entire supply chain. As a consequence of international awareness, it is evident that worldwide efforts to improve risk assessment methodologies should aim to identify all aspects that could contribute to a human health or safety risk, including when a consumer product is either used in a foreseeable manner or misused. Product risk assessment approaches are based on scientific evidence and sound judgments to the extent practical. The approaches rely less on qualitative measures and theoretical analyses, which may lead to subjective judgments and incorrect conclusions and undermine the credibility of the risk assessment process, the product manufacturer, and possibly government officials charged with protecting consumer health and safety.
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  T2.1 生态风险评估与水环境基准研究进展

  刘征涛

  2013, 27(S1): 26-26.

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  我国环境污染逐渐呈现出复合性、多元性、结构性污染的特点, 水环境污染已从地表水延伸到地下水,从一般污染物扩展到有毒有害污染物,形成了点源与面源共存,生活污染和工业排放叠加,新旧污染与二次污染相互复合的态势。主要介绍近年来,在环境与生态毒理学领域,开展以流域水环境特征污染物的生态风险评估、毒理学机制为核心内容的我国水环境质量基准方法如水生生物模式物种筛选、毒理学指标识别及基准阈值数理方法研究进展,增强环境基准与环境标准相关领域的基础研究能力,为环境质量评价、环境风险控制与管理提供科学支持。
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  T2.8 全氟辛烷磺酸显露与哮喘免疫生物标记物：病例-对照研究

  董光辉;金一和

  2013, 27(S1): 29-30.

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  目的 探讨全氟辛烷磺酸(PFOS)与儿童哮喘及其哮喘免疫标记物IgE,外周血中嗜酸性粒细胞绝对数(AEC) 及嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)的相关性。方法 231名医院就诊的哮喘儿童作为病例组,来自社区的225名自然儿童作为对照组。对所有的儿童家长进行面对面问卷调查,并检测儿童血清中PFOS, IgE, AEC和ECP的水平。结果 哮喘儿童血清中PFOS的水平显著的高于对照组水平(33.9 μg·L^-1)(Q1~Q3: 19.6~61.1 μg·L^-1)vs. 28.9 μ/·L^-1(14.1~43.0 μg·L^-1),且随着血清中PFOS的水平增高,儿童患者哮喘的优势比(OR值)也呈显著的增高趋势;按PFOS浓度的中位数和四分位数将儿童分为四部分,与PFOS第一分位数相比,第四分位数儿童患有哮喘的风险增高了63% (OR=2.63;95%CI:1.48~4.69)。在非哮喘组儿童中,哮喘免疫生物标记物(IgE, ECP和AEC的)在PFOS不同水平中的分布差异无统计学意义。而在哮喘儿童组中,随着PFOS浓度的增高,IgE(在四部分儿童中的水平分别为:517.9, 686.2, 658.1和877.3 IU·ml^-1;趋势检验P=0.008)、ECP(25.9, 37.4, 43.5和62.4 μg·L^-1;趋势检验P=0.001)和AEC(329.4×10⁶,368.6×10⁶,431.3×10⁶和453.4×10⁶ L^-1;趋势检验P=0.009)的水平也呈显著的增高趋势。同时,PFOS浓度与哮喘的严重程度也呈显著的正相关关系(哮喘严重程度评分:3.33,4.18,4.49,4.57;趋势检验P=0.045),但PFOS对哮喘的控制无显著影响。结论 PFOS暴露与哮喘免疫标记物存在显著的相关关系,表明PFOS可能与儿童哮喘的发生及流行存在一定的相关性。
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  T2.2 东苕溪流域上游地区典型农田土壤滞留功能风险评价

  卜元卿;单正军;李振高;陈源;智勇;

  2013, 27(S1): 26-27.

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  越来越多的毒性物质在土壤中积累, 可能通过食物链污染粮食和蔬菜, 或对生态系统产生潜在影响, 甚至土壤污染物也可能通过淋溶、渗漏等方式对地下水及水生生态系统造成威胁。污水灌溉、农药施用导致的农田土壤重金属、农药残留分析和行为特征研究较多, 但针对土壤中各种污染物积累的综合效应及生态风险研究则较少。污染土壤对水生环境影响的研究被称为土壤滞留功能评价, 是土壤生态风险评价工作的重要组成部分。快速筛选和评价生态毒性的生物学方法包括SOS/umu荧光检测实验和Ames实验,与化学分析相比生物学方法更为简单快速,测试结果更为直观。东苕溪上游地区都以高密集型畜禽、水产养殖、种植业为主, 大量含有抗生素、激素、重金属等的养殖废水通过灌溉方式进入农田; 农业种植使用的化肥、农药也不断在农田土壤中累积,导致东苕溪农田土壤可能存在各类物质的复合污染。本研究通过SOS/umu实验和Ames实验对东苕溪流域上游典型区的菜园土、水稻土、竹林土壤样品滞留功能进行评价, 结果显示, 菜园土土壤样品的急性生态毒性、潜在生态和遗传毒性研究结果均为阳性; 水稻土土壤样品的急性生态毒性为阴性, 潜在生态和遗传毒性研究结果为阳性,竹林土壤样品的急性生态毒性、潜在生态和遗传毒性研究结果均为阴性, 说明菜园土土壤、水稻土壤部分滞留功能已受到破坏, 可能对地下水和水生生态系统造成潜在威胁。
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  T2.3 Developing a conceptual model and conducting a preliminary risk assessment for a former chemical manufacturing site in Nanjing City, China

  Ralph G. STAHL Jr;YE Shu-jun;MA Jun;Nancy GROSSO;E Erin MACK;Jennifer WANG;Calvin CHIEN;REN Li-jing

  2013, 27(S1): 27-27.

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  Recently DuPont, Nanjing University and BCEG began collaborative work at a former chemical manufacturing site in Nanjing City, China. The goal was to use this as a pilot ortest site to conduct a remediation project. The relatively small former chemical manufacturing site is located adjacent to other chemical manufacturing operations, roadways, a housing development, and community vegetable gardens. Since the project began, old buildings have been razed, several phases of soil and groundwater sampling have been completed, and that work has provided data sufficient to build apreliminary conceptual model and to conduct a screening-level human health risk assessment. While contamination in surficial and sub-surface soils appears to be relatively limited, some contaminants have been found in groundwater samples. Some of the contaminants in groundwater are found at levels above risk-based screening levels suggesting the need for additional investigation to identify source material and understand fate and transport within the subsurface soil and groundwater. In addition, further sampling is underway in the small community gardens to determine if vegetables are being grown in contaminated soil. These current data indicate there will likely be a need to evaluate remedial options that will prevent migration of contaminants through the subsurface, and which will mitigate potential human exposures to contaminants. In this presentation we will discuss the development of the conceptual model, initial results of the risk assessment, and steps to begin evaluating potential remedial options.
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  T2.4 PI3K/Akt与Nrf2-ARE通路对低剂量HBCD诱导的细胞增殖及氧化应激效应的调控作用

  邹文;陈岑;钟玉芳;安静

  2013, 27(S1): 27-28.

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  目的 本研究将明确低剂量六溴环十二烷(HBCD)暴露的生物效应,以PI3K/Akt通路与Nrf2-ARE通路为主线研究低剂量HBCD对细胞增殖及氧化应激的调控机制,并进一步探索PI3K/Akt与Nrf2-ARE通路在功能上的相互作用。方法 以细胞生长及氧化应激效应为切入点,以正常人胚肝细胞(L02)为研究对象,将L02细胞暴露于低剂量HBCD(1×10^-7~1×10^-11 μmol·L^-1)中,研究低剂量HBCD对细胞增殖的影响;通过免疫印迹检测关键信号分子的表达及磷酸化水平,辅以免疫荧光与EMSA实验对Nrf2的核转位及其转录活性进行检测,并进一步利用RNA干扰与PI3K抑制剂研究低剂量HBCD对细胞增殖及氧化应激的调控机制。结果 低剂量HBCD可以刺激L02细胞的生长,诱导细胞中活性氧自由基(ROS)水平的升高,同时促进细胞增殖核抗原(PCNA)高表达。HBCD可以通过PI3K靶基因Akt蛋白上Ser⁴⁷³位点的磷酸化作用激活PI3K/Akt信号通路,调控Nrf2-ARE抗氧化通路的激活,主要表现在Nrf2表达升高并促进核转位,进而诱导ARE介导的下游抗氧化蛋白HO-1的表达,在此过程中,ROS作为第二信使起着重要的调控作用。本结果还表明,细胞经低剂量HBCD(≤1 nmol·L^-1)预染毒之后可以明显减缓后期高剂量HBCD(≥20 μmol·L^-1)诱导的细胞死亡、氧化应激效应与DNA损伤。结论 低剂量HBCD很可能通过激活PI3K/Akt信号通路与核转录因子Nrf2启动L02细胞的抗氧化保护作用,从而维持胞内氧化还原自稳态以保证自身的生长及增殖。另一方面,HBCD慢性低剂量暴露会通过氧化应激效应介导PI3K/Akt与Nrf2-ARE通路的持续的、微弱的上调,可能使正常肝细胞持续异常增殖,从而导致/促进肿瘤的发生与发展。
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  T2.5 三峡库区水环境微囊藻毒素污染的人群肝损伤/肝癌风险及相关机制

  舒为群;陈济安;蒲朝文;赵清;邱志群;张仁平;许川;李砚

  2013, 27(S1): 28-28.

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  三峡水库是世界上最大的半封闭性水体,库区人口达3000万。研究显示,库区内长江干流水及城市自来水的微囊藻毒素(MC)尚在WHO及国标限值1.0 μg·L^-1以内,但部分乡镇的饮用水源及其生长的鱼、鸭体内有较高的MC持续检出(最高达4.0 μg·L^-1)。基于1441名儿童的横断面调查显示,污染乡镇儿童每日MC的摄入量达2.03 μg(远高于WHO关于10 kg儿童每日摄入0.4 μg的限值),儿童血清MC检出率达91.9%,平均检出浓度为1.3±0.2 μg·L^-1。儿童血清肝损伤酶学指标异常率达10.8%,显著高于水源未受MC污染的儿童(5.9%)。在MC暴露儿童中,代谢酶GSTT1(-)是肝损伤的易感基因型;GSTM1(-)/GSTT1(-) 交互作用会增加发生肝损伤的危险性。微囊藻毒素污染乡镇人群肿瘤和肝癌粗死亡率分别为水源无MC污染人群的3.54倍和4.74倍。实验室研究显示,氧化损伤是MC致肝损伤乃至肝癌的重要机制,抗氧化剂EGCG可以调节抗氧化蛋白Nrf2/ARE的表达和核转位来减弱MC的肝毒性效应。进一步的现场流行病学以及实验室机制研究正在进行中。
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  T2.14 低浓度饮水型砷暴露对人群外周血血细胞参数影响的分析

  马彩凤;云奋;李云云;苗艳玲;田凤洁;吕懿;秦秀军;安全;刘力;闻建华;马宁;裴秋玲

  2013, 27(S1): 33-33.

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  目的 分析低浓度砷暴露对人群外周血血细胞的影响,为筛选低浓度砷暴露的早期损伤指标提供依据。材料和方法 选择相邻经济发展均衡的山西地砷病区和非地砷病区2个自然村,饮水年限15年以上本地居民,无传染性、遗传性等疾病,无放射线和理化致病因素接触史156人为调查对象。其中地砷病区85名为病例组,非地砷病区71名为对照组。平衡病例组和对照组年龄、性别、吸烟、饮酒、偏食等因素的影响。用全自动血细胞分析仪分析测定人群血细胞参数的变化。结果 砷暴露组WBC(白细胞)、GRA(中性粒细胞绝对值)、GRA%(中性粒细胞百分比)、LYM(淋巴细胞绝对值)和LYM%(淋巴细胞百分比)与对照组比较,均有升高趋势,其中LYM和LYM%的增加有统计学意义(P均<0.05)。砷暴露组与对照组相比,RBC(红细胞)、HGB(血红蛋白)、MCH(平均血红蛋白含量)、MCHC(平均血红蛋白浓度)和RDW(红细胞体积分布宽度)有升高的趋势,且差异均有统计学意义(P均<0.05);MCV(平均红细胞体积)呈下降趋势,且差异有统计学意义(P<0.05)。砷暴露组与对照组相比,PLT(血小板)、MPV(平均血小板体积)和PCT(血小板压积)有明显的下降趋势,且差异均有统计学意义(P<0.05);PDW(血小板分布宽度)有明显的升高趋势,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 长期低浓度砷暴露人群外周血血细胞参数的改变具有双向性和不均一性。白细胞和红细胞代偿性增加,血红蛋白浓度升高,血小板数目明显减少;血小板和红细胞体积异质性增加。血液常规检查可作为砷中毒的早期损伤指标。
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  T2.15 外来体介导的miR-21在食管癌细胞中的生物学功能

  廖娟;刘冉;尹立红;石亚娟

  2013, 27(S1): 33-34.

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  目的 探讨食管癌细胞分泌的外来体(exosome)介导的microRNA 21(miR-21)在食管癌细胞中的生物学功能。材料和方法 DiI染料荧光标记食管癌细胞株EC9706培养上清来源的exosome,应用UltraVIEWVox活细胞实时成像技术分析DiI标记的exosome能否进入活细胞及其在细胞内的运动轨迹;Cy3标记的miR-21 mimic瞬时转染作为供体细胞的EC9706,转染12 h后用PBS清洗供体细胞以除去多余的mimics和转染试剂并更换新鲜培养基继续培养,培养24 h后收集供体细胞培养上清,离心以除去残留的细胞后将其加入已处于对数生长期的受体细胞EC9706中分别继续培养3, 6, 24 h,转移效率通过流式细胞仪获得荧光细胞的百分比计数,采用实时RT-PCR技术检测受体细胞及其培养上清中miR-21的表达水平;食管癌细胞株EC9706瞬时转染miR-21 mimic使其过表达miR-21,应用细胞增殖实验(EDU法)、流式细胞技术(Annexin-Ⅴ标记)、Transwell细胞体外迁移和侵袭实验来检测过表达miR-21对食管癌细胞EC9706增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响,并用Western blot免疫印迹技术检测上调miR-21后,食管癌细胞株PTEN表达的变化。结果 活细胞实时成像技术显示exosome可以通过细胞膜进入到活细胞内;含有exosome的培养上清中Cy3标记的miR-21 mimic在3, 6, 24 h时转移到受体细胞的效率分别为60.3%, 82.6%和85.0%,实时RT-PCR检测结果显示在各时间点转染组miR-21的表达水平均高于对照组,在受体细胞中平均倍数变化分别为1.49,1.41,2.08,可见培养6 h后大部分exosome来源的mimic-miR-21被转移进入受体细胞。过表达miR-21后EC9706细胞增殖能力提高、凋亡细胞数减少,与对照组相比差别具有统计学意义(P<0.05),转染组细胞的迁移和侵袭能力均明显高于对照组(P均<0.05),Western印迹实验显示,过表达miR-21后食管癌细胞株PTEN表达明显减少,转染组表达水平为对照组的0.59倍,提示PTEN可能是miR-21参与食管癌发生、发展的靶标之一。上述结果表明miR-21可以通过exosome携带进入受体细胞,进而促进食管癌细胞的增殖、抑制其凋亡,增加其体外迁移和侵袭能力。结论 exosome介导的miR-21可能通过细胞间通讯参与了食管癌的发生发展,这一机制的发现补充了传统的细胞间通讯理论,丰富了细胞间调控网络。
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  T2.16 亚硫酸钠经由坏死途径诱导人正常肝细胞株HL-7702死亡

  白剑英;黄勤;闫丹丹;王幼萍;梁瑞峰

  2013, 27(S1): 34-34.

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  目的 探讨亚硫酸盐可能的死亡诱导机制。方法 以终浓度为10, 2.5, 0.5, 0.1 mmol·L^-1的Na₂SO₃处理HL-7702细胞24和48 h,采用Western blot法检测肝细胞内Rip1, 胱天蛋白酶3, p53, Bcl-2和Mdm2的蛋白表达水平。结果 ① Na₂SO₃ 10, 2.5, 0.5, 0.1 mmol·L^-1可引起HL-7702细胞中程序性坏死相关蛋白Rip1表达明显增加,且有一定的剂量反应趋势。而凋亡效应诱导相关蛋白胱天蛋白酶3总量表达无明显变化,且未见胱天蛋白酶3裂解条带,即胱天蛋白酶3活化形式。② 不同浓度亚硫酸钠引起肝细胞内抑癌基因p53蛋白表达明显降低, 而癌基因蛋白Bcl-2和Mdm2蛋白基本无变化。结论 亚硫酸钠可能通过程序性坏死途径诱导人正常肝细胞死亡而不是通过凋亡途径。亚硫酸钠对抑癌基因蛋白p53蛋白表达的抑制作用可能增加细胞发生癌变的可能性。
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  T2.17 全氟丁基磺酸钾对小麦和水稻的毒理学作用

  杨帆;陈晓倩;杨婧;杨和行;殷浩文

  2013, 27(S1): 34-35.

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  研究全氟丁基磺酸钾(PFBSK)对小麦和水稻的毒理学作用。采用OECD标准实验方法测试该物质对两种植物幼苗暴露及生长的影响。结果 表明,对于小麦来说,PFBSK对其出苗及幼苗生长影响显著,最高浓度组对出苗抑制率达到87.5%,鲜重抑制率达到91.9%,小麦出苗终点的LC₅₀值为56.45 mg·kg^-1(95%置信区间:46.68~66.54 mg·kg^-1),鲜重终点的EC₅₀值为45.09 mg·kg^-1(95%置信区间:32.66~56.02 mg·kg^-1)。相比之下,样品对水稻影响较小,最高浓度组对出苗抑制率只有5.5%,对鲜重抑制率也仅达到26.3%。水稻出苗终点的LC₅₀值和鲜重终点的EC₅₀均大于100 mg·kg^-1。通过对PFBSK理化特性和环境存在浓度调查可知,造成如此差异的原因主要可能源于两种植物本身对该物质的敏感程度不同或样品造成了培养基质理化性状的改变,从而影响了植物生长。一般情况下,该物质浓度背景值较低,性质稳定,对植物的影响较小。
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  T2.18 全氟磺酸类化合物在氧化铁表面的吸附行为机制

  冯鸿儒;蔺远;孙玉贞;曹慧明;傅建捷;张爱茜

  2013, 27(S1): 35-35.

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  目的 了解全氟磺酸类化合物在氧化铁表面吸附行为的分子机制对了解该化合物的环境过程并进行有效的污染控制十分必要。方法 以真实环境下的水-氧化铁界面结构为基础,构建包含水、全氟磺酸类化合物和氧化铁表面的界面体系,综合利用分子动力学模拟和量子化学计算的手段,研究全氟磺酸类化合物在氧化铁表面的吸附机制,确定全氟磺酸类化合物与氧化铁表面的作用方式和其吸附形态。结果与结论 在模拟条件下,碳链长度分别由四碳到八碳的全氟磺酸类化合物均在4 ns后吸附到氧化铁表面,在之后1 ns平衡振荡中未观测到明显脱附。与脂肪酸(月桂酸)的垂直于氧化铁表面的吸附方式不同,全氟磺酸类化合物倾向于以碳链平行于表面的方式进行吸附。吸附结果显示在较低浓度下,全氟磺酸类化合物吸附未达到氧化铁的单层饱和覆盖度时,其倾向于以长轴平行于氧化铁表面的吸附方式,且主要依靠全氟磺酸类化合物中的F原子与羟基化氧化铁表面的H原子之间形成氢键作用而相互结合。分析不同链长全氟磺酸类化合物在垂直于氧化铁表面的位移大小和氢键作用的强弱,总体上呈现出随着碳链增长,吸附作用增强的趋势,F-H氢键的数量增加是导致其吸附性能上升的因素之一。而全氟丁基磺酸在动力学模拟中垂直方向上的位移明显小于全氟戊基磺酸及全氟己基磺酸的位移,究其原因可能源自四碳链全氟磺酸类化合物体积小,受到与周围水分子形成的F-H氢键影响较小,而碳链长度短,直线构型不易发生变化,在表面上容易调整为能量较低的平行表面的吸附模式。
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  T2.68 燃煤PM_2.5不同组分对人脐静脉内皮细胞EA.hy926的氧化损伤效应

  王菲菲;王先良;丁明玉;刘芳盈;吕占禄;钱岩;朋玲龙;

  2013, 27(S1): 61-62.

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  目的 了解PM_2.5在心血管系统损伤中的毒性机制及主要影响组分。方法 实验选择人脐静脉内皮细胞株EA.hy926作为研究细胞,EA.hy926是人脐静脉内皮细胞和A549融合的细胞株,是目前内皮功能体外研究中最为认可的细胞株。燃煤PM_2.5不同组分EA.hy926进行浓度梯度染毒后,采用试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及丙二醛(MDA)指标。结果 燃煤PM_2.5各组分对EA.hy926细胞染毒24 h后,随着染毒剂量的增加,细胞上清液中SOD活力均下降,与对照组相比差异显著,而相同剂量组比较,其抑制SOD活力能力依次为:有机组分>无机组分>全颗粒物,且相同剂量组不同组分间的比较均有统计学差异;GSH-Px活力分别下降,具有剂量依赖性,引起GSH-Px活力下降程度基本具有无机组分>有机组分>全颗粒物的趋势,但统计学意义不显著;MDA含量分别有不同程度的增加,各组分所致的MDA含量大小存在低剂量组有机组分>全颗粒物>无机组分,高剂量组全颗粒物>无机组分>有机组分趋势,随着剂量增加,全颗粒物和无机组分引起MDA含量明显增加,而有机组分则变化趋于平缓。结论 可见,燃煤PM_2.5不同组分均可对血管内皮细胞EA.hy926产生氧化损伤效应。
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  T2.69 Cr(Ⅵ)对16HBE细胞的基因毒性效应及表观遗传改变

  夏菠;杨淋清;黄海燕;袁建辉;洪文旭;杨细飞;吴德生;刘建军;庄志雄

  2013, 27(S1): 62-62.

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  目的 分析六价铬[Cr(Ⅵ)]对支气管上皮细胞的毒性效应,包括遗传毒性和表观遗传效应,并探讨了表观遗传效应在其中所起的作用。方法 16HBE细胞的生物学特征研究、细胞毒性及氧化损伤的检测;16HBE细胞的凋亡和周期变化的检测;整体基因组DNA甲基化的检测;组蛋白乙酰化水平的检测;组蛋白生物素化水平的检测。结果 研究结果表明,[Cr(Ⅵ)]对16HBE细胞的损伤主要是由于其进入细胞后进行的一系列还原反应所产生的ROS,以及[Cr(Ⅵ)]代谢物与DNA形成DNA-结合物所造成的。16HBE受到损伤后,主要在细胞周期的S期停止并进行修复。另外,从表观遗传的研究结果可知,低剂量的[Cr(Ⅵ)]可以降低16HBE细胞的整体甲基化水平,使得细胞的染色质稳定性下降,以及基因印记丢失。而对于一种新近发现的组蛋白修饰-组蛋白生物素化的研究表明,[Cr(Ⅵ)]诱导了细胞整体组蛋白生物素化水平的提高,并且其对组蛋白生物素化的影响与其对细胞凋亡的影响效果是一致的,说明组蛋白生物素化可能参与了细胞凋亡的调节。结论 [Cr(Ⅵ)]暴露对细胞的损伤主要是因为其在细胞内发生一系列还原反应导致过量自由基产生,而其代谢产物与DNA形成加合物导致的损伤所占比例不大。[Cr(Ⅵ)]可以提高组蛋白生物化的水平,低剂量[Cr(Ⅵ)]可降低细胞的整体甲基化水平。[Cr(Ⅵ)]对16HBE细胞的损伤是其基因毒性以及表观遗传毒性相结合的结果。
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  T3.55 高通量体内Pig-a基因突变方法检测二甲基肼的遗传毒性

  蒲江;谭小燕;张海洲;王欣;耿兴超;李波;黄芝瑛;王雪

  2013, 27(S1): 96-97.

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  目的 建立高通量体内Pig-a基因突变试验方法,并采用该方法研究二甲基肼(DMH)的遗传毒性。方法 将16只5周龄雄性SD大鼠随机分为阴性对照、DMH低剂量、DMH高剂量和阳性对照组,阴性对照组ig给予灭菌注射用水,DMH组分别ig给予20和60 mg·kg^-1 DMH溶液(连续3 d),阳性对照组ip给予100 mg·kg^-1乙基亚硝基脲(ENU)(连续3 d)。给药前和末次给药后第7, 14和28 d尾静脉采血,取80 μl用淋巴细胞分离液处理得到高纯网织红细胞(RETs)和成熟红细胞(RBCs)液,孵育Anti-CD59-phycoerythrin和Anti-CD61-phycoerythrin抗体,再标记Anti-PE-Microbeads(抗PE顺磁微珠),定量稀释至1000 μl。准确量取15μl红细胞稀释液,用核酸染料(SYTO13-Fluorescein Isothiocyanate)和计数微球混合液稀释至1500 μl(柱前样本),用于流式分析,计算N_{Total RETs}/N_柱前Beads和N_{Total RBCs}/N_柱前Beads值;剩余985 μl红细胞液采用免疫磁性柱(LS columns)浓缩,得到高浓度突变型红细胞液,离心,用核酸染料和计数微球混合液稀释至300 μl(柱后样本),流式分析得到计数微球(N_柱后Beads)、突变型RETs(N_{Mutational RETs})和突变型RBCs(N_{Mutational RBCs})数量。根据公式m=N_{Mutational RETs or RBCs}/N_{Total RETs or RBCs}×N_柱后Beads/N_柱前Beads)×100%,计算RETs和RBCs的突变率(m),所得数据采用Wilcoxon秩和检验进行统计分析。结果 本高通量法分析RETs和RBCs数目分别高达3.11×10⁷个和8.01×10⁸个,空白组动物背景值范围mRETs为0.56×10^-6~7.83×10^-6,mRBCs为0.35×10^-6~6.86×10^-6,且每个样本流式总检测时间缩短至8 min。给药后第7 d时,阴性组mRETs为5.74×10^-6,DMH低、高剂量组分别为3.23×10^-6和4.82×10^-6,阳性组为1.50×10^-4,阳性组是阴性组的26.1倍;阴性组mRBCs为2.61×10^-6,DMH低、高剂量组分别为1.33×10^-6和2.81×10^-6,阳性组为1.18×10^-5,阳性组是阴性组的4.5倍。给药后第14 d时,阴性组mRETs为4.15×10^-6,DMH低、高剂量组分别为0.87×10^-6和0.74×10^-6,阳性组为5.70×10^-4,阳性组是阴性组的137.3倍;阴性组mRBCs为2.68×10^-6,DMH低、高剂量组分别为2.25×10^-6和3.33×10^-6,阳性组为4.06×10^-5,阳性组是阴性组的15.1倍。给药后第28 d时,阴性组mRETs为3.36×10^-6,DMH低、高剂量组分别为2.54×10^-6和1.56×10^-6,阳性组3只动物死亡,剩余1只动物mRETs为1.75×10^-5,是阴性组的5.2倍;阴性组mRBCs为1.81×10^-6,DMH低、高剂量组分别为2.25×10^-6和3.90×10^-6,阳性组为1.64×10^-4,阳性组是阴性组的90.7倍。结论 成功建立了高通量体内Pig-a基因突变检测方法。与阴性组相比,阳性组RETs和RBCs Pig-a基因突变率随时间呈明显上升趋势(P<0.05)。在设计剂量范围内,DMH低、高剂量组与阴性对照相比Pig-a基因突变率无明显变化。在本实验条件下,经口给予大鼠DMH未引起Pig-a基因突变率上升。
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  T3.66 浅淡中药毒性反应预防对策

  冯晓妍;吴敏

  2013, 27(S1): 102-103.

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  中药毒性反应是指药物由于用药剂量过大,或用药时间过长,或某些病人对某些药物特别敏感(相对剂量过大)所产生的严重功能紊乱或病理损害。由于人们对中药毒性反应认识的不足,从而影响了中药的正确使用,现将对中药常见毒性反应预防对策探讨如下。1. 依法炮制中药: 中药的炮制及煎服方法是影响中医疗效不可忽视的方面,要提高疗效、防止中药毒副作用的发生,必须严格遵循《中国药典》的炮制规范及传统的炮制方法,把好炮制关,做到未炮制和炮制不规范的中药,不得在临床使用,这是保证中药质量的重要环节,同时,要重视中药的煎服方法,医师、药师要根据患者的病情,药物的性质,详细告诉患者药物的煎服方法,这是医药工作者应具有的良好职业道德,也体现了对病人的责任心。2. 遵守配伍准则: 中药配伍在于增加疗效和降低毒副作用。如半夏畏生姜,即生姜可抑制半夏的毒性和烈性;药理研究证明附子、干姜、甘草组成的四逆汤其毒性大大低于附子单用。对一些有毒性的中草药,常配伍甘草来缓和毒性,现已证明,甘草中所含甘草甜素在药理上确有解毒作用,证实了《本草纲目》上记载甘草解百药毒的正确结论。3. 用量要严格掌握: 中药的使用存在个体差异,剂量大小,因人而异,一般应结合病人具体情况,要以《中国药典》和专业药学书籍记载的用量为准,宜从小剂量开始,渐加至较大剂量,并且中病即止,不可过服。当病情需要使用一些有毒的中草药时,应注意剂量准确,延长煎熬时间,服用时严密观察,老幼体弱者剂量要轻。4. 切禁滥用补药: 俗话说:"凡药三分毒",补益药也是药,绝不能乱服乱补,否则会造成中毒。如人参大补元气,适用于气虚体弱者,实热症和体壮者服了,不但无益反而有害,如果长期服用可导致失眠,血压升高,超量服用可出现玫瑰疹、瘙痒、头痛、眩晕、体温升高等,出血是人参急性中毒的特征。5. 过敏体质慎重用药: 某些中药虽对一般人无毒性反应,但对过敏性体质服用少量即可导致过敏等副作用,这就要求临床医生诊病时,要询问清患者的过敏史,并要留心观察患者用药后的反应,出现问题要认真分析,不能凭药物无毒便认为与药物无关,要尽可能经过筛选,找出致敏药物,并让病人牢记以防今后服用中药时发生过敏等副作用。6. 健全中药管理制度: 中药毒性反应的原因是复杂多样的,要预防中药毒性反应的发生,需要与中药有关的产、供、销、使用、管理等多个部门通力配合,认真学习贯彻执行国家中药管理方面的法律法规,提高中医药人员的整体素质,增强对中药毒性反应危害性的认识,从而提高中医中药疗效,促进中药事业健康发展。
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  T3.67 Wistar大鼠2年喂养生存、体质量及进食量的观察与分析

  肖成荣;谭洪玲;马增春;王宇光;梁乾德;宁志强;高月

  2013, 27(S1): 103-103.

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  目的 Wistar大鼠2年喂养对其生存、体质量及进食量进行观察与分析。方法 Wistar大鼠,连续观察2年,观察动物肿瘤发生及生存情况,每周测定体质量、进食量。结果 雄性大鼠死亡率、死亡动物平均活存时间具有高于雌性大鼠的趋势,雌性大鼠的自发性肿瘤发生率较雄性大鼠的自发性肿瘤发生率略高,并且存在同一只动物多处器官发生肿瘤的现象。实验期间两种性别大鼠进食量与进水量无明显变化趋势,体重在试验早期持续增长,在实验中晚期达到峰值,此后略有下降。日摄食量与体质量百分比在试验早期呈下降趋势,在实验中晚期达到极小值后略有回升。结论 建立了本实验室的相关正常值参考范围,为建立和开展新药的啮齿类动物致癌性实验评价提供可以借鉴的经验和教训。
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  T2.75 Toxicological effects of carbosulfan on earthworm, Eisenia fetida

  GAO Hang;ZOU Pin-tian;MA Jin-na;MA Tao-jun;ZHANG Xiao-yan

  2013, 27(S1): 65-65.

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  OBJECTIVE To evaluate the acute toxicity of Carbosulfan to earthworm, Eisenia fetida in the artificial soil over a 14 d exposure period. METHODS Earthworms, Eisenia fetida used in this study and fed with the cattle manure once a week were raised at 20±2℃ under the continuous light condition. Toxicity test was conducted at the same condition as breeding condition. Five series of concentrations with 50.00, 75.00, 112.50, 168.75 and 253.13 mg·kg^-1, dry weight, which wereprepared by adding the solution of the test substance into the artificial soil directly. The artificial soil for culture was prepared by mixing sphagnum peat: kaolin clay: air-dried quartz sand (1:2:7) with moisture content was adjusted as about 35% and pH was adjusted to 6.0±0.5. Test animals with 300-600 mg of body weight (wet mass) were selected. Four replicates for each treated group were carried out and ten earthworms were used in each replicate. During the 14 d exposure, the mortality was assessed and symptoms of intoxication and distinct changes in behavior were also recorded at day 7 and 14. LC₅₀ (50% lethal concentration) and its 95% confidence limits were estimated using probit analysis program. RESULTS During the test,it turns out that the environmental conditions which contain temperature, relative humidity and light intensity had all met the requirements in 14 d exposure. In this study, there was no lethal organism in the control group so that this test could be regarded to meet the condition for the validity of the test. Carbosulfan induced death of test organisms was in a dose-dependent manner. At day 14 the highest concentration causing no mortality was zero, and the lowest concentration causing 100 percent mortality was 253.13 mg·kg^-1, dry weight, respectively. Meanwhile, the adverse reactions in the live earthworms became much more obvious along with the concentration became higher, and the exposure time was extended. The main pathological symptoms and changes in behavior were as follows: the earthworm body became crimped, shorter, twist, adherence, and clitellum swelling, and moving slowly, and broken into sections. CONCLUSION With exposure to test substance Carbosulfan, the LC₅₀-7 d was determined as 140.961 mg·kg^-1, dry weight, and the LC₅₀-14 d was 103.353 mg·kg^-1, dry weight, the 95% confidence limits were 119.187-172.092 mg·kg^-1, dry weight, and 88.534-119.780 mg·kg^-1, dry weight, respectively.
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  T14.27 1-甲基芘诱发V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞遗传毒作用

  姜浩;赖演媚;刘云岗

  2013, 27(S1): 283-283.

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  目的 进一步揭示1-甲醇基芘(1-MP)的代谢活化机制和遗传毒作用特征。方法 采用稳定表达人CYP2E1和人硫酸基转移酶(SULT)1A1的V79细胞系(V79-hCYP2E1-hSULT1A1),探讨1-MP和1-HMP的细胞毒(MTT法)作用、致突变(Hprt位点)作用和诱发细胞微核的效应,并观察相应酶抑制剂对上述效应的影响。结果 二受试物对缺乏生物转化酶的V79对照细胞均无任何毒作用,而对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞均呈现浓度依赖性效应;其中1-MP诱发细胞毒、致突变和诱发微核作用的阈浓度分别为100, 5和10 μmol·L^-1,1-HMP各项作用的阈浓度则为8,1和2 μmol·L^-1。二者诱发微核的作用均伴随明显的多核细胞形成,提示有微管毒作用。CYP和SULT1的抑制剂(分别为1-氨基苯三唑(ABT)和五氯酚(PCP))均可完全抑制1-MP诱发的细胞毒及致突变作用,1-HMP的作用也受PCP抑制,但不受ABT影响。对于1-MP诱发微核的效应,ABT和PCP都呈浓度依赖性抑制效应,但不是完全抑制;而同时采用两种抑制剂(较低浓度)则明显提高抑制率。PCP也能抑制1-HMP诱发微核、多核的作用。结论 本研究证实人类CYP2E1与SULT1A1可协同作用以活化1-MP,使其在不呈现细胞毒性的较低浓度即具有强烈的致突变与染色体畸变作用。1-HMP可能为这个代谢活化过程的中间产物,而其终末致突变物则为后者的硫酸基结合物(后者因自发异裂作用而形成亲电子性的苯甲基正碳离子)。
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  T7.26 2,5-己二酮诱导PC12细胞凋亡及其毒作用机制

  刘爽;郑小美;朴丰源;王哲敏;陈若霖;董伟;戚媛;李双月

  2013, 27(S1): 196-196.

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  目的 观察2,5-己二酮(2,5-HD) 暴露对PC12细胞凋亡的影响和探讨其毒作用机制。方法 将大鼠PC12细胞体外暴露于2,5-HD 10, 20和40 mmol·L^-1,暴露时间为12, 24和36 h。用Hoechst 33342荧光染色观察染毒后细胞核的变化;用流式细胞仪(FITC-AnnexinⅤ/PI双染)对染毒后的凋亡百分率进行定量分析;用透射电子显微镜观察凋亡细胞的超微结构;用real time-PCR检测Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3的mRNA表达;用Western blot分析Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3的蛋白表达。结果 ① Hoechst 33342荧光染色观察:对照组细胞呈现均一亮度的蓝色荧光;而各2,5-HD暴露组出现个别PC12细胞荧光亮度较强,细胞核高度皱缩,甚至分叶的现象。② 流式细胞仪检测凋亡百分率:2,5-HD暴露36 h后,与对照组(5.84%)相比,2,5-HD 10, 20和40 mmol·L^-1染毒组凋亡百分率分别为9.89%,10.15%和16.42%,显著高于对照组(P<0.05);在2,5-HD 40 mmol·L^-1染毒组,与12 h(9.49%)染毒时间相比,24和36 h 2,5-HD染毒的PC12细胞凋亡百分率(10.36%和16.42%)显著增高(P<0.05)。③ 透射电镜观察:透射电镜观察发现,2,5-HD暴露PC12细胞出现胞体皱缩、胞浆空泡变性、染色质边缘化及细胞器解体等现象,细胞损伤程度与2,5-HD浓度和暴露时间呈正相关。④ Real time-PCR分析: PC12细胞暴露2,5-HD 36 h后,与对照组相比,Bcl-2的mRNA表达随着2,5-HD浓度增高而显著降低(P<0.05),呈现剂量依赖关系;Bax的mRNA表达随着2,5-HD浓度增高而显著增高(P<0.05),呈现剂量依赖关系;2,5-HD 20和40 mmol·L^-1组PC12细胞中胱天蛋白酶3的mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)。5 Western blot分析:2,5-HD暴露36 h后,20和40 mmol·L^-1组Bcl-2的蛋白表达显著低于对照组(P<0.05),而Bax和胱天蛋白酶3的蛋白表达显著高于对照组(P<0.05),并呈现剂量依赖关系。在2,5-HD 40 mmol·L^-1组,与12 h暴露相比,24和36 h暴露的PC12细胞Bcl-2的蛋白表达显著降低(P<0.05),而Bax和胱天蛋白酶3的蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论 2,5-己二酮可引起大鼠PC12细胞凋亡;其机制可能是通过抑制Bcl-2/Bax的信号通路而发挥毒作用。
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  T7.32 大鼠同伴和单独饲养对青年期焦虑样和抑郁样行为的影响

  陈凌红;;周文华;

  2013, 27(S1): 199-200.

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  目的 探索大鼠青春期同伴和单独饲养对青年期焦虑样和抑郁样行为的影响。方法 14只出生20 d的清洁级雄性SD大鼠,随机分成2组,第一组独笼饲养(n=6),第二组大鼠成双饲养(n=8),饲养笼大小为42 cm×26.5 cm×20 cm,两组的饲养条件相同,饲养40 d后,测试糖水偏好、强迫游泳和高架迷宫实验,分别计算两组大鼠的糖水消耗百分比、不动时间百分比和进入开放臂时间百分比。统计分析采用正态性检验和两独立样本t检验。结果 糖水偏好实验中,两组大鼠的糖水消耗平均百分比分别为(96.07±0.49)%和(91.73±2.53)%,差异无统计学意义(P>0.05);强迫游泳实验,两组大鼠的不动时间平均百分比分别为(41.38±5.25)%和(21.25±4.23)%,成双饲养大鼠不动时间百分比明显减低,差异具有统计学意义(P<0.05);高架迷宫实验中两组大鼠进入开放臂时间平均百分比为(45.11±5.89)%和(16.48±4.94)%,成双饲养大鼠进入开放臂时间明显缩短,差异具有统计学意义(P<0.01)。此外,高架迷宫的实验数据显示每笼双养大鼠均表现两极分布,分别就每组较高和较低数值分析,大鼠进入开放臂平均时间分别为(29.19±2.14)%和(3.78±1.21)%,差异有统计学意义(P<0.01),而较高数值大鼠与单独饲养大鼠进入开放臂的时间百分比也有差异但无统计学意义(P=0.068);对于糖水偏好和强迫游泳实验数据没有表现出相对强势和弱势的差别。结论 青春期单独饲养的大鼠,由于长期处于孤独和应激状态,更容易表现出抑郁样症状,而对自然奖赏和焦虑样行为没有影响;同伴饲养的大鼠不易表现抑郁样症状,但更容易出现焦虑症状;青春期双养的大鼠由于对领地的统治权竞争,长期饲养同伴之间可能产生等级性,双养大鼠中相对弱势者表现出明显的焦虑样症状,而强势大鼠相反不表现出焦虑样行为。因此,本结果显示青春期孤立环境大鼠更容易出现抑郁样行为,而同伴饲养环境由于竞争压力相对弱势动物更容易表现为焦虑样行为。
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  T6.31 应对突发氰化物泄漏事故医学救援对策

  吴敏;冯晓妍

  2013, 27(S1): 174-174.

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  目的 突发氰化物泄漏灾害性事故能够在短时间内造成大批人员伤亡,给人的生命安全和社会经济带来巨大的损失,作为军队的卫生工作者,不仅要掌握战时化学武器损伤的防治技术和救治的组织工作,亦应熟悉和掌握和平建设时期突发化学公共事件所致损伤的防治技术和救援的对策。方法 通过对氰化物的理化性质、中毒途径、中毒机制的阐述,氰化物中毒者不同临床表现的分析,介绍了近年来我国国内发生氰化物泄漏事故的现状及危害,着重论述了在不同情况下,对各类氰化物泄漏事故提出相应的医学救援处置对策。结果 1、救援人员的个体防护 若怀疑救援现场存在氰化物,救援人员应当穿连衣式橡胶防毒衣、戴橡胶耐油手套;呼吸道防护应使用防毒面具或自吸过滤式防毒面具。2、病人现场救护原则 对氰化物急性中毒者应立即进行现场急救,分秒必争。对中毒者立即戴上防毒面具,防止继续吸收并立即对中毒者现场注射抗氰自动急救针一支进行急救后,送离染毒区进行后续治疗。 3、氰化物水上泄漏的应急处理原则,包括现场控制与警戒、环境清理、水质检测等。 4、氰化物陆上泄漏的应急处理原则,可根据现场实际情况,先用大量水冲洗泄漏物和泄漏地域,冲洗后的水溶液必须收集起来,集中处理。建议使用泥土、沙子作收容材料。结论 氰化物是一种高毒物质,一旦发生泄漏,易造成人员中毒、环境污染。军队三防医学救援队是化学事故医学救援的重要力量。通过重点探讨氰化物突发灾害性事故的医学应急处理和相应的医学处置对策,为氰化物泄漏事故中应急医学救援提供科学决策依据,为有关部门在处置此类危害范围大得剧毒泄漏事故提供借鉴。
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  T7.35 MPTP对树鼩毒性作用

  高家红;江勤芳;黄璋琼;李聪;罕园园;吴正存;马开利

  2013, 27(S1): 201-201.

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  针对MPTP对树鼩的毒性作用进行了研究,结果表明,当MPTP的剂量为20 mg·kg^-1时,腹腔注射1 d后10只树鼩全部死亡;当注射剂量为10 mg·kg^-1时,注射1 d后有8只树鼩出现死亡,剩下的2只树鼩也在3 d后死亡;当注射剂量为5 mg·kg^-1时,仅有1只树鼩能活到第4天;当注射剂量为3 mg·kg^-1时,直到第5天,也未出现树鼩死亡的现象,并且其间树鼩还表现出震颤、姿势不稳、肌强直等典型的帕金森病样症状。因此,树鼩对MPTP表现出较高的敏感性,可能是一种潜在的帕金森病氏病动物模型。
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  T6.15 纳米/微米SiO₂颗粒致肺腺癌细胞A549炎性反应因子IL-6, IL-8及TNF-α水平的变化

  杨惠芳;刘秀芳;黄敏;周健;李宏辉;朱玲勤;赵婉云

  2013, 27(S1): 165-165.

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  目的 探讨纳米/微米SiO2颗粒单独及复合暴露对A549细胞的炎性反应的影响。方法 采用体外细胞培养的方式,建立人肺腺癌细胞A549与纳米/微米SiO₂单独、复合暴露模型。以染毒浓度为6.25, 25.0和100 mg·L^-1一次性染毒24 h后,通过ELISA法检测细胞上清液中炎性反应因子IL-6, IL-8及TNF-α水平的变化。结果 各低、中、高剂量下,纳米/微米单独或复合暴露均可引起A549细胞上清液中炎性反应因子IL-6, IL-8及TNF-α水平升高,且存在剂量-反应关系(P<0.05)。三个指标总体均呈现单独暴露组之间纳米组细胞上清液中炎性反应水平高于同剂量微米组(P<0.05);两种粒径纳米SiO₂颗粒相比,同浓度30 nm组对细胞炎性损伤作用较50 nm组高(P<0.05);复合暴露组细胞炎性反应水平高于同剂量单独暴露组(P<0.05)的趋势。结论 纳米/微米SiO₂颗粒单独或复合暴露均可引起人肺腺癌细胞A549内炎性反应因子的释放,产生炎性损伤。各组整体呈现剂量-效应关系,单独暴露组氧化损伤效应较复合暴露组低,且呈现粒径相关性。
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  T5.18 高功率微波辐照对子代大鼠海马形态学的影响

  郎海洋;张丽;曾丽华;王晋;苗霞;任东青;李予蓉;郭国祯

  2013, 27(S1): 152-152.

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  目的 探讨高功率微波(HPM)辐照对大鼠子代海马形态学的影响。方法 将成年Wistar大鼠分为雌雄2组,每组又各自随机分为假辐照组和3种不同参数辐照组,分别接受HPM发生装置全身照射后4个月,将辐照参数相同的雌性和雄性大鼠按照2:1合笼生育子代,子代根据亲代辐照参数分为4组,每组根据雌雄分为2组。在子代大鼠2月龄时经生理盐水和多聚甲醛灌注后取脑,固定,脱水,包埋,切片,染色。一部分固定采取JEM-2000EX透射电子显微镜观察,另一部分做冰冻切片计算海马长度。在6月龄时进行核磁共振成像测量计算海马体积,然后再经生理盐水和多聚甲醛灌注后取脑,固定,脱水,包埋,切片,染色。进行电镜观察。结果 2月龄子代大鼠与对照组相比,低脉冲辐照组HE染色,显示海马胶质细胞增生,电镜观察显示所有辐照组子代大鼠均有不同程度的细胞器扩张和肿胀。部分辐照组海马长度与大脑重量的比例均有显著差异。6月龄组子代大鼠与对照组相比,HE染色、电镜观察无显著差异,海马体积测量显示部分辐照组海马体积与颅腔体积之比与对照组比增大。结论 亲代受到高功率微波辐照后,子代大鼠大脑海马组织形态有一定的改变,但并不影响子代大鼠大脑海马细胞功能,而且随着时间的增加,这种影响逐渐减小甚至消失。
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  T7.22 丙戊酸诱发大鼠自闭症神经毒理机制

  洪玲娟;田允;王欢;蒋权;王成坤;廖美华;楼宜嘉;韩峰

  2013, 27(S1): 194-194.

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  目的 探讨丙戊酸诱发大鼠自闭症的分子毒理机制。方法 大鼠怀孕12.5 d时,实验组按600 mg·kg^-1给予腹腔注射丙戊酸0.25 ml/100 g(240 g·L^-1溶于生理盐水),对照组腹腔注射生理盐水(0.25 ml/100 g)。注射的孕鼠产下的幼鼠即为自闭症模型组。出生后当日,记为生后第1天(PND1)。Western blot法检测PSD₅₀大鼠海马中钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和CaMKⅡ突触前底物(突触蛋白Ⅰ)与突触后底物(GluR1)磷酸化水平变化,同时还检测了细胞膜表面褪黑激素受体1(MTR1)蛋白量的变化。小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2α用丙戊酸0.5 mmol·L^-1处理24 h后检测细胞膜表面MTR1内吞变化,并用酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测了MTR1在丙戊酸处理组和正常对照组中内吞的变化。结果 丙戊酸诱导的自闭症大鼠模型脑海马中磷酸化CaMKⅡ(Thr286)水平显著下降,并且CaMKⅡ突触前底物突触蛋白Ⅰ(Ser603)与突触后底物GluR1(Ser831)磷酸化水平也有相应变化。提示CaMKⅡ/突触蛋白Ⅰ/GluR1磷酸化水平可能与自闭症的病理过程相关。MTR1在脑内神经元细胞膜上表达量增加。丙戊酸处理Neuro-2α细胞实验中发现24 h后可逆转由褪黑素(100 nmol·L^-1)诱导的神经元MTR1内吞,表现为膜上MTR1表达量增加,内吞受体减少。提示丙戊酸可能通过干预褪黑素/MTR1介导的神经元信号转导,最终诱发了一系列自闭症关联的神经生物化学及功能改变。结论 丙戊酸可以干预褪黑素/MTR1介导的神经元信号转导,可能与自闭症病理过程中CaMKⅡ/突触蛋白Ⅰ/GluR1磷酸化水平稳态失衡相关联。
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  T6.12 多环芳烃暴露工人端粒长度与尿1-羟基芘及染色体损伤的关系

  宾萍;冷曙光;程娟;潘祖飞;牛勇;段化伟;戴宇飞;陈泓;刘清君;刘庆;郑玉新

  2013, 27(S1): 163-164.

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  目的 研究多环芳烃暴露工人外周血全基因组DNA端粒长度与尿1-羟基芘水平、以及外周血淋巴细胞染色体损伤的关系。方法 以138名焦炉作业工人作为多环芳烃暴露组,65名医护人员作为对照组。收集焦炉作业工人和对照个体工作周末班后6 h尿15和3 ml肘静脉血,以及个人职业史、年龄、性别、吸烟和饮酒状况等信息。测定其尿中1-羟基芘浓度,评价个体多环芳烃暴露内剂量;应用定量PCR方法和外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞微核检测法,分别评价多环芳烃暴露组和对照人群外周血全基因组DNA的端粒长度和染色体损伤水平。校正了性别、年龄、每日吸烟量和对数转换后的尿1-羟基芘水平后,使用协方差分析比较暴露组和非暴露组之间的端粒长度,Spearman偏相关统计分析方法分析端粒长度与尿1-羟基芘水平及外周血淋巴细胞染色体损伤的关系。统计分析使用SPSS for Windows 13.0统计软件包,统计学检验均为双侧,显著性水平定为α≤0.05。结果 多环芳烃暴露组端粒长度为1.10±0.76,短于对照组(1.46±1.07),校正了性别、年龄、每日吸烟量和对数转换后的尿1-羟基芘水平后,协方差分析显示,两组间的端粒长度差异有统计学意义(F=5.593,P =0.019)。以全部研究对象的端粒长度、尿1-羟基芘浓度和微核率的中位数为界值进行分层分析发现,外周血全基因组DNA端粒长度有随着尿1-羟基芘水平和外周血淋巴细胞微核率升高而缩短的趋势,具有统计学上的显著性意义(分别为r_spearman=-0.136,P=0.047和r_spearman=-0.153,P=0.029)。结论 端粒长度与多环芳烃暴露具有一定的剂量-效应关系,可在一定程度上反映了多环芳烃暴露所致的生物学效应。同时,端粒长度可反映染色体不同范围、不同层次的损伤,可以是外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞微核试验的一个补充,与外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞微核试验联合可能更好的评价多环芳烃暴露工人染色体损伤的情况。
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  T6.13 基于microRNA表达谱技术的肺纤维化研究进展

  李文超;张迎建;杨红

  2013, 27(S1): 164-164.

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  肺纤维化是一组由多种病因引起的肺破坏性疾病,其病理过程为当肺内纤维母细胞受到物理、化学或生物因素作用时,分泌胶原蛋白修补肺间质组织,进而造成肺纤维化。由于microRNA(miRNA)参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物进程,其表达异常会导致组织器官的癌症及纤维化等疾病,因此miRNA对肺纤维化的基因表达调控日益成为研究的热点。本文主要对miR-29, miR-21, miR-155, miR-149, let-7d等几种miRNA在肺纤维化过程中所起作用的最新进展作一综述,以期为深入了解肺纤维化的发生机制及防治措施提供新思路。miR-29调节与纤维化相关的COL1A1,COL1A2,COL3A1等基因,可抑制转化生长因子-β(TGF-β)的致纤维化通路以及ECM的合成,并有抗纤维化的功效。miR-21可通过抑制Smad蛋白、Smad7的表达,调节肌成纤维细胞的分化从而调节纤维化进程。miR-155的表达上调可由肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)引起,而其下调可由TGF-β引起,miR-155在成纤维细胞中可抑制角质细胞生长因子的表达并增加其迁移。miR-149通过抑制E-钙粘蛋白的表达,参与了上皮细胞向间质细胞的转化过程,其表达下调可导致肺泡壁中大量炎性细胞浸润,肺泡结构增厚,进而导致肺纤维化。let-7d表达减少可导致胶原蛋白沉积增加,肺泡间隔增厚。抑制let-7d的表达可能是肺纤维化中细胞表型显著变化的一个关键调控点,可能为肺纤维化的治疗提供新思路。上述研究表明这些miRNAs的异常表达可以影响肺纤维化疾病的发生,合理的选择特定的miRNA可干预其靶基因所调控的疾病的发生发展。理论上,对于miRNA表达增加的疾病,给予反义核苷酸阻断miRNA的活性,或者通过干预相关活化的信号转导通路,从而恢复其正常调节水平;而对于miRNA表达减少所致的疾病,通过构建相关表达载体,将含有目标miRNA导入体内重建其表达,达到治疗疾病的目的。
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  T6.17 三甲基氯化锡对雄性小鼠生殖系统的过氧化损伤

  刘振中;冯华强;王美凤

  2013, 27(S1): 166-166.

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  目的 三甲基氯化锡(TMT)作为无铅型塑料稳定剂的中间产物,毒性较高还具有蓄积性。本实验探讨给予雄性小鼠低剂量反复染毒后,观察其对小鼠雄性生殖器官的过氧化损伤情况。方法 选择昆明种雄性小鼠18只,体质量20~30 g,按照体重随机分为三组(对照组,低剂量染毒组和高剂量染毒组)每组6只动物。低剂量和高剂量染毒组分别腹腔注射TMT 0.5和0.75 mg·kg^-1,每天1次,连续染毒9 d。在染毒期间观察动物的表现,在染毒第10天以颈椎脱臼法处死受试动物,取受试动物的睾丸和精囊前列腺组织,去除表面血迹,以1:9加入预冷生理盐水后,在冰水浴中制作组织匀浆液。以试剂盒方法测定睾丸和精囊前列腺的SOD和MDA值。结果 高剂量染毒组在染毒后第4天开始有神经兴奋和动物活动增加的表现,第6天动物出现全身抽搐和攻击性增加的表现;低剂量染毒组动物在第6d出现神经兴奋和活动增加现象,第7天出现攻击性增加表现。从睾丸的SOD和MDA测定结果来看,低剂量和高剂量染毒组动物的睾丸SOD测定值分别为(77.23±10.21)和(76.88±28.14)kU·L^-1均明显低于对照组动物睾丸SOD值(116.91±30.25)kU·L^-1且具有统计学差异(P<0.01)。而低剂量和高剂量染毒组动物的睾丸MDA值分别为(31.25±35.31)和(24.89±19.71)μmol·L^-1与对照组(22.50±11.39)μmol·L^-1比较无明显差异。精囊前列腺的SOD值测定结果,低剂量组精囊前列腺的SOD值(80.26±14.50)kU·L^-1与对照组(129.14±55.22)kU·L^-1比较无明显差异;而高剂量组精囊前列腺的SOD值(68.83±23.40)kU·L^-1较对照组(129.14±55.22)kU·L^-1有明显的降低,且有统计学差异(P<0.05);精囊前列腺的MDA值测定结果,高剂量组精囊前列腺的MDA值(59.66±24.37)μmol·L^-1与对照组(32.84±15.32)μmol·L^-1比较有明显的升高(P<0.05),而低剂量组精囊前列腺的MDA值(31.48±10.64)μmol·L^-1与对照组比较无明显差异。结论 三甲基氯化锡对雄性生殖器官均有不同程度的过氧化损伤。
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  T6.18 百草枯暴露对小鼠神经行为发育及黑质纹状体多巴胺能系统的影响

  王翘楚;娄丹;黄敏;常秀丽;周志俊

  2013, 27(S1): 166-167.

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  目的 观察百草枯对C57BL/6J小鼠神经行为发育的毒性作用,探讨百草枯对小鼠黑质纹状体多巴胺能系统的影响。方法 3周龄仔鼠灌胃给予百草枯1.25, 2.5, 5和10 mg·kg^-1·d^-1,持续27 d。观察小鼠的一般生理和神经行为发育情况,并在染毒结束后进行Morris水迷宫实验,测试小鼠的学习记忆功能。神经行为学测试结束后取小鼠大脑,计算脏器系数,并对中脑进行病理切片,观察组织学变化。利用实时荧光定量PCR方法检测黑质纹状体多巴胺系统转运相关基因D2R, DAT, VMAT2及代谢相关基因MAOB, TH, COMT的mRNA的表达变化。结果 染毒期间小鼠一般状况没有明显变化,染毒结束后各组体重差异没有统计学意义;Morris水迷宫测试中,各组小鼠在空间探索实验中潜伏期的差异均不具有统计学意义;病理切片中,在高剂量组发现中脑黑质细胞明显减少。实时荧光定量PCR结果显示,在多巴胺系统转运相关基因中,D2R的mRNA表达水平未见明显差异;与对照组相比,各染毒组黑质纹状体DAT的mRNA表达量均存在明显差异(P<0.05);虽然1.25 mg·kg^-1·d^-1剂量组的VMAT2的mRNA表达量与对照组相比没有明显变化,但当着染毒剂量升高至5 mg·kg^-1·d^-1,VMAT2的mRNA表达量随剂量的升高呈现降低的趋势,且同对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。对多巴胺系统代谢相关基因mRNA表达水平的检测发现,百草枯染毒后,MAOB的mRNA表达水平未有明显差异;TH基因mRNA的表达水平在5和10 mg·kg^-1·d^-1剂量组有明显的降低(P<0.05),相反,COMT基因mRNA的表达水平在2.5, 5和10 mg·kg^-1·d^-1剂量组有逐渐升高的趋势,且与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 低剂量百草枯染毒虽对小鼠的神经行为没有明显影响,但会使小鼠成年后出现脑组织的病理变化,同时影响成年后小鼠黑质纹状体多巴胺系统转运和代谢相关基因的表达。
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  T4.28 三七皂苷联合茶多酚对酒精性肝损伤的保护作用

  王凤岩;陈瑞仪;周轶琳;汤莉;周诗光

  2013, 27(S1): 135-135.

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  目的 研究三七皂苷联合茶多酚对酒精性肝损伤的保护作用。方法 50只SPF级昆明种小白鼠随机分成阴性对照组、乙醇对照组及三个剂量组(剂量分别为0.40, 0.80和1.60 g·kg^-1),各剂量组每天分别按不同剂量灌胃给予三七皂苷联合茶多酚复合制剂,阴性对照组和乙醇对照组按同等容量灌胃给予纯净水,每周称重动物,以调整给受试样品量,共30 d。试验结束时各剂量组和乙醇对照组以0.12 ml/10 g剂量一次灌胃给予50%乙醇,阴性对照组灌胃给予同等容量纯净水,各组动物禁食16 h后麻醉采血测定ALT、AST、取肝组织制成肝匀浆测定肝组织丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)及肝组织病理组织学检查。结果 与乙醇对照组比较,三七皂苷联合茶多酚0.80和1.60 g·kg^-1剂量组可降低血ALT含量(P<0.05);各剂量组均可降低肝组织MDA含量(P<0.05);三七皂苷联合茶多酚 0.40 g·kg^-1剂量组可增加肝组织GSH含量(P<0.05),各剂量组均可改善肝组织细胞的脂肪变性(P<0.05)。结论 三七皂苷联合茶多酚对酒精性肝损伤具有一定的保护作用。
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  T13.41 妊娠期正己烷暴露对F1代大鼠卵巢颗粒细胞启动子区差异甲基化全基因组的影响

  李宏;翁少峥;肖世华;李煜辰;王文祥;谢美美;吴停停;张文昌

  2013, 27(S1): 264-265.

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  目的 从甲基化机制上阐明妊娠期正己烷暴露对于子代卵巢发育和功能的影响。方法 Wistar孕鼠孕期1~20日分别暴露于正己烷0, 100, 500, 2500和12 500 ppm,静式吸入染毒,4 h·d^-1,F1代雌鼠出生后56 d取卵巢,观察病理和卵泡数目构成比。然后分离F1代大鼠的卵巢颗粒细胞,提取基因组DNA与5-mC抗体免疫共沉淀,再与Nimblegen 385K Promoter Plus CpG Island Arrays杂交,以启动子区探针Peak Score>2并和对照组有差别为标准筛选差异甲基化基因。将差异甲基化基因导入DAVID数据库进行以下分析:Gene Ontology Consortium方法注释差异性甲基化基因、差异性甲基化基因DAVID聚类分析、DAVID聚类基因Pm value值二项聚类分析组间甲基化模式差异、差异甲基化基因KEGG信号通路分析。结果 12 500 ppm组的次级卵泡比例显著低于对照组(P<0.05),闭锁卵泡比例显著高于对照组(P<0.05)。正己烷暴露组共同基因中,去甲基化基因多于高甲基化基因,正己烷的甲基化效应主要与细胞过程、代谢过程、细胞内基因和磷酸转移酶活性基因有关。在细胞死亡、细胞生长和激素调控聚类中,对照和500 ppm组的甲基化模式比较接近,2500和12 500 ppm组的甲基化模式相对接近。凋亡通路中12 500 ppm组促凋亡基因Bad启动子区低甲基化,500 ppm组凋亡促进基因NFKBIA,Bid,Casp7,Dffb启动子区高甲基化。在激素合成通路,2500和12 500 ppm组Cyp11a1, Cyp17a1, Hsd3b1 和 Srd5a1基因启动子区的高甲基化。结论 妊娠期正己烷暴露能影响F1代雌性大鼠的卵巢发育,并能改变子代卵巢颗粒细胞的DNA启动子区甲基化状态,其中高剂量的正己烷暴露(2500和12 500 ppm)能明显改变颗粒细胞凋亡基因和激素合成基因的甲基化状态。
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  T4.29 夏枯草急性和亚慢性毒性

  陈壁锋;赵敏;杨国光;黄建康;谭剑斌;黄俊明

  2013, 27(S1): 136-136.

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  目的 为夏枯草的安全性评价提供毒理学依据。方法 夏枯草生药的人体每天推荐服用量为18.5 g,经折算后浸膏推荐服用量为0.0391 g·kg^-1。急性经口毒性试验采用Horn's法,体质量18~22 g的健康NIH种小白鼠40只,随机分为4个剂量组,每组10只,雌雄各半,按21.5, 10.0, 4.64和2.15 g·kg^-1剂量分别给予夏枯草浸膏。亚慢性毒性试验选用体质量60~90 g的健康SD种大鼠80只,随机分成低、中、高三个剂量组和阴性对照组,每组20只,雌雄各半,剂量组每天灌胃给予1.29, 3.91和11.73 g·kg^-1的夏枯草浸膏,阴性对照组给以同等容积的纯净水,依据每周体重调整受试物量,连续90 d。结果 (1) 急性经口毒性试验:给予受试物后,实验动物饮食、活动正常,未观察到动物出现中毒反应,试验期内动物无死亡,获得雌、雄性小鼠急性经口毒性LD₅₀>21.5 g·kg^-1。(2) 亚慢性毒性试验:给予夏枯草浸膏处理期间,大鼠外观体征(眼、口、鼻外观及其分泌物,皮毛等)无异常,粪便与尿液均未发现异常,动物行为、活动、步态均正常,各剂量组均未出现动物死亡;各剂量组大鼠体重、摄食量及食物利用率指标与对照组比较,差异均无显著性意义(P>0.05)。实验中期及实验结束时,各剂量组红细胞数、血红蛋白、白细胞数和分类、血小板数与对照组比较,差异均无显著性意义(P>0.05)。实验结束时,血液生化学指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血糖、肌酐和尿素氮)与对照组比较,差异均无显著性意义(P>0.05);各剂量组肝、脾、肾、睾丸的重量及脏/体比值与对照组比较,差异均无显著性意义(P>0.05);肝、脾、肾、睾丸和卵巢的大体解剖和组织病理学检查,未见与受试物有关的病理改变。结论 根据LD₅₀剂量分级标准,夏枯草浸膏属于无毒级物质;在本实验条件下,最大未观察到有害作用剂量大于11.73 g·kg^-1(相当于夏枯草92.58 g·kg^-1,为人体推荐量300倍)。因此,在我国药典的推荐服用量下(夏枯草18.5 g·d^-1),夏枯草及其浸膏产品的应用比较安全。
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  T20.67 雌激素受体α-PI-3K调控环路在雌马酚诱导乳腺癌细胞增殖中的作用

  穆娟;蒋菲;司璐;叶献青;王星星;宁士龙;胡春艳;李忠

  2013, 27(S1): 394-394.

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  目的 探讨雌马酚是否可通过质膜上雌激素受体与胞内细胞信号相互作用发挥非经典的雌激素效应及其具体分子过程仍不清楚。方法 检测细胞增殖:MTT实验;检测磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)信号通路激活:Western blot检测总Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的表达水平;检测ER的转录活性:荧光素酶报告基因实验;检测ER的功能:qRT-PCR检测pS2 mRNA表达水平。结果 雌马酚对ERα阳性MCF-7细胞的增殖调控呈双相效应即低剂量可刺激细胞增殖,高剂量主要抑制细胞增殖,然而在ERα阴性MDA-MB-231细胞中,雌马酚则剂量依赖性抑制细胞增殖,结果提示ERα在低剂量雌马酚诱导乳腺癌细胞增殖过程中发挥重要作用;低剂量雌马酚可时间依赖性上调MCF-7细胞p-Akt和pS2 mRNA的表达水平,而不影响总Akt,用wortmannin(PI-3K抑制剂)预处理MCF-7细胞后,可阻滞雌马酚所致pS2 mRNA表达升高和细胞增殖,在MDA-MB-231细胞中,未观察到雌马酚处理对p-Akt和pS2 mRNA的表达水平的影响,而在MDA-MB-231细胞中高表达ER后,PI-3K抑制剂可阻滞雌马酚对ERα转录活性及靶基因pS2 mRNA表达的增强作用,结果提示PI-3K/Akt信号通路在雌马酚激活ERα过程中发挥重要作用;在MCF-7细胞中ICI(ER拮抗剂)可阻滞雌马酚对p-Akt的激活,而在MDA-MB-231细胞中,ICI不影响p-Akt及总Akt的表达,结果提示ERα在雌马酚激活PI-3K/Akt信号通路过程中发挥重要作用。结论ERα-PI-3K调控环路在雌马酚诱导乳腺癌细胞增殖过程中发挥重要作用。
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  T20.69 SO₂对大鼠心肌细胞线粒体氧化磷酸化功能的影响及其分子机制

  秦国华;王姣霞;桑楠

  2013, 27(S1): 395-395.

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  目的 研究SO₂对心肌细胞线粒体氧化磷酸化功能的影响及其分子机制。方法 NaHSO₃ (0,10, 30和 100 μmol·L^-1)对H9C2心肌细胞进行24 h染毒,并采用动式吸入染毒给大鼠吸入不同浓度的SO₂(0, 3.5, 7和14 mg·m^-3),每天4 h,连续染毒30 d,最后一次处理20 h后将大鼠处死,取出心脏组织,部分组织用于提取线粒体,其余组织置于液氮保存。采用分光光度法检测了线粒体膜电位及细胞色素C氧化酶的活性,采用荧光定量PCR检测H9C2心肌细胞及大鼠心脏线粒体DNA及氧化磷酸化复合体Ⅰ, Ⅳ与Ⅴ中亚基ND4, COXⅠ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ及ATP6&8的mRNA水平的含量,采用荧光定量PCR及Western blot检测了调控线粒体复合体的转录因子PGC-1α, NRF1和mtTFA的mRNA和蛋白表达情况。结果 SO₂染毒后大鼠心脏线粒体功能受损,线粒体膜电位及细胞色素C氧化酶的活性均有所降低;NaHSO₃/SO₂染毒后线粒体DNA量减少;NaHSO₃/SO₂可显著降低由线粒体DNA编码的ND4, COXⅠ, Ⅱ, Ⅲ及ATP6&8的mRNA水平这些基因的转录水平,然而核DNA编码的COXIV的mRNA水平未受影响;在体外实验中NaHSO₃可显著降低三个调控基因的转录和翻译水平,在体内实验中,NRF1和mtTFA的表达在所有SO₂处理组均显著下降,但PGC-1α仅在14 mg·m^-3处理组显著下降。结论 SO₂可能通过影响线粒体DNA编码基因造成线粒体DNA损伤,进而导致心力衰竭、心律不齐等心血管系统疾病。而PGC-1α, NRF1和mtTFA可能是参与调控相关基因的关键因子。
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  Applying Adverse Outcome Pathways to environmental toxicity：Source to outcome

  OLIVER Price;STUART Marshall;LAN Malcomber

  2013, 27(S1): 410-410.

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  The current approach to assessing adverse effects of chemicals in the environment is largely based on a battery of in-vivo study methods supported by a limited number of accepted in-silico approaches. Application Factors (AFs) are applied to the most sensitive in-vivo endpoints to derive Predicted No Effect Concentrations (PNECs). Thus AFs are currently the link between effects observed in short-term single-species studies and effects on ecosystem communities (and the associated protection goals). However, there is no clear mechanistic justification to support the defined levels of the AFs. New tools are beginning to emerge that can address some of these deficiencies. These tools include mechanistic effect models that can (begin to) account for some of the complexity of communities and ecosystems, and models that can extrapolate from individual level effects to population effects. Within the Adverse Outcome Pathway (AOP) framework, mechanistic effect models can be used to link chemical effects at different levels of biological organisation based on an understanding of the chemical Mode of Action (MoA). One of the most prevalent MoAs in the aquatic compartment is narcosis, which is thought to encompass between 50 and 70% of all industrial chemicals. The narcosis MoA is characterised by a strong correlation between toxicity and hydrophobicity. This suggests that the toxicity is related to bulk partitioning into lipid rich compartments such as cellular membranes with "membrane perturbation/disruption" as an early key event. However, the exact nature of the Molecular Initiating Event(s) in narcosis is unknown. There is evidence for subclasses of narcosis. At a basic level the classification scheme of Verhaar et al (1992) recognises both Class 1 (general narcotic) and Class 2 (polar narcotic) compounds, and there is additional evidence that other subclasses also exist such as ester and amine narcosis (Russom 1997, Schultz et al 1998). There are different approaches to calculating the toxicity of narcotic chemicals. One approach is the Critical Body Burden (CBB) approach, where an effect in an individual occurs when a critical concentration in the organism is exceeded. For narcosis a CBB range of 2-8 mmol·kg^-1 has been established for acute lethality (van Wesel & Opperhuizen, 1995). Another approach for predicting the toxicity of narcotic chemicals was developed by Mackay et al (2009) based on the concepts of chemical activity and toxic potency. Despite significant gaps in the chain of events leading to adverse outcome, an initial AOP for narcotic chemicals has been outlined by Ankley et al, 2010. Mechanistic effect models can potentially help elucidate every step of this AOP. Concentrations at target sites can be predicted using either CBB or activity-based models. Toxicodynamic/toxicokinetic models can predict how effects propagate from lower to higher levels of biological organisation using endpoints such as damage accrual, damage recovery, energy allocation, physiological compensation and thresholds. Finally population dynamics can be modelled based on ecological and life history traits to predict responses on the population level. The implementation of such models, however, may require a higher level of understanding than currently available. Whilst AOPs provide a useful framework for making robust links between key events at a molecular/ sub-individual level and apical endpoints, considerable work is needed before they are fully applicable in supporting more ecologically relevant risk assessment decisions.
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  T20.71 神经细胞NADPH氧化酶介导神经免疫诱导的多巴胺神经退行性病变

  周辉;廖洁莹;高慧明;洪昭雄

  2013, 27(S1): 396-396.

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  目的 研究神经细胞上的NADPH氧化酶在炎症引起的神经退行性疾病中的作用。结果 脂多糖LPS引起的小胶质细胞激活,能够促进共处理的中脑原代神经细胞和多巴胺能神经元N27中NADPH氧化酶表达增加(包括其主要的亚基gp91^phox,p47^phox和p67^phox)。神经炎症反应能够促进中脑原代神经细胞中活性氧自由基(ROS)的产生,同时这种ROS的升高效果可以被NADPH氧化酶的抑制剂消除。对NADPH氧化酶进行功能性抑制或基因敲除能够降低神经炎症反应诱导的多巴胺神经元的损伤。神经炎症能够引起神经细胞的线粒体功能障碍,而NADPH氧化酶的抑制剂能够缓解线粒体的损伤。体内研究表明,腹腔注射LPS (5 mg·kg^-1)诱导的帕金森病模型中,神经细胞中的NADPH氧化酶的表达明显升高,二氢乙啶染色表征的神经细胞中氧化应激水平显著高于盐水注射组。 LPS腹腔注射24 h也能够导致野生型小鼠黑质神经元内氧化应激水平升高,而在NADPH氧化酶缺陷的小鼠黑质细胞神经中并不显著。结论 神经免疫反应能够引导神经细胞中的NADPH氧化酶表达增加并激活酶的活性,导致神经细胞内产生氧化应激,从而造成线粒体功能性损伤,从而导致神经元退行性病变。该结果表明,神经细胞中的NADPH氧化酶在神经炎症诱导的神经退行性病变中扮演着重要的角色。
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  T20.44 衣霉素致人肝癌HepG2细胞凋亡及自噬机制

  张燊;王丛丛;邓思君;张朝明;周延;汤树生;肖希龙

  2013, 27(S1): 381-382.

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  目的 观察衣霉素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及自噬的作用,并初步探究其凋亡及自噬的机制。为研究衣霉素导致人肝癌HepG2细胞具体凋亡、自噬通路奠定基础。方法 以人肝癌细胞系HepG2细胞系为细胞模型,不同剂量衣霉素攻毒24,36和48 h后,通过Hoechst-PI荧光染色法和流式细胞术检测衣霉素引起的HepG2细胞凋亡现象。用罗丹明123检测攻毒后HepG2细胞线粒体膜电位,Western blot 检测CHOP、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶12、PARP、BAX、AIF蛋白表达水平。以人肝癌细胞系HepG2细胞系为细胞模型,不同剂量衣霉素攻毒6,12和24 h后,采用MDC染色,荧光显微镜观察自噬囊泡,流式细胞术检测其荧光强度。pGFP-LC3质粒瞬时转染HepG2细胞,衣霉素处理后,荧光显微镜检测自噬。Western blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ, beclin1, DAPK1蛋白表达水平。结果 Western blot实验检测CHOP蛋白呈时间、剂量依赖性增加,说明衣霉素引起HepG2细胞内质网应激程度呈时间、剂量依赖性增加。凋亡检测表明,随衣霉素作用时间及剂量的增加,细胞凋亡现象明显增加。衣霉素可能通过胱天蛋白酶依赖性的线粒体凋亡途径诱导HepG2细胞凋亡。主要表现在: PARP、BAX、胱天蛋白酶12表达量呈时间、剂量依赖性增加,胱天蛋白酶9前体、胱天蛋白酶3前体表达呈时间、剂量依赖性减少。剪切体胱天蛋白酶8只呈现出一定程度的时间相关性增加。攻毒后HepG2细胞线粒体膜电位呈剂量依赖性降低。衣霉素攻毒HepG2细胞后,其自噬囊泡增多,MDC染色强度呈时间、剂量依赖性增加。GFP-LC3在攻毒细胞组中出现明显点状聚集,其数量呈时间依赖性增加。LC3Ⅰ/LC3Ⅱ表达量比值呈时间、剂量依赖性减少,beclin1, DAPK1表达量呈时间、剂量依赖性增加。说明衣霉素可能通过DAPK1依赖性通路引起细胞发生自噬。结论 衣霉素可能通过引起内质网应激后激活胱天蛋白酶依赖性的线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡,同时通过激活DAPK1引起HepG2细胞自噬。
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  T20.46 过氧化氢对NIH3T3细胞蛋白磷酸酶2A催化亚基甲基化的调控作用

  唐深;陆彩玲;曾晓春;刘银品;李习艺

  2013, 27(S1): 382-383.

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  目的 探讨过氧化氢诱导的氧化应激对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3蛋白磷酸酶2A催化亚基C亚基(PP2A-C)甲基化修饰的调控作用。方法 过氧化氢处理小鼠NIH3T3细胞后,光镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期,蛋白免疫印迹检测LCMT, PME表达及PP2A-C甲基化水平。细胞核分离试剂分离细胞胞浆蛋白及核蛋白,抗体检测LCMT, PME表达及PP2A-C甲基化水平。结果 过氧化氢刺激NIH3T3细胞1 h后,细胞形态未见明显改变,细胞周期阻滞,细胞内总PP2A-C不变,但非甲基化PP2A-C表达增高,PME, LCMT表达不变。细胞核分离试剂分离细胞胞浆蛋白及核蛋白, LCMT主要分布在胞浆而非细胞核,PME在胞浆及细胞核中均有表达。非甲基化PP2A-C增加在胞浆及细胞核均有增加,但细胞核增加为主。结论 过氧化氢改变NIH3T3细胞PP2A-C修饰状态。
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  早期毒性优化筛选在药物候选决策中的作用

  马璟

  2013, 27(S1): 419-419.

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  对过去40年国外新药物研发的研究数据显示：在5000～10 000个化合物经过筛选和研究后，仅有250个化合物能进入临床前的研究，而其中95%的化合物又将淘汰，仅有10～15个化合物进入临床试验，临床试验的成功率为14%左右,最终仅有1个化合物获得成功上市。“在药学研究、非临床研究和临床试验过程中，没有从不断获得的研究数据中找出关键的问题以及决策的标准”是新药物研发失败的十大原因之一。另外，药品审评中心统计了2005-2008年期间19个不批准品种的原因，非临床试验结果不支持临床试验的占了仅30%。可见药物的安全性评价结果，尤其是早期毒性优化筛选在新药研发过程中扮演着重要的角色。早期毒性优化筛选系统可对心脏毒性、肝毒性、肾毒性、光毒性、免疫毒性、遗传毒性以及生殖发育毒性进行早期筛选。该系统涵盖的毒理学终点广，方法敏感性高，使用的样品量少，周期短，技术方法易于掌握且试剂及仪器费用低，可尽早淘汰“毒性大、疗效差”的候选化合物，从而可大大降低新药研发的风险，加快新药的研发进程。
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  药物候选物剔除决策：药政部门的经验

  王庆利

  2013, 27(S1): 419-419.

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  候选药物的去留是药物研发过程中的关键决策环节。不同的申请人有不同的决策机制和策略，如有效性/安全性方面、市场竞争以及自身开发序列等。在我们所掌握的案例中，大多数是基于立题和有效性/安全性方面的考虑等。药物开发首先需要考虑是否存在未被满足的临床需求，结合适应症相关的临床治疗指南及临床实践，所开发的新药是否能解决当前临床实践中存在的问题。关注当前处于临床研究或开发失败的产品暴露出来的有效性/安全性风险，针对性决策。非临床研究与评价应基于临床研究目的和方案开展。其次要考虑拟开展的临床研究的关键支持证据，是来源于个案还是一定数量的可重复的临床案例，还是来自于基础研究。在对非临床有效性/安全性研究评价时，不仅应针对自身研究中所暴露的风险加以识别和控制，还应对同类化合物、同类机制等研究的风险信号加以关注，并在临床方案中预设对策。虽然动物与人体存在种属差异，但不应过分强调动物数据用于预测人体具有局限性，特别关注有效性和安全性的作用机制研究。
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  T2.76 Toxic effects of silica nanoparticles on zebrafish embryos and larvae

  DUAN Jun-chao;YU Yong-bo;SHI Hui-qin;TIAN Lin-wei;GUO Cai-xia;HUANG Pei-li;ZHOU Xian-qing;PENG Shuang-qing;SUN Zhi-wei;

  2013, 27(S1): 66-66.

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  OBJECTIVE Silica nanoparticles (SiNPs) have been widely used in biomedical and biotechnological applications. Environmental exposure to nanomaterials is inevitable as they become part of our daily life. Therefore, it is necessary to investigate the possible toxic effects of SiNPs exposure. METHODS In this study, zebrafish embryos were treated with SiNPs (25, 50, 100, 200 mg·L^-1) during 4-96 h post fertilization (hpf). Mortality, hatching rate, malformation and whole-embryo cellular death were detected. We also measured the larval behavior to analyze whether SiNPs had adverse effects on larvae locomotor activity. RESULTS The results showed that as the exposure dosages increasing, the hatching rate of zebrafish embryos was decreased while the mortality and cell death were increased. Exposure to SiNPs caused embryonic malformations, including pericardial edema, yolk sac edema, tail and head malformation. The larval behavior testing showed that the total swimming distance was decreased in a dose-dependent manner. SiNPs 25 and 50 mg·L^-1 produced substantial hyperactivity while the higher doses SiNPs 100 and 200 mg·L^-1 elicited remarkably hypoactivity in dark periods. CONCLUSION SiNPs caused embryonic developmental toxicity, resulted in persistent effects on larval behavior.
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  T3.11 Bhas 42细胞转化实验高通量检测方法的建立及对植物性雌激素的研究

  王颖;张海洲;耿兴超;李波;王雪

  2013, 27(S1): 72-73.

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  目的 研究建立以H₂O₂判定结果的96孔板细胞转化实验方法,并对植物性雌激素染料木黄酮和葛根素进行了研究。方法 1)采用细胞灶法和H₂O₂法分别进行实验。细胞灶组;第21天直接固定染色,计数转化灶个数。H₂O₂组:细胞接种后培养至第19天时,添加H₂O₂处理24 h,CCK-8染色并测定A_{450 nm}值,计算细胞转化率。比较两种方法的相关性。2)通过细胞生长试验选择适宜的染料木黄酮和葛根素浓度进行细胞转化实验,H₂O₂法判定转化实验结果。结果 1)细胞灶法:启动实验阳性对照3-甲基胆蒽(3-MCA)组每板有53个孔含有转化灶,阴性对照组每板有13个。促癌实验阳性对照佛波醇12-十四酸13-乙酸酯(TPA)组每板有40个孔含有转化灶,阴性对照组每板有18个。转化灶个数分别通过卡方检验,P值均小于0.01,有显著差异。H₂O₂法:启动实验3-MCA组每板有40个孔含有转化灶,阴性对照组每板有12个。促癌实验TPA组每板有50个孔含有转化灶,阴性对照组每板有15个。卡方检验P值均小于0.01,阳性组相对于阴性组有显著差异。450 nm下测得的A值通过t检验也有显著差异。2)在启动实验中,染料木黄酮和葛根素各浓度组相对于阴性组均无显著性差异,为阴性结果。而促癌实验染料木黄酮浓度为0.03, 1和3 mg·L^-1时的A值相对对照组有显著差异,表现为阳性结果。葛根素浓度为3 mg·L^-1时的A值相对对照组有显著差异,表现为可疑(equivocal)。结论 H₂O₂法判定结果的可靠性,Bhas 42细胞转化实验高通量检测方法可用于药物非遗传毒性致癌物和遗传毒性致癌物的早期筛选。染料木黄酮在本实验条件下,促癌实验呈阳性结果,但启动实验呈阴性结果,提示其具有非遗传毒性致癌性;葛根素在促癌实验中为可疑结果,提示其可能具有非遗传毒性致癌性。
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  T3.12 抗体药物共轭物的非临床安全评价

  阎水忠

  2013, 27(S1): 73-73.

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  抗体药物共轭物(ADC)的研究作为一个全新的领域,近年来正越来越受到制药行业的关注,据统计,在过去短短的几年里共有25中抗体药物共轭进入临床试验,其中2011-2012年共有17种约占2/3。尤其是今年年初,Genetech公司的曲妥珠单抗-DM1(T-MD1)获得美国食品药品管理局(USFDA)的批准后,使得抗体药物共轭物的研发再次成为制药行业关注的焦点。目前在全球处于临床试验阶段的共有36种作用于30个靶点的抗体药物共轭物,主要用于治疗血液癌症与实体肿瘤。抗体药物共轭物将单克隆抗体与小分子药物偶联,通过利用小分子药物的高活性与单克隆抗体的高选择性,它可大大提高药物在体内的治疗效果。但是,抗体药物共轭物的设计非常复杂,需要极其深思熟虑的设计将抗体,连接物与药物有机的结合起来并用于适当的疾病。根据过去几年研发的经验,目前对抗体药物共轭物研发的挑战包括:如何改善药物的治疗指数,增进对抗体药物共轭物作用的理解,对抗体药物共轭物中各个部分的毒性(包括靶点与非靶点毒性)进行安全评价以及临床研究与临床治疗的适宜病人的选择等等。由于目前仍没有专门对抗体药物共轭物非临床安全评价的指导原则,同时抗体药物共轭物是一个非常复杂的结合体,因此,对抗体药物共轭物的非临床安全评价没有一个统一的模式,往往需要个案处理。这对抗体药物共轭物非临床安全评价带来很大的挑战性。本次演讲的宗旨是在对抗体药物共轭物的非临床安全评价进行全面的回顾的基础上,对抗体药物共轭物的非临床安全评价的策略,方案制定以及注意事项进行系统地探讨。
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  T2.77 Effects of microcystin-LR on photosynthetic activity and chloroplast ultrastructure of rice (Oryza sativa L. japonica) leaves

  JIANG Jin-lin;SHAN Zheng-jun;ZHOU Jun-ying;BU Yuan-qing;XU Wei-li

  2013, 27(S1): 66-67.

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  Microcystins produced by toxic cyanobacteria in freshwater ecosystems can present a harmful effect on growth and development of terrestrial plants through irrigation with contaminated water, but its phytotoxic effects on photosynthesis of plants are seldom reported. In this study, the phytotoxic effects and possible action mechanism of microcystin-LR (MC-LR) on the photosynthesis rice (Oryza sativa L. japonica) was studied. The growth and development, photosynthetic indicators including the net photosynthesis rate, stomatal conductance, intercellular carbon dioxide concentration and transpiration rate, as well as the ultrastuctural alteration of rice leaves were investigated when rice were exposed to 0, 0.1, 1, 10, 100, 500 μg·L^-1 of MC-LR for 21 d. Results show that the boveground biomass and plant height of rice were reduced significantly under the exposure of 1 μg·L^-1 MC-LR. The stomatal conductance, intercellular carbon dioxide concentration and transpiration rate were significantly inhibited by 46.6%, 8.44% and 44.0%, respectively, in the group of 0.1 μg·L^-1 MC-LR, while the net photosynthesis rate was significantly inhibited by 39.9% in 100 μg·L^-1 MC-LR. Following higher MC-LR exposure, a significant decrease of Chl a content accompanied by a increase of Chl b content were observed revealed that MC-LR may cause a change in the pigment pattern. The subcellular damages such as condensed chromatin and swollen or even disrupted thylakoids of chloroplast could be observed in mesophyll cells due to MC-LR exposure (>1 μg·L^-1). These results implied that the inhibition of photosynthesis might be an important action mechanism of MC-LR on terrestrial plants, inducing retardance in the growth and development of plants.
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  T2.78 Polymorphisms in SELE gene and risk of coal workers pneumoconiosis in Chinese：A case-control study

  WANG Ting;JI Xiao-ming;LUO Chen;FAN Jing-jing;HOU Zhi-guo;CHEN Min-juan;HAN Ru-hui;NI Chun-hu

  2013, 27(S1): 67-67.

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  OBJECTIVE To investigated the association between the functional polymorphisms in SELE and the risk of coal workers' pneumoconiosis(CWP) in Han Chinese population. METHODS Three polymorphisms (T1880C/rs5355, T1559C/rs5368, A16089G/rs4786) in SELE were genotyped and analyzed in a case-control study with 697 CWP cases and 694 controls. The genotyping was based on the TaqMan method with the ABI 7900HT Real Time PCR system. RESULTS The SELE rs5368 CT genotype was associated with a significantly increased the risk of CWP (OR=1.28, 95%CI=1.02-1.60, P=0.03) relative to the CC genotype. The statistical analysis of classification and regression tree (CART) and multifactor dimensionality reduction (MDR) were used to predict the interactions among risk factors of CWP. The MDR analysis found that the best interaction model was the two-factor model that contains pack-years smoked and SELE rs5368 genotypes. For non-smokers, the CART analysis showed an increased risk of CWP for carriers of the SELE rs_5368 variant genotype compared with the common genotype (OR=1.51;95%CI=1.11-2.05, P=0.0069). CONCLUSION The results suggest that the T1559C/rs5368 polymorphism and smoking are involved in the susceptibility to CWP. Further studies are warranted to validate these findings.
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  T3.1 脂质纳米粒递药系统对脑内自噬-溶酶体信号的影响及机制

  黄继云;廖美华;陶蓉蓉;杜永忠;楼宜嘉;韩峰

  2013, 27(S1): 67-68.

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  目的 纳米药物载体可以通过血脑屏障进入脑组织,提高脑内药物浓度,从而达到诊断和治疗的目的。本研究探讨脂质纳米粒递药系统对脑内自噬-溶酶体信号的影响及可能毒性作用机制。方法 用微粒粒度与表面电位测定仪分别测定有或无Rhodamine标记脂质纳米粒的粒径和电位。用活体荧光成像测定脂质纳米粒在小鼠各组织的分布。脂质纳米粒注射后3 h, 24 h, 7 d,取大脑皮层脑组织用于免疫印迹及激光共聚焦显微镜荧光组化,研究脂质纳米粒对脑内自噬-溶酶体信号的影响。结果 血管内皮细胞标志物与Rhodamine标记纳米粒的共定位研究显示,脂质纳米粒在注射3 h后可见于皮层等脑区。脂质纳米粒注射24 h后,我们发现脑内自噬-溶酶体信号明显激活。自噬信号通路相关蛋白P62,Beclin1,LC3Ⅱ蛋白量表达明显上升;溶酶体激活标志物Lamp2和cathepsin B也在本时间点明显增加。此外,电镜结果显示脂质纳米粒注射小鼠脑内可观察到纳米粒的聚集现象。与此相关联,可观察到神经元内有大量自噬囊泡结构,进一步支持免疫印迹和免疫组化的结果。脂质纳米粒注射小鼠的皮质及海马神经元CaMKⅡ(Thr286)及其底物翻译后磷酸化水平也发生变化。结论 脂质纳米粒递药系统可能激活脑内自噬-溶酶体信号的影响,从而可能导致部分神经血管单元组分发生改变。需要进一步对脂质纳米粒递药系统进行优化修饰,尽可能减少其可能引起的神经毒理学效应。
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  T3.2 蛋白激酶C抑制剂对伊马替尼和苏尼替尼导致的心肌细胞毒性的抑制作用

  顾盼;许彦芳

  2013, 27(S1): 68-68.

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  目的 研究蛋白激酶C(PKC)对酪氨酸激酶抑制剂类(TKI)药物甲磺酸伊马替尼和苹果酸苏尼替尼(SU)的心脏毒性的影响。方法 实验采用离体培养新生大鼠心室肌细胞(NRVM),不同浓度甲磺酸伊马替尼(TM, 1,5,10 μmol·L^-1)或SU(2,5,10 μmol·L^-1)与NRVM孵育,分别于24, 48和72 h检测乳酸脱氢酶(LDH)、ATP浓度以及线粒体膜电位。然后分别观察不同PKC抑制剂对上述指标的影响。结果 IM和SU均浓度依赖性的产生明显心肌细胞毒性。表现为10 μmol·L^-1浓度下24 h线粒体膜电位明显降低,24, 48和72 h细胞内ATP随浓度增加而减少以及细胞释放LDH随浓度增加而增加。应用IM和SU的同时孵育PKC非选择性抑制剂BisindolylmaleimideⅠ(Bis-1)100 nmol·L^-1可以完全取消IM和SU所致的线粒体膜下降、ATP含量减少以及LDH释放,而Bis-1本身并不影响正常NRVM上述指标,提示PKC信号通路的激活参与IM和SU所致的心肌细胞毒性。已知心肌细胞存在多种PKC亚型,我们进一步观察PKC亚型抑制剂或合成肽对心肌细胞毒性的影响。结果显示, PKCα抑制肽 (500 nmol·L^-1) 对IM和SU所致的上述细胞毒性无明显影响;而选择性PKC-抑制剂Rotterlin (500 nmol·L^-1)、PKCε抑制肽(500 nmol·L^-1)可以完全对抗IM和SU所致的线粒体膜电位下降、ATP水平下降以及LDH升高,PKCε抑制肽的阴性对照组则无此作用。结论 在离体培养大鼠心室肌细胞,TKIs药物IM 和SU可产生线粒体膜电位下降、ATP下水平降以及LDH水平升高等系列毒性。选择性抑制PKC-和PKCε(而不是PKCα)可显著对抗IM 和SU所致的细胞毒性。结果提示TKI的心脏毒性机制可能与其导致特定的PKC亚型表达异常增高有关,抑制这些PKC亚型可望有效防治TKI类药物的心脏毒性。
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  T3.3 PGC-1α在多柔比星心肌细胞线粒体毒性中的机制

  袁海涛;郭家彬;张廷芬;侯明月;赵君;LIJin;PaulCaRMICHAEL;彭双清

  2013, 27(S1): 68-69.

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  目的 多柔比星(DOX)是临床上最为常用的广谱、高效抗肿瘤药物之一,但其明显的心脏毒性严重限制了它的临床应用。DOX的心脏毒性机制至今仍不清楚,目前认为DOX心脏毒性主要是由与其代谢过程中产生大量的活性氧自由基(ROS)有关。心肌线粒体是DOX心脏毒性作用的主要靶标之一。近年来研究提示,DOX诱导的心肌损伤与线粒体生成破坏及线粒体功能紊乱密切相关。过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子(PGC) 家族蛋白是调节线粒体新生的核蛋白管家调节子,其中PGC-1α可能是最关键的因子,但PGC-1α是否参与了DOX心肌细胞线粒体毒性中的作用尚不清楚。本研究旨在阐明PGC-1α在DOX心肌细胞线粒体毒性中的作用及可能机制。方法 选用人源心肌细胞系AC16细胞为模型,应用MTT法检测DOX的细胞毒性,采用高通量筛选从线粒体密度、线粒体氧化应激(MnSOD)两方面检测DOX的线粒体毒性,采用Western blot检测DOX对线粒体新生相关蛋白(PGC-1α, NRF-1)表达的影响。结果 MTT法显示DOX对AC16细胞的半数抑制浓度为5uM,高通量筛选和Western Blot结果表明DOX在低剂量可引起AC16细胞线粒体密度增加,MnSOD表达增加,线粒体新生相关蛋白(PGC-1α和NRF-1)表达增加,在高剂量可引起细胞线粒体密度降低,MnSOD表达减少,线粒体新生相关蛋白(PGC-1α和NRF-1)表达减少。同时DOX可引起线粒体ATP生成呈剂量依赖性下降。敲除PGC-1α后, DOX对AC16细胞的细胞毒性明显加重,线粒体损伤更为严重。结论 在较低剂量DOX作用下,可能通过激活PGC-1α增加线粒体新生,对抗DOX的毒性作用;在较高剂量DOX作用下,可抑制PGC-1α的表达,线粒体新生减少,细胞失代偿,进而产生毒性。
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  T3.4 中药知母皂苷组分A3的肝毒性机制

  武之涛;盛晶晶;戚新明;任进;黄成钢;潘国宇

  2013, 27(S1): 69-69.

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  目的 阐明知母皂苷(A3)的肝毒性机制,为临床上知母的合理用药提供科学指导,避免潜在的药物安全性隐患。方法 体外细胞实验,采用大鼠肝原代三明治培养技术,分别在mRNA、蛋白质和功能水平研究了A3对于肝细胞胆酸相关转运体和代谢酶的影响;考察了实验组和对照组之间在肝细胞活力、氧化应激(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)释放、线粒体膜电位(MMP)变化等方面的差异;体内动物实验,SD大鼠连续灌胃给药A3(100 mg·kg^-1)7 d后,与对照组在血液生化学、病理学方面进行比较。结果 细胞实验中,A3可以引起胆酸摄取和外排型转运体、胆酸合成酶的下调,并降低肝细胞对胆酸的外排,而N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够减弱这种作用;A3能够剂量依赖性致使肝细胞活力下降,并导致ROS的发生和LDH的释放。大鼠在连续给药7天后,其血液中总胆酸、总胆红素含量明显上升,ALT和AST亦有升高,病理组织切片显示有空泡化和肝细胞凋亡现象。结论 A3能够致使肝损伤,而这种作用是由于导致了肝胆酸淤积的发生,继而引发ROS的产生,造成了肝细胞的凋亡。
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  T3.5 喹烯酮诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其作用机制

  张朝明;代重山;汤树生;王丛丛;张燊;邓思君;周延;杨夏云;肖希龙

  2013, 27(S1): 69-70.

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  目的 探讨活性氧(ROS)在喹烯酮诱导HepG2细胞凋亡过程中的作用及其可能机制,为其安全性评价提供新的理论依据。方法 噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞存活率;Hoechst33342/PI荧光染色法检测细胞凋亡形态;流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI标记法定量检测细胞凋亡率;DCFH-DA和DHE荧光探针检测细胞内的活性氧水平;Rhodamine 123染色法检测线粒体膜电位的变化;蛋白免疫印迹检测凋亡相关蛋白的表达变化。结果 喹烯酮对人肝癌HepG2细胞有明显的生长抑制作用且在一定范围内具有浓度-时间依赖性,24和48 h的IC₅₀分别为9.2和6.7 mg·L^-1。Hoechst33342/PI荧光染色结果显示,喹烯酮处理后,HepG2细胞形态表现为体积变小,核致密浓染和凋亡小体形成等典型的凋亡形态。DCFH-DA和DHE探针法检测结果表明,不同浓度喹烯酮作用HepG2细胞24 h后,细胞内活性氧水平显著升高,5.0, 7.5和10 mg·L^-1喹烯酮作用细胞24 h后,细胞内H₂O₂水平(以FITC平均荧光强度表示)分别为54±5.53,64±4.65,172±5.82,与对照组46±3.20相比,各组均高于对照组的荧光强度(P<0.05),细胞内O₂^-水平(以PE平均荧光强度表示)分别为209±22.35, 262±20.27, 314±27.82,与对照组159±18.36相比,各组均高于对照组的荧光强度(P<0.05),抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能显著抑制喹烯酮诱导的细胞内活性氧水平的升高。Rhodamine 123染色结果显示,喹烯酮处理12 h后,细胞线粒体膜电位下降,而NAC能阻断喹烯酮引起的线粒体膜电位的下降。AnnexinⅤ-FITC/PI流式检测结果显示,10 mmol·L^-1 NAC+12.5 mg·L^-1喹烯酮同12.5 mg·L^-1喹烯酮相比,早期凋亡比率由10.9±0.55降为3.6±0.43,AnnexinⅤ+/PI+(晚期凋亡或坏死)比率由18.8±0.87减少至2.8±0.42,表明NAC能有效抑制喹烯酮所致HepG2细胞凋亡。蛋白免疫印迹检测结果显示,NAC能显著抑制凋亡相关蛋白胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3、Bid、Bax/Bcl-2和PARP-1的表达及活化。结论 喹烯酮能抑制HepG2细胞增殖并诱导凋亡,其机制可能与活性氧的升高有关。
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  T3.6 Overall strategy for toxicology program of drug development and registration

  ZHANG Yun

  2013, 27(S1): 70-70.

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  It is well known that toxicology strategic plan is critical for successful non-clinical safety evaluations of drug development. An appropriate toxicology program needs to be developed based on the compound class/indication to support clinical trials and regulatory needs without any delays or gaps, and this challenge will be illustrated through specific examples. International Conference on Harmonization guidance M3 revision (ICH M3R2) and the latest Questions & Answers provide a global regulatory guideline for key aspects of non-clinical safety program. It is important to truly understand the ICH M3R2 at early stages of its implantation and to use it as a basis to best dialogue with the global regulatory agencies. To achieve that, the ICH M3R2 and relevant documents should not only be read thoroughly but also should be interpreted with hands-on experience. While it is a trend for more medical products from China to penetrate rapidly and smoothly into international markets, it is helpful to share insights in the ICH M3R2 combined with personal experience obtained from the US biopharmaceutical industry, particularly for major changes and new topics in the revision, with new drug R&D personnel in China. These significant modifications in the revision, including differentiation of exploratory clinical trials from full development studies, timing/duration/reversibility assessment and top dose selection for toxicity studies, metabolite testing, requirements for women of childbearing potential (WOCBP) and pediatric populations, photosafety and abuse liability testing, and requirements for fixed-dose combination drugs (FDC), will be discussed.
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  T3.7 Ocular toxicity and advances in its detection

  Edward CHOW

  2013, 27(S1): 70-71.

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  Vision loss is among the most dreadful chronic handicaps for most people. Ocular toxicity is an important potential cause of vision loss besides ocular injuries and diseases. Ocular toxicity is known to be caused by a wide variety of agents including industrial chemicals (eg, acids/alkalis, oxidizing agents, and alcohols), environmental chemicals (eg, lead, methylmercury, and pesticides), pharmaceuticals (eg, steroids and anticholinergics), and even herbal medicines (eg, canthaxanthine and ginkgo biloba), and is therefore a very important area for toxicologists. As a result of diligent screening, most chemicals that can cause severe acute ocular effects have either been eliminated from industrial and commercial usage or are tightly controlled for proper use. However, subtler ocular effects that are not easily detectable in acute ocular screening assays can lead to eventual significant vision deficits. Fortunately, the eye is a uniquely transparent organ that allows for easy access and modern technological advances now enable us to evaluate ocular structure and function in both the anterior and posterior chambers of the eye through non-invasive means. For the anterior chamber, common assessments now include slit-lamp biomicroscopy, pachymetry, tonometry, and specular microscopy. For the posterior chamber, available techniques include indirect ophthalmoscopy, electroretinograhy, and spectral domain optical coherence tomography. These endpoints of interest and agents which can alter the endpoint will be discussed along with the strengths and limitations of these tools as illustrated by specific examples.
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  T3.69 参附配伍心脏保护作用可能通过细胞色素 P450 2J3介导

  肖勇;马增春;王宇光;谭洪玲;赵永红;梁乾德;汤响林;肖成荣;高月

  2013, 27(S1): 104-104.

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  目的 通过观察人参、附片、参附注射液对心肌细胞的影响,从细胞水平研究参附配伍的减毒作用。方法 在实验过程中,人参、附片、参附注射液分别单独处理心肌细胞,然后观察细胞存活率、LDH释放率、原代心肌细胞搏动频率、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7酶活性、细胞凋亡和CYP2J3 mRNA表达水平。结果 参附注射液(37, 75 g·L^-1)处理后的H9c2心肌细胞存活率要高于附片注射(25, 50 g·L^-1)。与附片注射(50 g·L^-1)相比,参附注射液(75 g·L^-1)处理后的H9c2心肌细胞LDH释放率显著降低。参附注射液(150 g·L^-1)处理4 h时显著减轻了附片注射(100 g·L^-1)诱导的原代心肌细胞自发搏动频率。与附片注射(12, 25 g·L^-1)相比,参附注射液(18, 37 g·L^-1)有效降低了胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7酶活性。细胞凋亡检测也同样表明参附注射液(9, 37 g·L^-1)的细胞凋亡要小于附片注射液(6, 25 g·L^-1)。同时,附片注射液下调了CYP2J3 mRNA表达水平,而人参、参附注射液则出现上调,结论 参附配伍心脏保护作用可能通过CYP2J3介导,可为参附配伍减毒提供依据,但其配伍减毒的深入机制需进一步研究。
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  T3.70 PCA试验中SD大鼠和Wistar大鼠对卵蛋白和牛血清白蛋白敏感性的差异

  欧梁;宋莹;李萍;邱玉文;黄芝瑛

  2013, 27(S1): 104-105.

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  目的 比较被动皮肤过敏试验(PCA)中,SD大鼠和Wistar大鼠对卵蛋白和牛血清白蛋白敏感性差异。方法 SPF级SD大鼠和Wistar大鼠,卵白蛋白、血清白蛋白、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,隔天腹腔注射给药1次,共3次,并在末次药后12 d腹主动脉取血制备抗血清。取另一批大鼠分为SD大鼠牛血清白蛋白组(注射Wistar大鼠牛血清白蛋白抗体血清)、SD大鼠卵白蛋白组(注射SD大鼠卵白蛋白抗体血清)、Wistar大鼠白蛋白组(Wistar大鼠牛血清白蛋白抗体血清)和Wistar大鼠卵白蛋白组(注射SD大鼠卵白蛋白抗体血清)4组,动物于被动致敏后24 h,动物经相应抗原激发,激发后30 min解剖,观察动物背部致敏部位产生的蓝斑直径大小和蓝斑阳性比例高低,并以其作为判断标准。结果 PCA反应时出现的蓝斑大小依次为:Wistar大鼠卵蛋白组 >SD大鼠卵蛋白组 > SD大鼠白蛋白组 > Wistar大鼠白蛋白组。蓝斑阳性率依次为:Wistar大鼠卵蛋白组 >SD大鼠卵蛋白组=SD大鼠白蛋白组 >Wistar大鼠白蛋白组。注射卵蛋白组动物平均蓝斑直径显著大于注射白蛋白组动物(P<0.05),蓝斑阳性比例高于白蛋白组。结论 SD和Wistar大鼠对卵白蛋白敏感度比牛血清白蛋白高;SD大鼠对牛血清白蛋白敏感度比Wistar大鼠高,Wistar大鼠对牛血清白蛋白不敏感。Wistar大鼠给予异品系SD大鼠的卵蛋白抗体血清致敏。建议PCA试验时实验动物使用Wistar大鼠,致敏原和阳性药使用卵蛋白。
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  T3.71 PGC-1α信号通路在对乙酰氨基酚所致肝细胞毒性中的作用

  张廷芬;袁海涛;郭家彬;侯明月;刘杰;赵君;LI Jin;Paul CARMICHAEL;彭双清

  2013, 27(S1): 105-105.

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  目的 对乙酰氨基酚(APAP)是一种广泛使用的解热镇痛药,但是其过量服用可引起严重的肝损伤甚至死亡。线粒体是APAP致肝细胞损伤的重要靶标,PGC-1α介导的线粒体生成有可能在调节APAP肝损伤中发挥重要作用。方法 HepG2细胞给予不同剂量APAP(0, 0.5, 1, 2, 4和8 mmol·L^-1)处理24 h后,通过检测细胞存活率(MTT法)和LDH的漏出;分别暴露于不同剂量APAP(0, 0.5, 1, 2, 4和8 mmol·L^-1)12 h和暴露于APAP 4 mmol·L^-1不同时间(0, 6, 9, 12, 36和48 h)后检测细胞内GSH水平;暴露于不同剂量APAP 24 h后,通过检测PGC-1α及下游分子的RNA水平、蛋白水平表达水平证实APAP对PGC-1α信号通路的影响;通过荧光探针MitoSOX检测线粒体中ROS的生成,试剂盒检测ATP合成水平;通过在DNA水平检测线粒体拷贝数,以观察APAP对线粒体生成功能的影响。结果 APAP可剂量依赖性地降低细胞存活率、增加LDH漏出,可产生明显的细胞毒性;GSH水平随剂量和时间的增加呈先递增后递减的趋势,分别在暴露于APAP 12 h后在2 mmol·L^-1为最高值,暴露于APAP 4 mmol·L^-1在9 h时达最高值,以及ROS的生成呈APAP剂量依赖性升高,表明APAP一定程度破坏了细胞的抗氧化系统;PGC-1α, NRF-1和TFAM的mRNA和蛋白表达水平随APAP剂量的增加先升高后降低,其中在mRNA水平,NRF-1升高的差异最为显著,其次是TFAM,而在蛋白水平,TFAM升高的差异最为显著,其次是PGC-1α,显示APAP对PGC-1α信号通路的表达有一定的影响;ATP合成呈APAP剂量依赖性降低显示APAP抑制了线粒体功能;线粒体的拷贝数随剂量增加先升高后降低,在0.5 mmol·L^-1时达最高值,但仅在暴露于8 mmol·L^-1时线粒体拷贝数低于对照组,提示线粒体的生成也受到APAP的影响。结论 APAP可剂量依赖性地引起肝细胞损伤和线粒体功能改变,这可能与抑制PGC-1α介导的线粒体生成密切相关。
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  T3.72 全人源和人鼠嵌合抗EGFR单克隆抗体临床前安全性对比

  李伟;林志;齐卫红;梁春男;杨艳伟;苗玉发;汪巨峰;李波

  2013, 27(S1): 105-106.

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  目的 观察静脉给予全人源和人鼠嵌合抗VEGF单克隆抗体对机体产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官及其可逆程度。并比较二者毒性反应的异同。方法 2~3.6岁龄食蟹猴,随机分为7组:溶媒对照组、全人源低剂量组(3 mg·kg^-1)、中剂量组(7.5 mg·kg^-1)和高剂量组(15 mg·kg^-1),人鼠嵌合低剂量组(12/7.5 mg·kg^-1)、中剂量组(12/7.5 mg·kg^-1)和高剂量组(120/75 mg·kg^-1);每周1次,连续13~26周,给药体积均为10~24 ml·kg^-1;末次给药结束后设置4~8周的恢复期,观察停药后观测指标的恢复情况。研究期间观察和检测如下指标:临床症状,对给药部位的刺激性,体重,摄食量,体温,血压,心电图,眼科学,血液学,血清生化,尿常规,以及解剖的大体病理学和组织病理学检查。并进行了伴随毒代动力学和免疫原性研究。结果 全人源单抗低、中、高剂量组分别有2/8只、4/8只和4/8只在试验期间出现濒死或死亡,人鼠嵌合抗体高剂量组组有1/10只动物死亡。两种抗体均产生明显皮肤毒性反应和胃肠道反应。在毒性暴露比较充分的情况下,为了人道对待动物,对严重腹泻和皮肤溃烂动物给予了对症治疗。全人源单抗组动物摄食量有明显减少、体重有不同程度的下降。人鼠嵌合单抗无对摄食和体重无明显影响。二者对对心电图、血压、体温、眼科学未造成影响。未见对注射部位有明显刺激反应。人源单抗由于皮肤的炎症反应、胃肠道毒性较大引起了血液学指标和血清生化学指标的改变(总蛋白、 A/G比值降低、碱性磷酸酶、总胆固醇降低,心、肝、肾功能指标的异常)。人鼠嵌合抗体对血液学和血清生化学指标无明显影响。两种抗体从给药后2周即可检测到抗抗体的产生大多持续到给药结束。胸腺重量降低、肾上腺重量增加,死亡和濒死动物的组织病理学变化集中在皮肤、消化系统、免疫器官、心脏、肾和子宫。正常剖检动物组织病理学变化主要见于食管、皮肤、肾和部分免疫器官。上述毒性在停药后明显好转,具有可恢复性。结论 全人源单抗的药理作用比较强,毒性作用也明显大于人鼠嵌合抗体。在临床使用时应密切关注胃肠道和皮肤的病变。
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  T3.73 心脏特异性表达CYP2E1转基因小鼠在心脏毒性评价中的应用探索

  赵显莉;贺银丽;李洋;高虹

  2013, 27(S1): 106-106.

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  目的 利用具有肝脏毒性的CYP2E1代谢毒性激活药物对乙酰氨基酚(APAP),作用于对心脏特异性表达CYP2E1转基因小鼠,评价其对小鼠肝、肾、心脏等生化指标的影响,以初步探讨该类转基因动物模型心脏毒性评价的特异性。方法 本实验选用5~6周龄的两种转基因动物以及同年龄的C57BL/6小鼠,以生理盐水为对照,灌胃给APAP 400 mg·kg^-1, 动物分组为WT对照组和WT给药组(C57BL/6小鼠)、KO对照组和KO给药组(心脏特异性低表达CYP2E1的mhc-CYP2E1 silence转基因小鼠)、TG对照组和TG给药组(心脏特异性高表达CYP2E1的mhc-CYP2E1转基因小鼠)。给药后24 h眼静脉丛取血,进行血生化检测,观察口服APAP对上述小鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬门氨基酸氨基转移酶(AST)、尿素(UN)、肌酐CREA)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等生化功能指标的影响;同时,采用酶联免疫分析试剂盒测定血清心肌特异性损伤蛋白心肌肌钙蛋白I(cTnI)的含量。结果 1 各基因型小鼠给药后与对照组比较,肝功能指标(ALT和AST)均有显著性升高(P<0.05);肾功能指标(UN, CREA)差异均没有显著性意义(P >0.05);心脏功能指标(LDH, CK, CK-MB): LDH(IU/L)各组均有显著性升高(P<0.05);CK及CK-MB间差异没有显著性意义(P >0.05);2 对于心脏损伤特异的cTnI(ng·ml^-1),在心脏特异性低表达CYP2E1的mhc-CYP2E1 Silence转基因小鼠中,给药组(5.70±2.34)明显低于对照组(18.49±1.26),差异具有非常显著性意义(P<0.01)。3 各基因型给药后组间各指标比较:KO组(5.70±2.34)的cTnI(ng·ml^-1)含量明显低于WT给药组(12.80±5.27)(P<0.05),其余给药组间的各指标均无显著性差异(P >0.05),但TG给药组的CK-MB值与WT给药组相比有增高的趋势。结论 CYP2E1基因心脏特异性低表达可能会改善药物引起的心脏毒性,而其特异性高表达对心脏的毒性作用可能会增大。
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  T3.93 Interlaboratory validation for the in vivo flow cytometric micronucleus analysis method (MicroFlow^®) in China

  CHANG Y;ZHOU C;HUANG F;DK TOROUS;LUAN Y;SHI C;WANG H;WANG X;WEI N;XIA Z;ZHONG Z0;ZHANG M;AN F;CAO Y;GENG X;JIAMG Y0;JU Q;YU Y;ZHU J;SD DERTINGER;LI B;LIAO M;YUAN B;ZHANG T;YU J;ZHANG Z;WANG Q;Ma J

  2013, 27(S1): 117-118.

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  Although inter-laboratory validation efforts of the flow cytometry (FCM) based in vivo micronucleus (MN) assay have taken place in the EU and US, none have been organized in China. Therefore a high profile, inter-laboratory study was coordinated to validate the in vivo flow cytometric MicroFlow® method for enumerating micronucleated reticulocytes (MN-RETs) in rat blood. The ultimate goal is to offer data to support revision of the China FDA guideline to approve the use of FCM in GLP studies. The degree of correspondence between MN-RET measurements in blood generated by FCM and micronucleated polychromatic erythrocytes (MN-PCEs) in bone marrow using microscopy was evaluated. Assay reliability and reproducibility were confirmed among eight laboratories using four known genotoxicants. Flow cytometric MN-RET measurements for each blood sample were performed at three separate sites (2 in China and 1 in the US). Exposure occurred on 3 consecutive days, and blood and bone marrow were obtained approximately 24 h after the final treatment. MN-RET frequencies were determined based on analyzing approximately 2000 PCEs (microscopy) and 20 000 RETs (FCM). Each genotoxic agent caused statistically significant dose-dependent MN increases. Spearman's correlation coefficient (rs) for MN-RET versus MN-PCE measurements was 0.723, indicating high correspondence between methods and compartments. The rs value for all FCM MN-RET measurements performed at collaborative laboratories was 0.940, and between Chinese laboratories with reference laboratory was 0.933, suggesting the automated method is highly transferable between laboratories. The FCM MN analysis method would therefore be recommended for evaluating the in vivo genotoxic potential of test chemicals.
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  T5.20 王浆酸对辐射危害的辅助保护功能

  徐军;刘协;张颖

  2013, 27(S1): 153-153.

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  目的 研究王浆酸对辐射危害的辅助保护功能。方法 健康雄性ICR小鼠连续每日经口给予王浆酸,剂量分别为37和73(相当于人体推荐量的10倍)、220 mg·kg^-1,另设辐射模型对照组。灌胃30 d后进行γ射线全身照射1次,照射后继续给予受试物,分别进行外周血白细胞计数实验,小鼠骨髓细胞DNA含量实验,血清溶血素测定实验。结果 实验前各组小鼠体重与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。照射后实验终末与相应的模型对照组小鼠体重相比,各剂量组体重均无显著性差异(P>0.05)。模型组小鼠照射后白细胞数明显减少,与照射前相比差异有显著性(P<0.01),辐射损伤模型成立。照射后第3天各剂量组白细胞总数均高于辐射模型对照组,且低、高剂量组有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。王浆酸可增加照射后小鼠的白细胞总数。各剂量组小鼠血清半数溶血值(HC₅₀)均高于模型对照组,但差异无显著性(P>0.05),王浆酸不具有增强小鼠产生血清溶血素的能力。高剂量组小鼠骨髓细胞DNA含量高于照射模型对照组且差异有显著性(P<0.05),王浆酸可增加辐照后小鼠骨髓细胞DNA含量。结论 根据保健食品对辐射危害有辅助保护功能评价标准,可判定王浆酸对辐射危害具有辅助保护功能。
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  T7.20 氯化镧对大鼠大脑皮质内质网应激凋亡途径的影响

  杨敬华;刘秋芳;巫生文;逯晓波;靳翠红;蔡原

  2013, 27(S1): 193-193.

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  目的 研究氯化镧(LaCl₃)对大鼠大脑皮质内质网应激凋亡途径的影响,探讨LaCl₃对大脑皮质产生毒性作用的机制。方法 40只Wistar雌性成年大鼠随机分成对照和低、中、高剂量LaCl₃染毒组,低、中、高剂量LaCl₃染毒组孕鼠在产仔后分别饮用LaCl₃ 0.25%, 0.50%和1.00%溶液,对照孕鼠产仔后饮用蒸馏水。各LaCl₃染毒组子代大鼠在断乳前吸吮母乳染镧,断乳后自行饮用LaCl₃ 0.25%, 0.50%和1.00%溶液1个月。取子代大鼠的大脑皮质,采用流式细胞仪测定大脑皮质细胞凋亡率,采用免疫印迹(Western blotting)法检测大脑皮质葡萄糖调节蛋白-78(GRP-78)、磷酸化的PKR样内质网调节激酶(p-PERK)、C/EBP同源性蛋白(CHOP)、磷酸化的纤维醇需求酶-1(p-IRE-1)、磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶3和多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白表达水平。结果 各LaCl₃染毒组子代大鼠大脑皮质细胞凋亡率显著高于对照组,且具有一定的剂量-反应关系。低剂量LaCl₃染毒组子代大鼠大脑皮质GRP-78、p-PERK、CHOP、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶3和PARP蛋白表达水平显著高于对照组,分别是对照水平的1.37倍、1.56倍、1.41倍、1.29倍、1.30倍和1.71倍;中剂量LaCl₃染毒组子代大鼠大脑皮质GRP-78、p-PERK、CHOP、p-IRE-1、p-JNK、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶3和PARP蛋白表达水平均显著高于对照组,分别是对照水平的1.59倍、1.94倍、1.67倍、1.63倍、2.22倍、1.40倍、1.52倍和2.14倍;高剂量LaCl₃染毒组子代大鼠大脑皮质GRP-78、p-PERK、CHOP、p-IRE-1、p-JNK、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶3和PARP蛋白表达水平进一步升高,分别达到对照水平的2.67倍、3.13倍、2.30倍、2.64倍、4.89倍、1.76倍、1.88倍和3.93倍,且显著高于低、中剂量LaCl₃染毒组。结论 LaCl₃染毒造成大鼠大脑皮质细胞凋亡过度的机制可能涉及内质网应激凋亡途径表达增强。
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  T3.94 Improved animal welfare standards in large animal species allows extended periods of inhalation dosing

  S A MOORE;J E PEARSE

  2013, 27(S1): 118-118.

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  Huntingdon Life Sciences (HLS) is a leading non-clinical CRO for respiratory safety assessment, an expertise for which there is currently increasing demand as interest in inhaled delivery of drugs increases. Inhalation administration is the route of choice for a significant number of drugs, notably treatments for asthma and other respiratory tract disorders, but also for a widening range of nonrespiratory diseases, as a means of avoiding extensive first-pass metabolism. This poster focuses on improvements in animal welfare standards for large animal species that allow extended periods of inhaled delivery and thus provide greater safety margins when drugs progress to the clinic. The methodology for dogs employs a new type of minimal restraint rather than the traditionally used and restrictive sling method. The success of this technique lies in the effective daily training of the dogs to the inhalation dosing suite, face mask, harness and air over a preceding 14 d period prior to any animal exposure. This methodology minimises stress and discomfort to the animals involved, allowing longer periods of dose delivery, improving study conduct and easier interpretation of results. So far, HLS have been able to administer inhaled dose continuously for up to 6 h. The methodology for non-human primates involves a pre-dose acclimatisation period to the inhalation dosing suite, face mask, chairs and air; in additional, other "distraction methods" are used. The use of toys and videos are provided with training commencing in advance of the inhalation dose acclimatisation procedures. The primates usually play with the toys for a few days and then stop playing with the toys, preferring to watch the video cartoons. The fixation that that the primates have with the cartoons allow for easier training to the inhalation dosing procedures, making extended periods of dosing possible. The same type of methodology can also be applied for the dosing of mini-pigs, a species increasingly used for respiratory safety assessment studies. In this species, rather than using toys and videos to aid acclimatisation, the mini-pigs are given a small edible treat in advance of each session.
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  T3.95 Validation of a capillary micro-sampling technique in pharmacokinetic studies in mice

  SUN Kai;WU Xiao-qin;HUANG Sun-feng;XIN Jian;ZHONG Sheng;ZHANG Yi;LU Wen-zhe;Frances WANG;Joe ZHANG

  2013, 27(S1): 118-119.

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  OBJECTIVE In order to reduce animal use and alleviate animal pain in in-life procedures, the potential application for micro-sampling in pharmacokinetic (PK) studies was investigated in mice. METHODS CD-1 or BALB/c mice were orally or intravenously administered with model compounds at the dose of 1 mg·kg^-1 iv or 10 mg·kg^-1 po. Blood samples were collected at 0.083 (only for iv dosing), 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 7 and 24 h post-dose (n=3 per time-point) via the saphenous vein for PK evaluation. In micro-sampling method, only 30 μl/sample of blood were collected using capillary tubes (Drummond Scientific). A 150 μl/sample of blood was collected using the normal sampling method. The LC/MS/MS system consists of a Shimadzu Nexera UHPLC, RP-18 column at 25℃, and AB SCIEX TRIPLE QUAD 5500. A binary gradient program with a flow rate of 0.8 ml·min^-1 was used to analyze the plasma samples. Injection volume was 1 μl. Analytes and internal standards (0.2 μmol·L^-1 tolbutamide) were detected by the MS using multiple reaction monitoring in positive electrospray ionization mode (Analyte 1.5.2). RESULTS For each of the five compounds, plasma concentration vs. time curves and PK parameters (AUC, C_max, T_max, clearance, T_1/2, bioavailability, etc.) were compared between the micro-sampling and normal sampling methods. Plasma PK profiles of each compound generated by both methods were well matched. In addition, compared to the normal sampling methods (e.g. tail-vein bleeding, retro-orbital puncture), micro-sampling via the saphenous vein significantly alleviated pain in animals. The volume of blood withdrawn was reduced by 80%, and the number of mice required for a PK study was decreased by 65%. CONCLUSION The micro-sampling method can replace normal blood sampling methods. Using this method, the animal welfare will be significantly improved in terms of alleviating animal pain and reducing animal use.
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  T3.96 Primate origin and potential implications in nonclinical safety evaluation

  Friedhelm VOGEL

  2013, 27(S1): 119-119.

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  Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) are purpose bred for research in various countries (of origin), e.g. China, Vietnam, Cambodia, Indonesia, Philippines, Mauritius etc. This however includes countries which do not belong to the natural habitat of the cynomolgus monkey, e.g. Mauritius and China. In Mauritius, the cynomolgus monkey was introduced several hundred years ago by escaping from sailing ships and is today considered a "pest", as natural enimies are missing. In Asia, the cynomolgus monkey is not endemic to China, because it does not adapt very well to cold winter weather; nevertheless there are numerous breeding centers in China today which rather obtained their broodstock from various countries like Vietnam and Cambodia. Some populations from which breeders were originally derived are island populations and thus pretty isolated (e.g. Philippines and Mauritius), other populations are on "Mainland Asia" and have considerable exchange of genetic background across borders. Should the origin be considered when designing a study? Is there a difference in suitability for particular studies? How are specific parameters affected by origin? The potential impact of "origin" on scientific study objectives, comparability of data and studies and evaluation of reference data is discussed.
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  T4.7 流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的方法学探讨

  陈东亚;杨明晶;陆罗定;俞萍;徐军;卞倩

  2013, 27(S1): 124-125.

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  目的 探讨利用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球能力试验方法的灵敏性、稳定性以及易操作性,以期获得一套最优化的方案。方法 ① 不同细胞浓度、微球浓度和孵育时间的摸索: 三块六孔板,上排每孔加1 ml制备的腹腔原液,下排每孔加1 ml经Hank液1:1稀释的腹腔液[巨噬细胞数为(1~2)×10⁸ L^-1],每板第1列每孔加经1%BSA预调理的荧光微球1.1 ml,第2列每孔加2.2 ml,第3列每孔加3.3 ml,即微球浓度分别为5×10⁶/孔、1×10⁷/孔和1.5×10⁷/孔。三块板分别于37℃二氧化碳细胞培养箱避光孵育1, 1.5和2 h后,弃上清,每次使用2.0 ml 4℃ PBS缓冲液轻轻洗涤2次,去上清后再加入4℃ PBS缓冲液0.5 ml,用细胞刮刮下贴壁细胞,轻轻吹打均匀后经75 μm过滤器过滤后上机分析。② 不同消化方法对吞噬率的影响: 1块六孔板,腹腔巨噬细胞原液加荧光微球2.2 ml孵育1.5 h,上排每孔加2 ml 0.25%Na₂EDTA-胰酶消化液,下排每孔加2 ml 0.02% EDTA消化液,37℃消化30 min,收集细胞,常规洗涤后,经75 μm过滤器过滤后上机。结果 微球浓度越高,吞噬率和吞噬指数越大;细胞浓度为(1~2)×10⁸ L^-1,孵育时间1.5 h,微球浓度为1.5×10⁷/孔时吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)最高(89.9%,1.54),孵育至2 h时出现下降(57.7%,1.51);细胞浓度对吞噬率和吞噬指数的影响与荧光微球浓度呈负相关。贴壁巨噬细胞经胰酶加EDTA消化后PP为44.5%,PI为0.68,单独使用EDTA消化后PP为37.9%,PI为0.57,均低于使用细胞刮刀处理组。结论 将增强免疫力功能评价方法实验条件设置为:巨噬细胞浓度为(1~2)×10⁸ L^-1,孵育1 h,1×10⁷/孔微球浓度可使实验快速而又精确的反映巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数,减少人为因素对结果的影响,结果更为客观。
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  T4.8 蝇蛆多肽对H₂O₂诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用

  朱丽;王攀;秦启联;张寰;伍一军

  2013, 27(S1): 125-125.

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  目的 探讨蝇蛆多肽的抗氧化损伤作用机制,为更好地开发蝇蛆提供理论依据。方法 通过中性蛋白酶水解蝇蛆干粉得到蝇蛆多肽(PHNP)。细胞分为对照组(仅培养基作用),H₂O₂组(H₂O₂ 400 μmol·L^-1作用2 h),PHNP预处理组(PHNP 2.5, 5, 10 mg·L^-1预处理24 h后,H₂O₂ 400 μmol·L^-1作用2 h)和维生素C预处理组(10 μmol·L^-1 VC预处理24 h后,H₂O₂ 400 μmol·L^-1作用2 h)。MTT方法检测各组的细胞活性;V-FITC/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡,WST-1法检测细胞内SOD酶活性,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平,TBA方法检测细胞内MDA水平,细胞色素c的细胞免疫荧光方法检测细胞内线粒体形态,罗丹明123染色检测细胞内线粒体膜电位。结果 给予H₂O₂显著抑制HepG2细胞增殖,促进细胞凋亡;同时H₂O₂显著提高胞内ROS和MDA含量,导致线粒体片段化和线粒体膜电位降低,从而造成线粒体功能障碍;并显著性地降低胞内SOD酶活性。而维生素C和不同浓度PHNP预处理24 h,能够回升细胞内SOD酶活性,抑制细胞内ROS和MDA的过量升高,恢复线粒体正常形态和线粒体膜电位,从而抑制细胞凋亡,恢复细胞增殖,且都呈现剂量效应依赖性。其中PHNP 10 mg·L^-1的保护作用与维生素C 10 μmol·L^-1相当。结论 PHNP一方面通过清除胞内ROS水平,降低MDA含量,恢复线粒体功能;另一方面通过提高胞内抗氧化酶活性,从而抑制细胞凋亡,恢复细胞增殖,起到抗氧化损伤的作用。
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  T3.97 Comparison of the freely-moving telemetry Chinese Miniature experiment pig and Beagle dogs in cardiovascular safety pharmacology studies

  YUAN Hai-tao;ZHAO J;GUO JB;CUI YX;FENG M;WU RQ;ZHANG TF;RONG J;GUO Q;ZHANG LJ;HUANG C;PENG Shuang-qing

  2013, 27(S1): 119-120.

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  OBJECTIVE To investigated the effects of gavage administration, daily feeding and circadian cycle on the cardiovascular parameters of both telemetry dogs and minipigs to illustrate whether minipig as an alternative is comparable to dog in cardiovascular safety pharmacology. METHODS Beagle dogs and Chinese Miniature Experiment Pigs were implanted with telemetry transmitters and the influences of the procedures of gavage administration, feeding and circadian cycle on ECG signal quality, blood pressure, heart rate, body temperature and locomotor activity were investigated during a 12-h light/12-h dark recording period. RESULTS The ECG signal quality from telemetry minipig was superior to dog. Decreased ECG signal quality, elevated HR, BP and locomotor activity were associated with the procedure of gavage administration and feeding in both species. The ECG signal quality, BP and locomotor activity were recovered much faster in minipigs than in dogs both after gavage and feeding. A residual elevation of HR was found in minipigs lasting about 4 h post-feeding. There was a clear circadian rhythm of locomotor activity in both species and the minipig was less active during the light period compared to dogs. A significant increased body temperature during the dark period not associated with feeding was observed in minipigs. CONCLUSION Our results indicate that the telemetry freely-moving Chinese experimental minipig is a valuable alternative to beagle dog for cardiovascular safety pharmacology studies.
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  T4.1 营养素可耐受最高摄入量的制定与相关研究进展

  张立实

  2013, 27(S1): 120-120.

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  营养素可耐受最高摄入量是指特定人群平均每日摄入某种营养素的最高限量。即只要摄入量低于"可耐受最高摄入量(UL)",对该人群中的几乎所有的健康个体都不至于产生有害效应。美国食品营养委员会(US FNB)对营养素的需要量和可耐受量进行大量评价后采用了"可耐受最高摄入量(UL)"这一术语。英国维生素矿物质专家委员会(UK EVM)则对维生素和矿物质采用"最高安全限量(Safe Upper Limit,SUL)"的术语。 营养素UL的特殊性 营养素UL值的制定与其他外源性物质限量制定的区别:因营养素摄入较高和摄入较低时均可能存在风险,即存在两条不同的摄入-反应曲线,且相互独立、具有不同的机制和通路,而外源性物质低于界值的摄入一般不造成危害;营养素UL随着年龄、生理特点和特定人群的不同而变化;对于外源性化学物质,一般采用比较保守的不确定系数(即10倍种属差异,10倍个体变异),而营养素不确定系数的设定需考虑多方面的因素综合决定。 营养素UL的制定原则与步骤UL的制定应基于人体在不同暴露情况下发生变化的特征进行评估的结果,即应遵循风险评估的原则和步骤:即危害识别、危害特征描述(剂量反应评估)、暴露评估(包括不确定性的确定)、风险特征描述。 营养素UL的制定的局限 上述风险评估法不适用于尚未发现有不良健康作用的营养素;尚未发现有"无风险摄入量水平"的营养素;现有资料表明,导致风险的摄入量水平与生物所需或对健康有益的摄入量水平有重叠的营养素。 营养素UL制定的方法进展 针对上述局限性,目前各国制定UL值采用了未发现不良健康效应营养素-OSL/HOI法。此方法较适用于尚未发现有不良健康作用的营养素及"非传统性营养素"的UL值制定。
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  T4.2 Assessing and managing health risks from contaminants in food products

  Richard J WENNING;ZHOU Xiao-jian;Joseph RODRICKS;Belinda GOLDSWORTHY;Gavin THOMPSON;Sue BULLOCK

  2013, 27(S1): 121-121.

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  This presentation reviews risk assessment practices in the US and Europe applied to evaluating the concerns arising from contamination of food products. In general, two types of food contamination are most often of concern, each addressed differently using risk assessment. Food contamination by microbial pathogens often involves acute food poisoning, whereas contamination by chemicals typically involves chronic toxicity associated with low-level exposure. Risk assessment models are available for each, to provide information on the extent of the health problem, but prevention and management of the two types of hazard are different. In matters of food safety, legislation and risk assessment in the US and European Union (EU) comply with guidelines set forth in the World Trade Organization (WTO)-Sanitary and Phytosanitary (SPS) Agreement. In the EU, the European Food Safety Authority (EFSA) monitors food safety. Since 2002, EFSA addresses food safety in two steps: scientific assessment (risk assessment), and risk management. In the US, the Food and Drug Administration (FDA) has oversight of the safety of domestic and imported food products, and coordinates this effort with the Environmental Protection Agency, Department of Agriculture and other federal agencies with inspection or oversight responsibilities for production, harvesting and importation. Risk assessment is an integral part of monitoring activities in both the EU and US It begins with good agricultural practices (GAP) and follows through to good manufacturing practices (GMP) for the preparation of processed food products, packaging and distribution, and final delivery to market. Adherence to GAP and GMP, food quality guidelines and good hygienic practices safeguard against possible contamination or adulteration of foods. In the US, FDA is instituting a new regulatory paradigm under Food Safety Modernization Act (FSMA) to move to a preventative rather than reactive system. FSMA will require many food production facilities to institute hazard analysis and risk-based preventative controls (HARPC), which is intended to prevent contamination in susceptible food processes and products. When concerns do arise (eg, a potential economic or inadvertent contamination case), risk assessment is an essential tool for responding to food hazards. Risk assessment addresses not only identification of the hazard, but also the assessment of the potential impact on human health. The potential hazards are qualitatively characterized, quantitatively assessed, and generally evaluated for adverse effects on consumer health. Exposure to potential hazards are evaluated qualitatively and quantitatively based on the extent of consumption of the product, as well as the dose response anticipated with the potential hazard and the target consumer. Risk characterization takes place after identifying the hazard, assessing exposure, and predicting the dose response and involves estimating the adverse effects likely to occur in the consumer population. The severity of the food contamination is factored into the risk characterization. Subsequent to risk assessment, the appropriate risk management procedures should result in safe handling procedures, food processing quality and safety assurance controls, and food quality and safety standards and criteria. In addition, the risk communication process provides consumers with the results of an expert scientific review of alleged food contamination concerns, and provides consumers, the food industry, and government officials with information necessary to prevent, reduce, and minimize future food risks through improvements to food quality and safety processes.
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  T4.3 中国居民反式脂肪酸的膳食暴露评估

  李建文

  2013, 27(S1): 122-122.

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  目的 了解我国主要食品中反式脂肪酸(TFA)含量水平,评估我国居民TFA的膳食摄入水平(包括摄入量和供能比)及其潜在健康风险。方法 (1) 食物样品采集 除前期收集的气相色谱法测定的1021条TFA含量数据外,本研究还在西安、成都、北京、上海、广州5个城市的大中型超市、农贸批发零售市场,现场制售食品摊点等采集焙烤食品、调味品、冷冻饮品、膨化食品、巧克力糖果类、禽肉制品、乳及乳制品、畜肉及制品、油饼油条、植物油、小吃、速食食品、固体饮料共计1925份样品。(2) TFA分析方法 依据样品基质不同,参照不同的国家标准方法测定样品中的13种TFA(GB/T 22223-2008, GB/T 22223-2008, GB/T 22507-2008, GB 5413.36-2010, GB22110-2008)。测定过程中,通过统一色谱柱和标准脂肪酸甲酯混标、定期分析质控样品以及同一样品的实验室间比对等措施进行质量控制,提高分析检测的准确性,降低实验室间误差;膳食调查:采用多阶段整群随机抽样方法,以北京和广州作为大城市代表,分别在两个城市抽取5120名3岁以上居民。采用3 d家庭食物称重法、连续3 d 24 h膳食回顾法和过去3个月内含TFA食物摄入频率调查法进行调查。(4) 膳食暴露评估方法 本次评估采用简单分布模型(确定性评估)方法,计算每个个体每日TFA的摄入水平。首先利用2002年全国居民营养与健康状况调查数据,计算并比较全国不同地区(城市、农村)居民的TFA摄入水平(包括摄入量和供能比),筛选重点地区和人群。然后针对TFA摄入水平最高的大城市居民进行进一步评估(以FAO/WHO建议的供能比不超过1%为标准)。结果 2613份食物样品中,大部分样品的TFA含量较低,低于0.3 g/100 g(以100 g样品中的TFA含量计,下同)的比例为69.5%。13大类食品中,巧克力糖果类食品中TFA平均含量最高,达0.89 g/100 g;植物油TFA平均含量次之,为0.86 g/100 g。焙烤食品、调味品、油饼油条含量在0.30~0.50 g/100 g之间,冷冻饮品TFA平均含量最低,为0.09 g/100 g。基于2002年全国营养与健康状况调查的食物消费量数据,全国总人群的TFA平均膳食摄入量为0.39 g·d^-1,相当于膳食摄入能量的0.16%(即TFA平均供能比),其中城市居民的TFA摄入量(0.52 g/d)和供能比(0.25%)高于农村居民;大城市居民的TFA摄入量(0.53 g·d^-1)和供能比(0.26%)又高于中小城市居民。基于2011年北京、广州两城市的食物消费量调查数据,北京、广州两城市全人群TFA平均膳食摄入量和供能比分别为0.55 g·d^-1和0.30%,略高于2002年大城市居民的TFA摄入量和供能比,其中13~17岁年龄组人群的TFA平均摄入量最高,为0.61 g·d^-1,TFA平均供能比最高的人群为3~6岁年龄组,为0.34%。北京和广州全人群TFA摄入量和供能比的第97.5百分位数(P97.5)分别为1.45 g·d^-1和0.72%,仅有0.42%的人群摄入TFA的供能比超过WHO建议的摄入限值1%。从贡献率看,加工食品是两城市居民膳食TFA的主要来源,占总摄入水的71.2%,其中植物油是各类食品中对膳食TFA摄入贡献率最高的,约占49.8%;其他加工食品的贡献率均较低,糕点、饼干、面包等常见食品的贡献率分别为4.1%, 2.5%和2.3%。天然来源的TFA贡献率为28.8%,液态乳、牛羊肉及制品和发酵乳等分别占12.8%, 11.8%和4.3%。结论 总体来看,我国大部分食品中的TFA含量较低。我国居民膳食摄入的TFA低于FAO/WHO的膳食建议量,健康风险很低。
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  T4.38 广州市儿童青少年膳食反式脂肪酸暴露风险评估

  王萍;闻剑;陈子慧;李宁;刘兆平;李建文;刘爱东;何洁仪;杨杏芬

  2013, 27(S1): 140-140.

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  目的 评估广州市儿童青少年膳食反式脂肪酸摄入状况,了解其主要食物来源,为指导儿童少年合理饮食,促进健康提供科学依据。方法 研究采用横断面调查设计,在广州市城区招募年龄范围在3~17岁的儿童和青少年,采用连续3 d 24 h膳食回顾法和食物频率问卷法调查研究对象膳食中各种食品(尤其是反式脂肪酸含量较高的食品)的摄入情况,计算食品消费量;通过文献收集调查所涉及的各种食品中反式脂肪酸的含量数据;计算膳食反式脂肪酸摄入量和供能比,与WHO推荐值(反式脂肪酸膳食供能比须低于1%)进行比较,并分析其食物来源。结果 本研究共纳入3~17岁调查对象1937人。反式脂肪酸平均摄入量及其膳食供能比分别为0.48 g·d^-1和0.50%,未超过WHO的推荐上限值;而高端消费人群(P 97.5)的摄入量和供能比为1.59 g·d^-1和1.1%,超过了推荐上限值;反式脂肪酸供能比超过1%的人群比例为7.6%。研究人群所摄入的反式脂肪酸中,72.1%来源于加工食品,27.9%为天然来源;最主要的三类食品来源分别为油脂类(29.8%)、烘焙食品(27.6%)、乳类及其制品(22.5%),约占膳食总摄入量的80%,其他来源还包括肉类、油炸或膨化食品、糖果和巧克力等食品。结论 广州市3~17岁儿童青少年膳食反式脂肪酸的平均摄入水平未超过推荐上限值,但仍有部分人群反式脂肪酸供能比超过了1%,存在一定的健康风险,有必要推进营养标签宣传活动,加强学生膳食营养科普教育,引导其养成良好的饮食习惯。
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  T4.39 芦笋提取物安全性评价

  田辉;陈秋华;张寅静;曲敏;张敏;张燕

  2013, 27(S1): 140-141.

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  目的 研究芦笋提取物作为特殊食品的安全性。方法 进行了小鼠急性经口毒性试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验;结果 小鼠急性经口试验MTD值大于20 g·kg^-1;人群推荐剂量333倍剂量对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性;人群推荐剂量100倍剂量给予大鼠30 d口服未发现临床症状、血液临床检查指标、动物脏器以及病理组织学等指标的改变。结论 芦笋提取物符合特殊食品安全毒理学要求。
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  T4.40 红景天洋参片缓解体力疲劳的作用

  张颖;刘协;徐军

  2013, 27(S1): 141-141.

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  目的 研究红景天洋参片缓解体力疲劳的作用。方法 健康ICR雄性小鼠经口给予景天洋参片0, 200, 400和1200 mg·kg^-1 30 d后,分别用小鼠负重游泳实验测定小鼠负重能力、进行小鼠肝中糖原含量、小鼠血清中乳酸含量和小鼠血清中尿素氮含量测定。结果 小鼠负重游泳实验中低剂量组小鼠负重游泳时间比对照组延长,有极显著性差异(P<0.01),红景天洋参片能明显延长小鼠负重游泳时间,从而反映出其能提高运动耐力,即提高了机体对运动的负荷能力。各剂量组小鼠肝糖原含量与对照组值比较差异均无显著性。小鼠血清中乳酸含量测定实验显示中、低剂量组小鼠运动前后三个时间点血乳酸曲线下面积均低于对照组, 分别具有极显著性和显著性差异(P<0.01),红景天洋参片能减少血乳酸曲线下面积,减少运动时血乳酸的堆积。低剂量组小鼠运动后血清尿素氮值低于对照组值,有极显著性差异(P<0.01),红景天洋参片能降低运动后小鼠血清尿素的产生,反映出红景天洋参片能加速机体清除代谢产物,可以加速疲劳的消解。结论 红景天洋参片在本次实验条件下具有缓解体力疲劳的作用。
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  T4.41 基于仿生光子晶体技术的快速检测传感器构建

  洪小迪;陈翔;賽娜;郭纯;周彩虹;彭媛;白家磊;宁保安;高志贤

  2013, 27(S1): 141-141.

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  目的 通过构建基于仿生光子晶体的传感器,建立快速、灵敏的农兽药残留、食品中激素类物质等检测的新技术。方法 1. 构建仿生分子印迹光子晶体传感器:1)将模板分子与单体进行混合,在引发剂作用下进行悬浮聚合,制备出具有模板分子的单分散纳米微球;该纳米微球通过垂直自组装法堆垒成蛋白石结构光子晶体;利用洗脱液去除模板分子;获得分子印迹蛋白石光子晶体传感器。2)制备蛋白石光子晶体模板;将模板分子、单体、交联剂的混合液灌入光子晶体模板上制作好的小腔室中,在引发剂作用下进行热聚合;之后去除光子晶体模板;去除模板分子;获得分子印迹反蛋白石光子晶体传感器。2. 构建仿生可视化光子晶体传感器:将苯硼酸衍生物与其他功能单体一同作为共同功能单体,按一定比例进行混合,在引发剂的作用下进行悬浮聚合,制备出具有苯硼酸基团的单分散纳米微球;将该纳米微球通过垂直自组装法堆垒成蛋白石结构的可视化光子晶体传感器。这些传感器能对对应的检测物进行快速响应,利用光纤光谱仪对发生响应的光子晶体进行测定,最终通过光子晶体响应时反射峰的信号变化来有效的测定各待测物浓度。此外,还可通过肉眼直接观察可视化光子晶体的颜色变化来进行快速初筛检测。结果 通过对实验条件的摸索与优化,成功制备仿生光子晶体传感器。其在检测时能随着检测物浓度的增加发生反射峰红移现象。仿生分子印迹光子晶体传感器检测农兽药残留、食品中激素类物质(己烯雌酚,雌二醇,双酚A,氯霉素等)的浓度范围为:1 ng·ml^-1~1 μg·ml^-1, 响应时间:5~8 min,重复利用:5次以上。仿生可视化光子晶体传感器检测葡萄糖的浓度范围为:3~20 mmol·L^-1,响应时间1~2 min,结构色变化:蓝色变为绿色。结论 构建的仿生光子晶体传感器具有快速、操作简单、低成本、高选择性、高灵敏性、无标记等优点,显示出广泛的应用前景。
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  T6.19 欧盟化妆品安全性要求和化妆品风险评估

  李钟瑞;李霞

  2013, 27(S1): 167-168.

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  欧盟化妆品指令76/768 EEC于1976年正式实施以来,欧盟各个成员国根据该指令相继制定并颁布了本国的化妆品法规,如英国化妆品安全法规 (S.I. 2004/2152)等。由于欧盟指令只是框架协议,加上成员国为适应各自国情而对该指令进行一定的修改和追加特定条款,因此在欧盟内部造成了一定的贸易壁垒,如法国要求所有的化妆品必须到法国毒物中心(Poison Centre)进行备案。英国化妆品法规规定毒理风险评估人必须是特许的生物学家或化学家(Chartered Biologist or Chemist)。有鉴于此,欧盟于2009年通过了第一部化妆品法规(EC)1223/2009, 从而达到规范整个市场,消除贸易壁垒和促进产品流通的目的。该法规第15(1)和(2)条款中关于致癌、致畸和致突变(CMR)禁令已经于2010年09月01日正式开始执行,第16(3)条款关于纳米材料的通告将于2013年01月11日开始执行,其他剩余条款于2013年07月11日正式执行。 鉴于该法规对于产品安全性提出了更高和更加严格的要求,目前为满足指令76/768 EEC所进行的化妆品毒理风险评估(TRA)已经不能够满足该法规的要求。为了帮助化妆品企业更好的理解和遵从相关安全要求,欧盟消费品安全技术委员会(SCCS)颁布了第八版的化妆品组分测试和安全评估指南(The SCCS's Notes of Guidance for The Testing of Cosmetic Ingredients and Their Safety Evaluation 8th Revision)。欧盟化妆品协会和官方机构共同起草了相关指导文件(Draft-Guidelines on Annex I to Regulation (EC) No 1223/2009 on Cosmetic Product Safety Report)供行业内部进行讨论和参考,即将以欧盟决议的形式发表。另外,欧盟化妆品指令76/768 EEC中规定了自2004年09月11日起全面禁止化妆品成品的动物测试,化妆品组分的部分动物测试已于2009年03月11日禁止。重复计量毒性测试、发育和生殖毒性测试和毒代动力学测试目前无可用替代方法,但也于2013年3月遭到禁止。欧盟官方机构和化妆品协会主导和开发了多项体外测试方法以及定量构效关系软件工具等。 毒理关注阈值和混合物毒理和风险评估等最新风险评估理论也得到了验证和应用。 欧盟化妆品法规的实施必然给国内的化妆品出口企业特别是中小型企业带来了严峻挑战,本文探讨新法规实施后对于化妆品安全方面的要求和新风险评估理论的应用并提供了一些可行性建议,帮助企业了解相关安全要求, 从而克服化妆品出口时由相关指令和法规所造成的技术障碍和贸易壁垒。
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  T4.42 Synergistic effect of chrysin and cisplatin on apoptosis in HepG2 cells

  LI Xin;CHEN Mei-fen;CHEN Xiu-juan;LI Qing;WANG Feng-yan;HUANG Jun-ming;YANG Xing-fen

  2013, 27(S1): 142-142.

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  Chrysin(5,7-dihydroxyflavone) exists widely in plants, honey and propolis. The anticancer property of chrysin has been demonstrated though the molecular mechanism is not clear. In this study, we found that pretreatment of chrysin could synergistically promote the cell death induced by cisplatin in human hepatoma (HepG2) cell lines according to the morphological changes and the percentage of sub-G₁ peak. Extrinsic and intrinsic apoptosis pathway all involved in the synergistic effect of chrysin and cisplatin on apoptosis, because the activation of caspase 8 and caspase 9 were observed. In further exploring of mechanism, we found the pretreatment of chrysin could promote the activation and expression of p53 which was downregulated by cisplatin. Then the expression of c-FLIPL and Bcl-2, which are antiapoptotic proteins regulated by cisplatin and were enhanced by cisplatin, were suppressed. All Data from this study thus reveal a novel function of chrysin as an anti-cancer agent and enhance the capacity of cisplatin in clinical application.
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  T4.43 Varacin-1 induces p53-independent apoptosis in human cancer cells by down regulation of XIAP

  LI Wen-li;ZHAO Jing;ZHOU Jing;LU Yi-xin;YANG Xing-fen;HUANG Jun-ming;SHEN Han-ming

  2013, 27(S1): 142-143.

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  OBJECTIVE To explore the potential anti-cancer function and the pathway of Varacin-1(VCA-1), which is an analog of varacin C, an agent known to induce DNA damage. METHODS VCA-1 was synthesized by the chemistry department of NUS, and two pairs of p53-WT/KO human cancer cells, HCT116 and U2OS/Saos2, were used. After treating all cells with designated doses of VCA-1, apoptosis was determined by morphological changes, Hoechst staining, and western blot result of PARP. Intracellular ROS level were measured by CM-H2DCFDA and analyzed by flow cytometry. At the same time, cell protein (p53,caspase-8,caspase-3,XIAP) levels were analysed by Western blot. The transient transfection of XIAP was also performed. RESULTS (1) VCA-1 induces apoptosis in a p53-independent way,which is supported by the facts that the cells with or without p53 displayed similar apoptosis to VCA-1 treatment. (2) VCA-1 induces caspase-8 dependent caspase cascade in apoptosis, because a time-dependent cleavage of caspase-8 and caspase-3 were detected in VCA-1 treated p53-WT/KO cell lines, and pan-caspase inhibitor zVAD was able to suppress PARP cleavage caused by VCA-1 treatment. (3) VCA-1 enhances intracellular ROS production. (4) Evident reduction of XIAP protein level in all four cells lines treated with VCA-1 and significant protection against VCA-1-induced cell death in over-expression of XIAP cells show that XIAP down regulation is critical in VCA-1-induced apoptosis. (5) The fact that a well-known antioxidant NAC completely blocked XIAP down regulation, and hence PARP cleavage, and zVAD successfully blocked VCA-1-induced apoptosis but not XIAP suggests that ROS contribute to XIAP down regulation in VAC-1-induced apoptosis. CONCLUSION VCA-1 induces apoptosis of cancer cells mainly via the extrinsic pathway involving caspase-8 in a p53-independent way, excessive ROS generation plays a fundamental role in VCA-1-induced apoptosis, probably by XIAP down regulation, and consequently promotes caspase activation.
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  T5.1 DNA甲基化在长期低剂量γ射线与镉诱导淋巴细胞交叉适应性反应中的作用

  叶爽;袁德晓;谢月霞;潘燕;邵春林

  2013, 27(S1): 143-143.

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  目的 探讨人B淋巴母细胞在低剂量辐射(LDR)和低浓度金属离子镉(Cd)的长期暴露下所产生的交叉适应性反应,并探讨DNA甲基化在其中的作用。方法 以人B淋巴母细胞HMy2.CIR为对象,长期LDR组细胞每周以γ射线照射3次,每次0.032 Gy,连续4周,并设非照射对照组。长期低剂量Cd处理以CdCl₂ 0, 0.005, 0.01, 0.1 μmol·L^-1连续处理细胞3个月。各组细胞在受到50或100 μmol·L^-1攻击剂量CdCl₂和2 Gy γ射线处理后,用微核形成实验检测细胞适应性反应。同时,以DNA甲基化抑制剂处理细胞,检测DNA甲基化在该适应性反应中的作用。结果 长期低剂量Cd能诱导HMy2.CIR细胞对随后高剂量Cd及γ射线产生适应性反应及交叉适应性反应。当攻击剂量为CdCl₂ 50 μmol·L^-1时,细胞表现出显著的适应性反应,但当剂量增加到CdCl₂ 100 μmol·L^-1时并未诱导细胞产生显著的适应性反应。同时,不同浓度的低剂量Cd长期暴露所诱导的适应性反应程度(MAR)不同,并具有一定的剂量-效应关系。当攻击剂量为2 Gy γ射线时细胞产生的MAR最显著。长期LDR处理同样诱导HMy2.CIR细胞对随后高剂量Cd及γ射线产生适应性反应及交叉适应性反应。当攻击剂量为CdCl₂ 50 μmol·L^-1时,长期LDR处理诱导细胞的MAR最为显著,当攻击剂量为2 Gy γ射线时细胞产生的MAR低于攻击剂量为CdCl₂ 50 μmol·L^-1时的MAR,但当攻击剂量为CdCl₂ 100 μmol·L^-1时,并未诱导细胞产生显著的适应性反应。另一方面,当细胞受到DNA甲基转移酶5-aza-dC的处理后,长期低剂量Cd及长期LDR诱导细胞的适应性反应均消失。结论 长期低剂量Cd及长期LDR均能够诱导HMy2.CIR细胞对随后攻击剂量Cd及γ射线产生适应性反应。细胞产生MAR的大小与预处理剂量和攻击处理剂量的大小密切相关,而DNA甲基化在上述交叉适应性反应中具有重要作用。
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  T5.2 自吞噬对电离辐射之后细胞命运决定中的作用及分子机制

  张士猛;粱楠;刘晓丹;周平坤

  2013, 27(S1): 143-144.

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  目的 探讨自吞噬在电离辐射之后细胞命运决定中的作用及其分子机制。方法 采用慢病毒感染的方法构建稳定敲低p53及对照A549细胞系,用血清饥饿诱导细胞自吞噬,3-MA抑制Beclin 1/Vps34介导的自吞噬,然后用γ射线照射细胞。采用流式细胞检测细胞周期的分布及细胞凋亡率。采用双荧光素酶报告系统检测目的基因的转录活性。结果 p53抑制自吞噬效应蛋白p62/SQSTM1在DNA放射损伤情况下的转录激活,这可能是p53抑制自吞噬的新的分子机制。同时也发现激活自吞噬可以促进电离辐射之后细胞的存活,而抑制自吞噬则可以抑制细胞存活,说明自吞噬在电离辐射之后的细胞命运决定中起着关键作用。进一步研究发现,抑制自吞噬可以抑制电离辐射诱导的细胞周期阻滞,从而揭示了DNA损伤诱导G₂/M周期阻滞及自吞噬诱导细胞存活之间的联系。另一方面,为了研究电离辐射诱导自吞噬的分子机制,采用免疫共沉淀的方法检测细胞内源性Beclin 1与一个抑制凋亡蛋白X的相互作用。蛋白X可以通过结合Beclin 1来抑制其自吞噬活性。结果发现电离辐射可以诱导蛋白X与Beclin 1发生解离。结论 以上研究结果表明,电离辐射诱导Beclin 1与其抑制蛋白X发生解离,从而使得Beclin 1的自吞噬活性得以激活,从而阐明了电离辐射诱导细胞发生自吞噬的新的分子机制;另一方面,自吞噬的激活对可以促进电离辐射之后细胞的存活,而抑制自吞噬可以提高细胞对辐射的敏感性。
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  T5.3 Differential gene expression analysis of TPA/UVC co-treated TK6 cells highlights the importance of inflammatory pathways in TPA-related tumor promotion

  HAN Xing;Kyle P GLOVER;CHEN Zhong-qiang;Lauren K MARKELL;Jean-Francois TOMB

  2013, 27(S1): 144-144.

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  Environmental and chemical carcinogens have been shown to act as both initiators and promoters of cancer. In the present study, we attempted to reveal critical pathways in chemical carcinogenesis that were triggered from converging processes of initiation (via UVC irradiation) and promotion (via 12-O-tetradecanolyphorbol acetate (TPA) treatment) in cultured TK6 cells. Here we show that TPA-pretreated TK6 cells undergo a synergistic increase in apoptosis and delayed γH2AX clearance following DNA damage induced by UVC-irradiation. To elucidate the cellular pathways responsible for the synergistic interaction between TPA-pretreatment and UVC-irradiation we analyzed the global transcriptional profile with RNA-sequencing. Differential expression analysis revealed significantly deregulated genes associated with the combination of TPA-pretreatment and UVC-irradiation (TPA⁺/UVC⁺) compared to either stressor alone (TPA⁺/UVC^- or TPA^-/UVC⁺). To focus our analysis on genes specific to the combined exposure, we filter the gene list for those that occurred in a TPA-dependent dose responsive trend and significantly up- or down-regulated in the TPA⁺/UVC⁺ cells compared to TPA⁺/UVC^- and TPA^-/UVC⁺ (P<0.05, Fold Change>2). We found a set of 84 genes (46 up, 38 down) specific to the combined exposure that are significantly deregulated and likely responsible for the increased sensitivity to UVC-induced DNA damage. Major up-regulated genes include TNFSF4, GDF15, ATF3, SERPINE1, IL29, LIF, FOS, IFNG, SNAI1, NOXA and GADD34a. Major down-regulated genes include POU2AF1, PAX5, GBP1, SPIB, ASK1, GBP6, LYN, TRAF5 and CLIC4. Overall, most genes were connected to pathways important in inflammatory driven carcinogenesis including TNFα, Interferon-γ, TGFβ, AP1, and p53. Here we show that TPA-pretreatment causes an increased sensitivity to UVC-induced DNA damage which is accompanied by an exacerbation of immune/inflammatory pathways that may be important for tumor promotion.
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  T5.4 环境化合物致N²-烷基DNA损伤导致DNA复制错配的分子机制

  张慧东

  2013, 27(S1): 145-145.

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  环境或内源的化学物质或物理过程会损伤DNA。研究聚合酶如何处理这些DNA损伤可以揭示DNA复制错配、错位、突变、细胞死亡、老化和癌症等过程的分子机理,为DNA损伤引起的疾病的治疗提供重要参考依据。酒精、烟、烧烤、农药或其它烷基化剂均可形成N²-烷基嘌呤而改变了DNA的分子结构,然而这些DNA损伤如何影响DNA复制的机制并不清楚,其中的重点和难点是这类损伤是否、以及如何导致DNA复制的错配或中断,这些都是该领域亟待解决的前沿课题。采用Sulfolobus solfataricus DNA聚合酶Dpo4研究了N²-烷基嘌呤 (N²-AlkylG) 对DNA复制错配的影响。通过快速反应技术,发现较小的N²-MeG不影响Dpo4的复制效率和忠实性,但对于N²-EtG或更大的N²-AlkylG,错配率升高10倍以上。dCTP插入效率降低10~100倍,原因是由于降低了DNA聚合酶构型改变的速率。烷基化剂还可以进一步形成N²,N²-二烷基嘌呤,申请人研究了N²,N²-Me2G,发现其复制效率相对于G降低了105倍,阻断了DNA复制,并形成随机突变,说明这类损伤的毒害远远超过N²-AlkylG。为进一步探索其影响复制效率的内在原因,申请者采用了单原子取代的嘌呤(C2位为H, F, O, Br, I),研究其对Y-类聚合酶Dpo4和A-类T7 DNA聚合酶复制效率和错配率的影响,发现DNA复制效率降低的原因不再简单是以前所公认的损伤基团的体积效应,而是损伤基团的电子效应和体积效应的叠加。这些工作为Y-类DNA聚合酶如何复制经过N²-烷基或N²,N²-二烷基DNA损伤,以及如何导致DNA复制的错配和突变提供了系统和深入的认识,也揭示了损伤基团的电子效应和体积效应共同影响DNA聚合酶复制效率的新机制。
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  T5.5 RAN siRNA对辐射诱发基因组不稳定肝细胞凋亡及细胞周期的影响

  党旭红;左雅慧;原雅艺;王超;杨彪;刘建功

  2013, 27(S1): 145-145.

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  目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默RAN基因对基因组不稳定肝细胞凋亡及细胞周期的影响。方法 根据siRNA设计原则设计针对RAN基因的siRNA序列,并构建、包装含有siRNA的慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒感染人正常肝细胞HL-7702,利用实时荧光定量PCR进行RAN基因mRNA水平的检测,从而筛选有效RAN基因siRNA靶序列;将含有有效RAN基因siRNA靶序列的慢病毒感染基因组不稳定肝细胞,利用实时荧光定量PCR检测RAN基因mRNA的表达情况;AnnexinⅤ-APC FCM法检测RAN基因沉默后基因组不稳定肝细胞的凋亡情况;PI单染FCM法检测细胞周期情况。结果 在人正常肝细胞HL-7702中通过实时荧光定量PCR筛选获得有效RAN基因siRNA靶序列;实时荧光定量PCR对慢病毒感染基因组不稳定肝细胞RAN mRNA检测表明,RAN siRNA能有效沉默RAN基因的表达;RAN基因沉默诱发基因组不稳定肝细胞G₁期细胞增加,发生G₁期阻滞;RAN基因沉默后,细胞凋亡百分率(8.50±1.14)%较阴性对照组(41.64±13.45)%明显降低。结论 RAN基因可能通过参与细胞周期调控及促进细胞凋亡进而维持肝细胞基因组的稳定性。
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  T6.9 苯并(a)芘染毒致人支气管上皮细胞和上皮样成纤维细胞周期的变化

  陈文涛;范燕峰;张慧涛;杨瑾

  2013, 27(S1): 162-162.

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  目的 观察苯并(a)芘(BaP)染毒对人支气管上皮细胞(16HBE)和上皮样肺成纤维细胞(W138)细胞周期影响的剂量效应和时间效应。方法 BaP 0, 1, 2, 4, 8, 16和32 μmol·L^-1染毒16HBE和W138细胞24 h,BaP 16 μmol·L^-1染毒16HBE和W138不同时点(0, 1, 2, 4, 8, 12和24 h),BaP 16 μmol·L^-1染毒16HBE和W138 4 h后恢复不同时点(0, 1, 2, 4, 8, 12和24 h),染毒结束后流式细胞术检测细胞周期。结果 与对照组比较,随着染毒浓度和染毒时间的增加16HBE和W138 S期细胞所占比例增加明显(P<0.05);BaP 16 μmol·L^-1染毒16HBE 4 h后恢复2~12 h S期细胞所占比例与恢复0 h组(32.43%)相比明显增加(P<0.05),恢复24 h时S期细胞所占比例(24.52%)与正常组(26.41%)相比无显著性差异(P>0.05);BaP 16 μmol·L^-1染毒W138 4 h后恢复,0~4 h时S期细胞所占比例与正常组(32.42%)相比明显增加(P<0.05),恢复8 h开始减少,24 h时S期细胞所占比例(32.89%)与正常组(32.42%)相比无显著性差异(P>0.05)。结论 BaP染毒16HBE和W138引起细胞S期的阻滞。
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  T6.10 骨形态发生蛋白7拮抗染石英尘大鼠肺纤维化的作用及机制

  王炎;杨耿侠;朱钟慧;牛丕业;高艾;田琳

  2013, 27(S1): 162-162.

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  目的 观察骨形态发生蛋白7(BMP-7)对石英诱导的大鼠肺组织纤维化以及对转化生长因子β(TGF-β)与磷酸化p38MAPK蛋白表达的影响,以探讨BMP-7抑制矽肺纤维化作用的可能机制。方法 雄性Wistar大鼠60只随机分为3组,每组20只,分别为对照组、石英组及BMP-7组。石英组和BMP-7组均一次性气管内注入浓度为50 g·L^-1石英粉尘混悬液1 ml,对照组气管注入同体积生理盐水。BMP-7组于染尘后第8天经腹腔注射BMP-7(300 μg·kg^-1),隔日1次,直至处死,而石英组和对照组给予同体积生理盐水。每组分别于15, 30 d各随机处死10只大鼠,收集肺组织,采用HE染色和Masson染色了解肺泡炎和肺纤维化的情况,用碱水解法测定肺组织羟脯氨酸含量(HYP),Western blot方法检测肺组织TGF-β和磷酸化p38MAPK蛋白的表达。结果 BMP-7组肺组织病理损伤及气道上皮下胶原沉积较石英组减轻,肺组织HYP含量显著降低,TGF-β的蛋白表达明显下调,p38MAPK蛋白的磷酸化水平下降。结论 BMP-7可在一定程度上减轻石英诱导的肺泡炎症反应及肺纤维化进展,对肺纤维化具有一定的抑制作用。BMP-7对肺纤维化的干预机制可能与其抑制石英激活的TGF-β/p38MAPK通路有关。
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  T5.6 微波辐射对主要组织修复细胞的效应及影响

  孙慧勤;杨涛;郝娜;邹仲敏;王钰;程红缨;周青;高鹏;冉新泽;粟永萍

  2013, 27(S1): 146-146.

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  目的 观察微波辐射对其增殖、迁移、凋亡及细胞周期作用的影响,以进一步明确其生物效应及可能的毒理学意义。方法 采用CH310T1/2(小鼠成纤维细胞株)及VE(人肺静脉内皮细胞株)培养,以不同功率(峰值功率密度各为0, 30和90 W·cm^-2,辐照20 min)的微波辐射后,以CCK-8,单层细胞划痕实验分别观测细胞增殖与迁移能力,并通过流式细胞法检测细胞周期的变化以及凋亡细胞的比例。结果 细胞增殖的CCK-8法检测不同功率微波辐照24 h后,30 W·cm^-2组C3H10T1/2 OD值明显高于对照组,48 h无差异,而VE细胞无明显变化;90 W·cm^-2组两种细胞OD值则明显低于对照组。对细胞迁移的划痕实验发现,辐照24 h后:30 W·cm^-2组C3H10T1/2较对照组愈合率高,而VE细胞无明显变化,90 W·cm^-2组两种细胞迁移及愈合率均明显低于对照组。提示30 W·cm^-2辐射早期可促进成纤维细胞的增殖及迁移,而90 W·cm^-2辐射对两种细胞的增殖及迁移则有明显的抑制作用。细胞周期检测见30 W·cm^-2辐照后24 h可引起C3H10T1/2细胞G₁期细胞比例下降(42.4% vs对照49.01%, P<0.05),G₂+S期细胞比例增加,对VE细胞影响不明显;而90 W·cm^-2辐照后24及48 h则引起两种细胞G₁期阻滞,同时还引起凋亡率的明显增加(24 h凋亡率C3H10T1/2及VE各为2.6% vs 0.12, 9.41% vs 6.11%, P<0.05)。结论 不同剂量的微波辐照对成纤维细胞及血管内皮细胞呈现不同效应:30 W·cm^-2辐照对C3H10T1/2细胞早期有促进增殖、迁移及加速进入增殖期作用,但对VE细胞则无明显作用;90 W·cm^-2辐照则明显引起两种细胞G₁期阻滞,抑制细胞的增殖、迁移并增加细胞的凋亡率,提示后者具有明显的损伤作用,值得重视其在微波辐射中的毒理学意义。
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  T5.7 辐射相关肺癌和乳腺癌研究中蛋白组学技术的应用

  冉新泽;粟永萍

  2013, 27(S1): 146-147.

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  蛋白质组学技术主要以双向凝胶电泳和生物质谱技术为支撑平台,生物信息学为桥梁,对蛋白质表达模式和蛋白质组功能模式进行研究。虽然至今尚未发现能预测肺癌进程和疾病分期的可靠标志物及有效的早期诊断指标,但人们可利用二维荧光差异凝胶电泳及后续MALDI-TOF/TOF等技术,检测异柠檬酸脱氢酶1在肺鳞状上皮细胞癌组织中表达是上调的,且与非小细胞肺癌生存率成负相关。与正常个体或肺良性病变相比较,非小细胞肺癌患者血浆中异柠檬酸脱氢酶1显著上升;若敲除异柠檬酸脱氢酶1,则抑制非小细胞肺癌细胞系增殖和减少体内肿瘤的生长,证明血浆中异柠檬酸脱氢酶1可作为非小细胞肺癌诊断和预后的标志物。若联合使用蛋白质组与转录组学方法分析其生物学行为,发现在小细胞肺癌几个受体酪氨酸激酶、PI3K和Ras/MAP/ERK激酶途径活性更低,研究者提出PARP1可作为小细胞肺癌的治疗靶点。蛋白质组学技术在乳腺癌肿瘤标志物的筛选、早期诊断和分类、病情监测、预后判断方面可发挥一定作用。用SELDI-TOF-MS技术检测乳腺癌患者及正常个体的血清蛋白质指纹图谱,筛选乳腺癌特异性蛋白标志物,并结合支持向量机软件建立诊断模型,比较乳腺癌手术前后特异性蛋白的变化,最后发现乳腺癌血清中有3个差异蛋白,并以筛选的3个特异性蛋白质峰的数据构建诊断模型经交叉验证,灵敏性和特异性均达100%。而通过在乳腺癌细胞系MCF-7过表达miR-19a, miR-20a和miR-92-1后应用二维电泳和质谱分析等蛋白质组学技术,发现在乳腺癌中,IMPDH1和NPEPL1是miR-19a的靶基因,这为利用蛋白质组学新技术深入探讨microRNA靶基因提供了有用的范例。当然,蛋白质组学研究及其组学技术目前虽有不少进展,但仍比较缓慢,如部分低拷贝数蛋白质无法检测,疏水性蛋白、相对分子量高的或相对极低的蛋白质、极端酸性或碱性蛋白质无法分离或在电泳过程中丢失等。而随着二维差异凝胶电泳技术和质谱新技术的不断拓展,蛋白质组学技术在阐明辐射相关肿瘤的发生发展机制、辐射相关肿瘤新特异性标志物与药物治疗靶标等方面,越来越发挥出重要的作用。
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  T4.31 瘦素基因启动区-2548 G/A多态性和肥胖的关系——Meta分析

  张岭

  2013, 27(S1): 137-137.

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  目的 探讨瘦素基因(LEP)5'端非翻译区-2548位点上G/A单核苷酸多态性(SNP)与肥胖的关系。方法 用Meta分析法研究LEP -2548 G/A多态性与肥胖的关系;分别采用显性和隐性模型进行分析,计算纳入研究的合并优势比(OR)估计值及其95%置信区间(95% CI),用统计量I²判断各研究间的异质性,用Egger检验来分析发表偏倚。结果 经过哈代-温伯格平衡(HWE)检验后,最后选择了11项研究,包括了5210个受试者(2541名肥胖者和2669名对照)。在显性模型分析中,OR值为1.14(95%CI:0.98~1.31,P=0.08);在隐性模型分析中,合并OR值为1.03(95%CI:0.85~1.25,P=0.76),说明LEP -2548 G/A多态性和肥胖之间没有显著联系。但是,亚组分析时发现,在美洲人群中,GG纯合基因型是肥胖的一个显著性危险因子(OR=1.53(95%CI:1.17~2.00),P=0.0002)。但在其他地区未发现显著性结果。结论 在总人群中LEP -2548 G/A多态性与肥胖之间无相关性,但在美洲人群中,GG基因携带是肥胖一个显著的危险因素。
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  T4.32 肉桂油对小鼠半数致死量的测定

  黄晓晖;谭剑斌;陈思东

  2013, 27(S1): 137-137.

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  目的 研究肉桂油对小鼠的经口半数致死量(LD₅₀)。方法 采用霍恩氏法(Horn's法),随机将小鼠分为4个实验组,肉桂油剂量分别为21.5, 10.0, 4.64和2.15 g·kg^-1,空腹灌胃1次,21.5 g·kg^-1组每次灌胃量为0.3 ml/10 g,其余各组每次灌胃量为0.1 ml/10 g,观察给药后2周内小鼠的毒性反应和死亡情况。结果 雄小鼠经口LD₅₀为6.81 g·kg^-1,雌性小鼠经口LD₅₀为5.84 g·kg^-1(置信区间:4.30~7.94 g·kg^-1)。结论 肉桂油属实际无毒级物质。
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  T7.37 醋酸铅的神经发育毒性机制

  任雁;杨冬华;李丽;邢立国

  2013, 27(S1): 202-202.

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  目的 探讨醋酸铅的神经发育毒性机制。方法 参照OECD神经发育毒性试验指南中的实验方法,SD孕鼠于妊娠第7~18天以0, 150, 300和600 mg·kg^-1剂量醋酸铅经口灌胃给药,对醋酸铅给药后母鼠一般症状和产仔进行观察,对仔鼠断奶前发育标志的变化、个体行为发育以及感觉运动功能和学习记忆相关指标进行观察。结果 醋酸铅600及300 mg·kg^-1可以引起母鼠体重增重减少、并出现立毛、消瘦等异常症状;600 mg·kg^-1剂量组仔鼠存活率降低至54%、门齿萌出、平面翻正反射、空中翻正反射、负趋地实验中的阳性率与对照组相比也有显著性差异,而对嗅觉方向、耳廓分离及睁眼指标未见影响。600及300 mg·kg^-1剂量组仔鼠自主活动总的活动次数及站立次数显著减少(P<0.05,P<0.01)。600 mg·kg^-1剂量组仔鼠抓力显著降低(P<0.05),在3min内跑步的错误次数显著增加(P<0.05)。Morris水迷宫实验中,600 mg·kg^-1剂量组仔鼠穿越平台的次数、游泳时间显著低于空白对照组(P<0.05)。结论 醋酸铅不仅对母鼠具有毒性,对仔鼠也有明显的神经发育毒性作用。
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  T4.34 食品安全问题原因分析

  应贤平

  2013, 27(S1): 138-138.

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  为什么我国的消费者感到食品安全问题越来越多？可能有5方面原因:1,学术层面不够透明,食品安全与否是通过毒理学研究数据及风险评价方法科学推论结果,不同知识和技术推论结果可能不一致,需要学术层面透明讨论才能不断提高食品安全认识水平。学术研讨会、学术期刊等学术内容应该充分发表学术界各种学术观点,才能避免消费者到法院起诉要求公开乳制品标准制定"会议纪要"事件发生,可以减少部分专家把三聚氰胺小鼠LD₅₀与食盐LD₅₀相近就简单地按照毒性分级认为两者对人毒性也基本相同结论,不会出现碘盐补碘过量专业风险评价报告把可耐受最高摄入量(UL)而不是最低风险水平值(MRL)作为起始点(POD)评估特定暴露期限内目标暴露人群人类健康风险筛选工具。风险评价毒理学意义在于用现有科学知识和技术尽力消除毒性检测指标应用中存在不确定性和缺乏生物学科学依据缺点。2,法规层面错乱,合格食品不等同于安全食品,前者是指各项检测指标均符合规定的食品,可以通过法规途径(标准)落实,而后者是指食用人群不会因食品安全性问题导致的食用不良后果,通常只能运用科学方法(风险评价)推断说明。"食品安全国家标准"不应该是指毒物或残留物限值标准,因为食品安全概念代表风险评价结果(诸如食用一辈子不会产生危害),而限值标准主要表示用现有生产技术能够达到并保证单一产品中毒物或残留物毒性作用非常有限(可控)质量要求或标准。区分两种层次标准意义在于告知消费者根据自身需要选择,比如国内现行婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺含量1 ppm标准只是产品限值标准,不是食品安全标准。因为目前仍然无法作出婴幼儿配方乳粉三聚氰胺限值安全标准原因是存在太多不确定性可以消除公众对婴幼儿健康关注,风险评价过程中存在三点主要不确定理由:① 婴幼儿配方乳粉作为唯一营养来源持续使用后果不清楚;② 三聚氰胺及类似物如何交互作用不确定;③ 婴幼儿处在体重快速增长阶段、而肾功能又不成熟,此时影响可能会更大。既是通过"食品安全国家标准相关毒理学试验内容"产品并不能代表食品安全实际结果,两者存在很大距离。3,企业层面困惑,应该让企业发挥承载食品安全生产主体作用。4,媒体层面胡来。5,民众不信任。
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  T6.22 三氯乙烯及其代谢产物致豚鼠皮肤和肝免疫性损伤

  李宏玲;赵娜;宋向荣;刘莉莉;黄永顺;王海兰

  2013, 27(S1): 169-169.

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  目的 研究三氯乙烯及其代谢产物三氯乙酸、三氯乙醇对豚鼠的皮肤致敏和肝脏损伤作用。方法 SPF级白化Hartley豚鼠,雌雄各半,按OECD豚鼠最大值实验法,用三氯乙烯(TCE)、三氯乙醇(TCOH)、三氯乙酸(TCA)分别对豚鼠进行皮内和涂皮结合法致敏实验,并设三氯乙烯、三氯乙醇、三氯乙酸对照组、阳性对照组(二硝基氯苯,DNCB)、空白对照组、观察各组动物皮肤的红斑和水肿等情况,求出致敏率和平均反应值。在终末激发后24 h乙醚麻醉动物,腹主静脉采血,用ELISA试剂盒检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)等肝功能指标;摘取心脏、肝脏、肾脏称重并计算脏器系数;取斑贴部位及临近皮肤,部分肝脏进行病理学检查。结果 在雄性豚鼠中:TCE, TCOH, TCA致敏率分别为70%, 20%, 0%, TCE, TCOH, TCA处理组豚鼠肝/体质量与对照组相比显著降低(P<0.05),TCE处理组豚鼠ALT, γ-GTP与对照组相比显著升高(P<0.05);在雌性豚鼠中,致敏率分别为90%, 50%, 0%,TCA处理组肝/体质量与对照组相比显著降低(P<0.05)。TCE致敏组雌雄豚鼠皮肤病理均可见表皮增厚,真皮层嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润;肝病理可见局灶性坏死,肝细胞肿胀及空泡样变。TCOH致敏组豚鼠皮肤肝脏可见类似病变,但程度较TCE组轻。TCA组未发现病变。结论 TCE为强度致敏物;TCOH为中度致敏物;TCA未见致敏作用。三氯乙烯及其代谢产物致豚鼠皮肤和肝免疫性损伤机制与Ⅳ型超敏反应有关。
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  T6.24 光气吸入染毒对大鼠肺通透性及紧密连接蛋白的作用

  张晓迪;刘瑞;李文丽;陈宏莉;海春旭

  2013, 27(S1): 170-170.

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  目的 探讨光气肺损伤机制。方法 SD大鼠42只,随机分为7组,分别在亚致死剂量(500 ppm×1 min)的光气吸入染毒后0, 1, 3, 6, 12, 24及48 h时间点采用硝酸镧灌注肺组织,Lowry法测定支气管肺泡灌洗液与血浆中总蛋白的含量以计算肺通透指数,采用Western blot法测定肺组织中决定肺血管通透性的紧密连接蛋白的含量。结果 正常大鼠肺组织中,气血屏障完整,可见肺微血管和基膜是完整和连续的,大量的镧颗粒局限于血管腔内,无La³⁺渗出到肺泡腔,同时,血管内皮细胞胞浆内亦未见La³⁺。损伤后3 h时,镧颗粒渗入到血管内皮间隙,沉积于基膜;6 h后,镧颗粒穿过了血管内皮的紧密连接及基膜进入肺泡腔。大鼠肺通透指数提示染毒后3 h开始升高,6 h升高显著(P<0.05),48 h后开始下降。肺组织中紧密连接蛋白Occludin与ZO-1水平出现异常表达,并呈现较为一致的变化趋势,染毒后初期呈下降趋势,6 h下降显著(P<0.05)。结论 光气这种窒息性毒剂在亚致死剂量吸入中毒后,3~6 h为肺水肿初期,在此期之前及时进行早期救治,有望为光气中毒后的救治争取时间从而增加救治效果。
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  T4.36 “G-up”能量饮料的90 d天喂养实验

  刘慧智;邹志飞;许崇辉;程树军;陈永红

  2013, 27(S1): 139-139.

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  目的 评价"G-up"能量饮料的饮用安全性。方法 SPF级NIH小鼠分为"G-up"高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组喂养90 d。结果 在小鼠90 d喂养中,小鼠生长发育正常,生理性活动正常,未见中毒症状;高剂量组小鼠血糖含量明显高于对照组(P<0.01),中剂量组血清总胆固醇及甘油三酯含量皆明显低于对照组(P<0.01);低剂量组小鼠自主活动次数明显高于对照组(P<0.01)。结论 未发现"G-up"能量饮料对实验动物造成损害,该样品对实验动物有一定的抗疲劳的作用。
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  T4.37 三七的亚慢性经口毒性及免疫毒性

  唐娇;赵敏;黄芮;谭剑斌;陈壁锋;胡帅尔;黄建康;李志;杨杏芬;黄俊明

  2013, 27(S1): 139-140.

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  目的 观察三七的急性毒性、亚慢性毒性和免疫毒性,为评价其安全性提供毒理学依据。方法 产自云南文山州的三七作为受试物。进行大鼠经口急性毒性试验、90 d喂养试验,并通过血清溶血素测定试验,NK细胞活性测定试验,ConA诱导的淋巴细胞转化试验,外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的活化水平测定试验,对三七的免疫毒性进行评价。结果 (1)三七SD大鼠经口急性毒性MTD >20.25 g·kg^-1;(2)大鼠亚慢性经口毒性试验给予三七7.500, 2.372和0.750 g·kg^-1,即药典人体推荐量范围下限剂量的50, 16和5倍,实验时间90d,各剂量组动物一般生理体征、行为、大小便、皮毛等均无异常,体重和食物利用率指标正常,血液学指标无异常,血液生化学指标无异常,脏器重量、脏/体比值指标正常,组织病理学检查未见与受试物有关的病理改变;(3)免疫毒性评价试验中,同样以7.500, 2.372和0.750 g·kg^-1的剂量饲喂SD大鼠90 d,实验中半数溶血值,NK细胞活性,淋巴细胞转化能力,外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的活化水平各剂量组与对照组相比均没有统计学差异。结论 三七属于无毒级物质,超高于人用50倍的剂量,不具有免疫毒性。
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  T8.7 吡草醚原药的大鼠致畸性

  刘春霞;万力;王成;刘瑶;唐晓荞;孙凡中

  2013, 27(S1): 209-209.

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  目的 检测妊娠动物接触吡草醚原药后引起致畸的可能性,初步评价吡草醚原药致畸危害程度及NOAEL,为确定其在环境中的暴露参数提供依据。方法 选用的大鼠按雄、雌2:1比例同笼交配,次日清晨阴道涂片检查雌鼠,发现精子即确定为受孕第0天, 设3个剂量组、1个阴性对照组和1个阳性对照组,高剂量为464 mg·kg^-1,中剂量为92.8 mg·kg^-1,低剂量为18.56 mg·kg^-1,阴性对照为1%羧甲基纤维素钠,阳性对照为维生素A。在雌鼠受孕第6~15天灌胃给予受试物,连续共10 d,在妊娠第19.5天,剖腹检查胎鼠是否畸形;将每窝胎鼠的1/2置于Bouins液中固定,检查内脏是否有畸形;另1/2胎鼠剥皮去内脏和脂肪,经染色,透明后检查骨骼是否有畸形。结果 高剂量组(464 mg·kg^-1)和阳性对照组大鼠孕期体重增重值降低,与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.05);中、高剂量组和阳性对照组大鼠吸收胎率与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.05);中、高剂量组和阳性对照组胎鼠重量与阴性对照组比较,差异有显著性(P<0.01);阳性对照组胎鼠外观畸形明显,与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.01);低、中、高剂量组胎鼠外观畸形与阴性对照组比较,差异均无显著性(P >0.05);中、高剂量组和阳性对照组胎鼠骨骼及内脏畸形例数明显增多,与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论 在本实验条件下吡草醚原药对Wistar大鼠的NOAEL为18.56 mg·kg^-1。
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  氡致BEAS-2B细胞体外恶性转化模型建立及其机制

  韦晔;刘玉萍;纪雅慧;李建祥

  2013, 27(S1): 149-149.

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  目的 通过体外染氡,诱发BEAS-2B细胞恶性转化,从而建立氡致肺癌的细胞模型并对细胞恶性转化过程中的机制进行研究。方法 CCK-8法检测各染氡浓度时间后细胞存活率,确定合适染氡浓度及时间后,将永生化人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞分为对照组和染氡组,以每孔细胞1.5×10⁵接种于Transwell培养皿,贴壁后置于气体染毒装置中,氡及其子体持续泵入直接对细胞染毒,检测染氡后代细胞恶性转化情况,流式细胞仪分析细胞周期、凋亡和ROS变化,荧光定量PCR检测DNMT基因表达情况。结果 BEAS-2B细胞在氡持续染毒并传代至第20代已出现形态学改变,生长失去接触抑制,并在软琼脂中独立生长形成克隆。细胞周期显示G₁期明显缩短,S期明显延长,细胞传代后凋亡率均比染氡初期明显降低。细胞染氡后ROS表达量均降低。DNMT3A基因在各染氡代细胞传至40代时表达均明显升高。结论 体外染氡能够诱发BEAS-2B细胞恶性转化,且随染氡及传代代数的增加呈现剂量效应关系。
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  T4.10 不同品系大小鼠食物利用率

  安娟;赵效国;孙建新

  2013, 27(S1): 126-126.

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  目的 研究不同品系大小鼠的食物利用率。方法 选择SPF级Wistar, SD, KM, ICR, BALB/c不同品系大小鼠100只,每品系20只,雌雄各半。饲喂30 d,自由采食及饮水,每48 h更换饲料及垫料。饲料处理:每次称量并记录饲料的添加量及剩料量,每次称量前饲料均在65℃干燥箱干燥2 h, 自然冷却后称量。垫料处理:每次称量并记录垫料的添加量及48 h后垫料的重量(饲喂48 h后的垫料需将大小鼠粪便与垫料分离),每次称量前垫料均在65℃干燥箱干燥2 h,自然冷却后称量。48 h做一次数据处理,每天观察大小鼠健康状况,做好实验记录。不同品系,不同性别大小鼠分笼喂养,5只为一笼共计20笼。结果 不同品系大小鼠实际食物利用率均比原食物利用率大,且均有统计学意义(P<0.05);同种品系雄性大小鼠均比雌性大小鼠的实际食物利用率高;不同生长期大小鼠间的实际食物利用率整体情况处于下降趋势。结论 大小鼠由于磨牙等习性造成食物浪费量对食物利用率造成很大的偏差。
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  T8.5 95%氟蚁腙原药急性迟发性神经毒性

  杨文祥;刘春霞;樊柏林;孙凡中;刘瑶

  2013, 27(S1): 208-208.

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  目的 以成年母鸡(12月龄)为实验动物,对95%氟蚁腙原料进行了迟发性神经毒性的研究。方法 成年母鸡60只,设计剂量为174, 435和1740 mg·kg^-1组,阴性对照组(熟豆油)和阳性对照组(三邻甲苯磷酸酯,TOCP)。染毒后持续观察21 d,记录动物中毒症状和临床表现;21 d后未观察到神经毒性反应。重复染毒1次,继续观察21 d。实验期间观察对动物一般表现、体重、共济失调、血液生化、病理组织学检查等指标进行观察及检测。结果 试验组仅出现一般毒性反应如大便异常、进食减少、精神不振、卧伏等症状,体重减轻,高剂量组TP及CHE异常等,未见明显共济失调等迟发性神经毒性反应;阳性对照组出现明显毒性反应,包括体重下降、明显共济失调症状、大部分生化指标异常以及坐骨神经纤维肿胀、脱髓鞘改变及神经膜水肿等病理改变;阴性对照组各指标均未见明显异常。结论 95%氟蚁腙原药未引起鸡迟发性神经毒性反应。
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  T8.6 双唑草腈原药大鼠亚慢性毒性

  瞿晶菁;刘春霞;付少华;刘瑶;孙凡中

  2013, 27(S1): 208-209.

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  目的 检测双唑草腈的毒性、毒性作用机制和亚慢性毒性。方法 将大鼠随机分为对照、低剂量、中剂量、高剂量4个组,每组20只动物,雌雄各半。每组染毒剂量分别为0, 1.6, 16和160 mg·kg^-1。按照各组不同剂量设计称量不同重量的受试样品先于少量基料混匀,逐级扩大添加基础饲料使受试样品与基础饲料充分混匀后,每天按照相应组别给与不用剂量饲料管饲,连续给饲90 d,期间动物自由饮水。试验每周称一次体重、剩食、计算动物增重、食物利用率,于在试验的0周和13周采集各剂量组动物血液和尿液,分别进行血液常规、血液生化、电解质、血凝、尿液常规检测。试验结束后,测肝、脾、肾、睾丸或卵巢体比, 并进行肝、脾、肾、肠的病理组织学检查。结果 高剂量组老鼠体重增长缓慢,与对照组相比有差异性(P<0.05),且部分脏器系数与对照组比较有差异性(P<0.05)。13周雌性高剂量组总胆固醇的含量升高,甘油三酯含量降低,血清胆碱酯酶含量下降,差异有显著性(P<0.05);雌雄高剂量组网织红细胞与对照组比较差异有显著性(P<0.05),但其结果在正常值范围,无毒理学意义。雌性高剂量组总胆固醇的含量升高,甘油三酯含量降低,血清胆碱酯酶含量下降,差异有显著性(P<0.05);雄性高剂量组血糖含量升高、甘油三酯含量下降、血清胆碱酯酶含量下降;雌雄动物高剂量组动物血清胆碱酯酶含量均明显降低,表明有一定的肝脏毒性作用。低剂量组雌性,高剂量组雄性PLT与对照组比较有差异性(P<0.05),但没有表现出剂量反应关系。结论 本实验条件下,大鼠经口染毒97%双唑草腈原药3个月的最大无作用剂量为16 mg·kg^-1, 最小观察到的有害作用计量为160 mg·kg^-1。
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  T4.12 植物甾醇对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响

  刘河汝;安秀峰;代晓曼;张波

  2013, 27(S1): 127-127.

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  目的 实验研究植物甾醇对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响,探讨植物甾醇的体外神经毒性作用。方法 用浓度为0, 0.5, 2, 8和32 μmol·L^-1的植物甾醇与未分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞共同培养,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术Annexin Ⅴ-PI双染色法测定细胞凋亡率。结果 与对照组比较,随着时间的增长,植物甾醇对细胞生长的抑制率也是提高的,细胞存活率整体呈降低趋势。从植物甾醇1 μmol·L^-1起即对细胞的存活率有显著影响(P<0.01),6和24 h以及48 h的半数致死浓度IC₅₀分别为2.3, 1.2和0.4 μmol·L^-1;与对照组比较,植物甾醇浓度由低到高,随着浓度的增加,对细胞的形态影响越明显,突触变短,胞体萎缩甚至死亡。加入植物甾醇0.5 μmol·L^-1作用24 h后,神经细胞的突触即开始变短、减少。随着植物甾醇的增加,细胞突触明显减少,细胞出现萎缩甚至死亡;与对照组比较,不同浓度的植物甾醇可引起细胞不同程度的早期凋亡。随着植物甾醇的增大,细胞凋亡率也显著增加:植物甾醇浓度为0.5 μmol·L^-1时,细胞凋亡率为12.5%,植物甾醇浓度为2 μmol·L^-1时,凋亡率达到64.31%,植物甾醇浓度为8 μmol·L^-1时,凋亡率高达70.11%。而且,加入植物甾醇24 h后,对SH-SY5Y细胞凋亡的影响主要集中在早期凋亡。结论 植物甾醇对体外培养的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增值和凋亡有毒性作用。
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  T5.14 treg和循环纤维细胞及其相关细胞因子在放射性肺损伤中的作用

  熊珊珊;徐龙;汪倩君;曹芳;孙平;王沛沛;孙丛丛;张玉可;杨婷婷;王丽男;潘秀颉;杨陟华;朱茂祥

  2013, 27(S1): 150-150.

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  目的 研究肺纤维化形成过程中调节性T淋巴细胞(Treg)、循环纤维细胞及重要细胞因子变化规律,进一步探讨Treg细胞是否调节纤维细胞,调控纤维化发生。方法 25 Gy ⁶⁰Co γ射线单次照射小鼠胸腔,建立肺损伤模型; HE染色和Masson三联染色检测肺组织病理变化;酶标仪测定Ⅰ型胶原浓度;流式细胞仪测定小鼠肺实质中循环纤维细胞和肺实质、肺泡灌洗液中treg;液相悬浮芯片检测肺泡灌洗液中纤维化相关细胞因子MCP-1, MIP-1α, Th1/Th2以及Treg/Th17细胞因子表达。结果 照射组与正常组相比,肺组织的病理切片显示1个月起,支气管上皮细胞脱落,局部肺膜增厚,血管周围和肺泡隔胶原纤维增生。1个月起,Ⅰ型胶原分泌增加。第14天开始,循环纤维细胞总数增加。第3天时、第14天、1个月时,treg细胞增多。趋化因子CCL2/MCP-1及CCL3/MIP-1α表达增高;Th1/Th2型细胞因子平衡紊乱;免疫平衡对Treg/Th17相关细胞因子向与利于Treg表达增多的方向偏移。结论 胸部照射后1个月开始,纤维增生。肺部的纤维细胞增多,其相关趋化因子表达也增加,可能是诱导纤维细胞进入肺部的原因。Treg及与之相关的 IL-10表达增多,可能调节纤维细胞在肺部聚集。
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  T5.8 ¹³⁷Cs γ累积照射对SD大鼠肝蛋白质组的影响

  左雅慧;党旭红;原雅艺;张睿凤;段志凯

  2013, 27(S1): 147-147.

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  目的 探讨¹³⁷Cs γ射线累积照射对SD大鼠肝脏组织蛋白质组的影响。方法 雄性SD大鼠随机分为2个照射剂量组和1个对照组(每组10只)。¹³⁷Csγ射线累积全身照射,吸收剂量率为0.336 mGy·min^-1,各剂量组每天照射1次,累计照射天数为10 d(0.2 Gy)和20 d(2.0 Gy),各组累积剂量分别为0.2 Gy, 2.0 Gy,对照组大鼠不接受照射;利用同位素标记的相对和绝对定量技术(iTRAQ)分析累积受照大鼠肝组织的蛋白质表达,筛选出差异蛋白质;对差异表达的蛋白质进行GO注释分析及相互作用网络分析;利用Western blot 方法对部分差异蛋白进行验证。结果 质谱数据经蛋白质数据库搜索,在3组样品中有定量信息的蛋白质2220个;0.2 Gy照射组与对照组相比,差异蛋白有149种,52种蛋白上调,97种蛋白下调;2 Gy照射组有243种差异蛋白,123种上调,120种下调;两组共同表达差异的蛋白有122种,其中,52种蛋白表达上调,70种蛋白表达下调;利用GO注释对122个共同差异蛋白质功能进行聚类分析,结果表明,根据分子功能注释,差异蛋白以酶催化、蛋白质结合、核酸结合等相关蛋白为主,另外少数蛋白还有翻译调控活性;根据细胞组成注释,多数蛋白参与细胞胞浆、细胞核、细胞膜的组成。根据生物学过程注释,多数蛋白参与代谢调节和生物过程调节。利用PAJEK软件对两个剂量组共同差异表达的蛋白进行相互作用网络分析。结果表明Cdc5l, Sf3b1和Yes1是蛋白相互作用网络的重要节点,这几个蛋白直接或间接地与其他差异蛋白存在相互作用;为了进一步验证差异蛋白的存在以及表达量的改变,采用Western blot结果显示,YES1蛋白表达在各剂量组中均为下调,与iTRAQ结果一致。结论 ¹³⁷Csγ射线累积照射对SD大鼠肝脏组织蛋白质组发生改变, Cdc5l, Sf3b1和Yes1蛋白可能在累积照射的肝损伤机制中发挥作用。
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  T5.9 蛋白质组学技术在多发性骨髓瘤研究中的应用与作用

  冉曦;王艾平;李蓉

  2013, 27(S1): 147-148.

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  近年来,蛋白质组学技术在白血病的诊治中得到了广泛应用。如用双向电泳分离急性髓系白血病(AML)不同亚型、急性淋巴系白血病(ALL)患者骨髓白血病细胞蛋白质,并用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALID-TOF-MS)技术和生物信息学鉴定差异蛋白质,可得到21个差异蛋白质点,质谱鉴定后发现15种蛋白有统计意义,其中在AML高表达的蛋白质包括髓过氧化物酶、硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶、钙网蛋白、烯酰辅酶A水合酶等7种,在ALL中高表达的蛋白质包括Arhgdib蛋白、肌动蛋白抑制蛋白1等8种,为AML与ALL早期诊断提供了参考分子标志物及特异性治疗靶标。用SELDI-TOF-MS技术研究发现了溶菌酶C等5个蛋白在正常个体组、非恶性的中性白细胞增多症组及慢性髓细胞样白血病组表达量显著不同,也可作为疾病特异性标志物。在多发性骨髓瘤的发病机制及个体化治疗方面,蛋白质组学可为其提供有用的信息技术。如用基于细胞培养稳定同位素标记(SILAC)的定量蛋白质组学技术在U266骨髓瘤细胞中,发现抑制miR-21可使178个miR-21潜在的靶蛋白表达上调;发现miR-21可通过抑制PIAS3来增强STAT3相关信号途径,通过下调PIAS3能增强miR-21的致癌功能。用SILAC-MS定量蛋白质组学技术,发现有379个蛋白在多发性骨髓瘤肿瘤细胞逆转过程中表达发生改变,而通过RNA干扰抑制STAT3,可逆转多发性骨髓瘤的恶性表型,这为研究肿瘤逆转及多发性骨髓瘤的治疗提供了新的途径。
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  T5.10 p53在辐射增强肿瘤细胞侵袭中的作用

  何明远;董忱;袁德晓;谢月霞;潘燕;邵春林

  2013, 27(S1): 148-148.

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  目的 研究p53对受照射肝癌细胞及共培养的肝癌细侵袭能力的影响及相关机制。方法 将受射线照射肝癌细胞与未照射肝癌细胞采用混合细胞共培养法进行共培养。采用体外侵袭实验检测细胞侵袭能力;采用Western blot检测P53及磷酸化P53蛋白的表达情况;明胶酶谱检测MMP-2的分泌活性;ELISA 法检测VEGF含量;免疫细胞化学法检测VEGFR2的表达。结果 电离辐射可以增强人肝癌细胞HepG2的侵袭能力,并增加其MMP-2和VEGF的分泌以及VEGFR2的表达。VEGFR2抑制剂SU1498及MMPs抑制剂GM6001可以显著抑制照射引起的VEGF和MMP-2分泌及细胞侵袭能力的增强;抑制或干扰照射细胞的p53可显著抑制MMP-2-VEGF通路的激活,并减弱辐射引起的细胞侵袭能力增强。此外,与受照射HepG2细胞共培养后,HepG2旁细胞的侵袭能力也显著升高,并且干扰照射细胞的p53或抑制旁细胞的VEGFR2可以显著减弱旁细胞的侵袭能力。结论 辐射诱导p53的上调可以激活VEGF-MMP-2肿瘤恶性转化通路,从而导致照射细胞及共培养旁细胞侵袭能力的增强。
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  T5.21 耐辐射奇球菌pprM DNA结合域基因敲除株的构建

  杨杰;苏泽红;李斌元;马云;肖潇;范美婷;李伟;王秋岩;何淑雅;

  2013, 27(S1): 153-154.

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  目的 构建pprM DNA结合域敲除株DR1△CSP,并分析其在辐射及其他极端环境处理下的抗性变化,探讨pprM的DNA结合功能对于耐辐射奇球菌(DR)菌的辐射抗性作用。方法 (1) 运用生物信息学方法对pprM基因、pprM功能结合域及PprM蛋白的理化性质、功能结合域及生物学功能等进行分析与预测。(2) 利用体外overlap PCR连接和体内同源重组的方法对DR pprM基因DNA结合域进行基因敲除,γ辐照、紫外辐照、丝裂霉素C和H₂O₂处理后对DR野生株、基因敲除株的生存率等进行分析。初步研究pprM基因DNA结合域对于DR菌辐射抗性是否具有作用。结果 (1) 生物信息学分析结果显示,PprM编码蛋白是一种含有Cold-Shock DNA-binding domain(DNA结合域)的DNA结合蛋白。进一步的pprM基因结构分析发现pprM是一种冷休克蛋白基因,冷休克蛋白可作为转录调控因子通过结合于其他其他DNA损伤修复相关基因的启动子区域调控其表达。(2) 以耐辐射奇球菌基因组DNA为模板,以overlap PCR的方法获得pprM基因DNA结合域缺失的DNA片段DR1△CSD,将获得的目的片段△CSD与基因敲除载体pk18mobsacB连接,转化大肠杆菌JM109感受态,提取质粒,酶切鉴定及测序鉴定分析,结果显示基因敲除重组载体pk18mobsacB-△CSD构建成功。将重组载体转化DR菌感受态,筛选得到pprM基因DNA结合域敲除株,γ辐照、紫外辐照、丝裂霉素C和H₂O₂处理后基因敲除株与DR野生株相比生存率均下降。结论 (1) 生物信息学分析显示pprM含有CSD DNA结合域,推测pprM的DNA结合功能对DR菌的辐射抗性可能具有作用。(2) 成功构建耐辐射奇球菌pprM基因DNA结合域敲除重组载体,敲除株对于辐射及其他极端环境的抗性下降,提示pprM的DNA结合功能对DR菌的辐射抗具有作用。
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  T5.22 某区2012年介入放射学操作人员受照剂量监测评价

  吴敏;冯晓妍

  2013, 27(S1): 154-154.

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  目的 了解介入放射诊断及治疗工作人员受照剂量水平,以便进行相应的防护措施。方法 118位从事介入放射治疗的操作人员的右前臂、胸部铅衣外、胸部铅衣内和头前额,各布放一个热释光剂量计。在每次介入治疗过程中,都使用铅吊屏,并在正面向球管侧和背面向球管侧布放一个热释光剂量计。结果 118位操作人员(均穿铅衣)各部位受照值(μGy)为:左前臂48~569 μGy,均值为106 μGy,右前臂31~314 μGy,均值为56 μGy,胸部铅衣外16~121 μGy,均值为44 μGy,胸部铅衣内5~17 μGy,均值为11 μGy,头前额21~99 μGy,均值为35 μGy。操作人员在介入治疗时,以左、右前臂的受照剂量(均值56~106 μGy)最高,胸部铅衣外的受照剂量(均值44 μGy)次之,再次为头前额的受照剂量(均值35 μGy),胸部铅衣内的受照剂量(均值11 μGy)最低。铅防护吊屏前受照均值为员36~155 μGy,均值为68 μGy,铅防护吊屏后受照均值为26~125 μGy,均值为39 μGy。结论 本调查结果显示,在床边操作一次介入放射工作人员胸部位位置的剂量率平均为44 μGy,高于国家卧位X射线机透视标准(15 μGy)的要求,表明介入放射学工作人员所受剂量大于常规医用X射线诊断的辐射剂量。操作人员左、右前臂的受照剂量最高,一次治疗最高可达569 μGy,平均为106 μGy,明显高于身体其他各部位。因此,从事介入放射前应进行放射培训和体检,并佩戴热释光剂量计。
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  T5.23 γ射线累积辐照射诱发的器官毒性

  郭月凤;杨彪;张慧芳;邢利虹;张睿凤;段志凯

  2013, 27(S1): 154-155.

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  目的 探讨累积γ照射对大鼠的器官毒性。方法 SPF级成年雄性SD大鼠¹³⁷Cs γ射线全身照射,剂量率0.336 mGy·min^-1,每天照射剂量分别为0.05, 0.1和0.1 Gy,分别连续照射10, 10和 20 d,累积剂量分别为0.5, 1.0和2.0 Gy。照射结束后第2和11 d,每组各半数大鼠称量心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、脑、附睾和睾丸质量,计算各脏器系数(g/100 g);对脏器系数异常的样本进行常规组织病理检查。结果 累积γ辐射对脏器系数的影响 对照组大鼠心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、脑、附睾和睾丸的脏器系数分别为0.28±0.02, 2.81±0.49, 0.19±0.02, 0.40±0.05, 0.65±0.08, 0.11±0.03, 0.015±0.002, 0.51±0.02, 0.26±0.02和0.85±0.06。与对照组相比,各剂量组大鼠心、肝、脾、肺、肾、胸腺的脏器系数均未见明显变化(P>0.05);0.5 Gy以上累积照射可导致脑系数和附睾系数在照后第2天暂时升高(P<0.05),2.0 Gy累积照射可导致肾上腺系数在照后第2天暂时升高(P<0.05),照射后第11天均恢复正常;2.0 Gy累积照射可导致睾丸系数在照射结束后11 d延迟减小(P<0.05)。组织病理学检查结果显示:以单个脏器系数低于对照组平均值与2倍标准差之差为显著降低,2.0 Gy组在照后11 d有2例大鼠(比例2/10)附睾和睾丸系数显著降低,睾丸系数分别是0.26和0.30,附睾系数分别是0.20和0.18;同时睾丸间质细胞增生,曲细精管生精上皮受到破坏,可能造成精子形成障碍,附睾管腔内几乎没有精子。结论 小剂量率累积γ辐射对受照大鼠生殖器官有明显影响。2.0 Gy会导致睾丸在照射结束一段时间后发生延迟萎缩,造成部分大鼠睾丸和附睾组织明显损伤。
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  T5.24 磷酸化PTEN蛋白以PIKK/Chk2激酶依赖的方式参与DNA损伤修复

  徐勤枝;胡迎春;叶祺浓;周平坤

  2013, 27(S1): 155-155.

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  目的 深入研究磷酸化PTEN蛋白在DNA损伤修复中的作用。方法 以HeLa, AO-3细胞为研究对象,采用免疫荧光、蛋白印迹以及大规模染色质松弛技术,探讨核定位PTEN与DNA损伤修复的关系。结果 DNA受到损伤后磷酸化PTEN-Ser380蛋白在细胞核内富集,呈点状分布,与ATM-Ser1981和γ-H2AX有共定位。磷酸化PTEN-Ser380富集过程有独特的动力学,在DNA损伤5 h后,仍能检测到PTEN-pS380与DNA 标志物γ-H2AX共定位。ATM/DNA-PKcs/Chk2激酶抑制剂处理HeLa细胞,蛋白印迹实验发现PIKK/Chk2抑制剂明显降低PTEN蛋白Ser380磷酸化水平。利用大规模染色质松弛细胞模型,发现PTEN蛋白诱导染色质松弛,该功能依赖于羧基端PEST基序磷酸化和氨基端的磷酸酶结构域。结论 磷酸化PTEN蛋白以PIKK/Chk2激酶依赖的方式,通过调控染色质结构参与DNA损伤修复反应。
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  T5.25 丁香醛类化合物的抗辐射作用

  宋曼;关华;周平坤

  2013, 27(S1): 155-155.

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  目的 对丁香醛类化合物(丁香酸、丁香醇)及二者混合物(M1)进行体外细胞实验,比较丁香醛类化合物对细胞的辐射损伤防护作用。方法 通过MTT法检测丁香醛类化合物对小鼠胚胎成纤维细胞在4Gy的⁶⁰Co γ射线照射后24,48和72 h后的MEF细胞的活力变化;采用细胞增殖实验检测丁香醛类化合物在4Gy的⁶⁰Co γ射线作用后MEF细胞的生长变化;细胞克隆形成实验观察丁香醛类化合物在4Gy的⁶⁰Co γ射线照射 后对MEF细胞克隆形成率的影响。结果 照射前给予丁香醛类化合物处理后,检测其A值则显著高于照射对照组(P<0.01),与正常对照组则无显著差异。照射前给予丁香醛类化合物处理后,培养6 d并计数,结果细胞增殖的数目显著高于照射对照组(P<0.05)。与照射对照组相比,照射前给予丁香醛类化合物处理后,克隆形成率显著高于照射对照组(P<0.05)。丁香酸、丁香醇和M1对MEF细胞均有不同程度辐射损伤防护作用,且丁香酸和M1的效果较好。结论 丁香醛类化合物能够促进照射后MEF细胞的活力恢复,减轻照射后MEF细胞的生长抑制,提高照射后MEF细胞克隆形成能力,有一定的辐射损伤保护作用。
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  T5.27 HIF-dependent suicidal gene therapy system suppresses growth of renal cell carcinomas

  LIU Jun-ye;ZHOU Yong-chun;MIAO xia;LI Kang-chu;Wang Jin;GUO Guo-zhen

  2013, 27(S1): 156-156.

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  OBJECTIVE To explore the inhibitory effects of hypoxia inducible factor (HIF)-dependent suicidal gene therapy system on renal cell carcinomas. METHODS The HIF-dependent recombinant adenovirus Ad-5HRE/hCMVmp-BCD was constructed by DNA recombinant technique. Western blot was used to detect HIF-dependent expression of bacterial cytosine deaminase (BCD). Cell growth inhibition assay was used to determine the sensitivity of human renal cell carcinoma 786-0 cells to 5-fluorocytosine (5-FC). Tumor xenograft growth delay assay was used to evaluate the inhibitory effects of Ad-5HRE/hCMVmp-BCD/5-FC on renal cell carcinomas. RESULTS Western blot analysis demonstrated that HIF-dependent BCD protein expression was achieved in 786-0 cells infected with Ad-5HRE/hCMVmp-BCD. After infection with Ad-5HRE/hCMVmp-BCD, the sensitivity of 786-0 cells to 5-FC significantly increased. Administration of Ad-5HRE/hCMVmp-BCD/5-FC could inhibit the growth of 786-0 xenografts in nude mice. CONCLUSION HIF-dependent suicidal gene therapy system Ad-5HRE/hCMVmp-BCD/5-FC can be used as a powerful therapeutic method for renal cell carcinoma.
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  T6.1 Previous, current and future studies of environmental and occupational exposures to toxic chemicals：Biomarkers, Systems Biology and Exposome Approaches

  ZHANG Luo-ping;Cliona MCHALE;Martyn SMITH;Steve RAPPAPORT

  2013, 27(S1): 157-157.

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  China, a rapidly developing country, has recently become the largest economy in Asia, and the second largest in the world. The increase in industry fuelling this rapid development has been paralleled by increased production of toxic chemicals and pollution in the workplace and in the environment. Since the early 1990's, we, along with colleagues at the US NCI, China CDC and Guangdong Poison Control Center, have investigated the toxic effects of occupational exposures to the known and potential leukemogens and lymphomagens, benzene (BZ), butadiene (BD), formaldehyde (FA) and trichloroethylene (TCE) using a hypothesis-based biomarker approach. Among our findings, we reported potential biomarkers of exposure, including protein adducts and urinary metabolites (BZ); biological response to exposure, such as leukemia-specific chromosomal changes (BZ, FA) and hematotoxicity (BZ, FA, TCE). We also identified potential biomarkers of susceptibility (BZ, BD) in candidate genotyping studies. More recently, we applied an unbiased systems biology approach, in which we identified additional biomarkers of exposure (mRNA, protein, and miRNA expression, and DNA methylation) through toxicogenomic studies. In order to comprehensively define the mechanisms by which chemical exposure (BZ) causes leukemia, we employed bioinformatics to understand the interactions among the toxicogenomic and susceptibility biomarkers, in the context of the phenotypic anchor hematotoxicity. While biomarker approaches are useful to examine the contribution of single occupational exposures to disease risk, current evidence suggests that complex environmental factors, including diet, lifestyle, as well as occupational and environmental exposures, contribute about 90% of the risks of chronic diseases. As recently proposed by us, these complex environmental factors can be investigated by interrogating the exposome, which incorporates the totality of (endogenous and exogenous) exposures received by a person during life. In this approach, prospective study cohorts could be biomonitored during critical stages of life, and important classes of toxicants (reactive electrophiles, metals, metabolic products, hormone-like substances, and persistent organic pollutants) could be analyzed in blood specimens and used to construct exposomes. Currently, we are characterizing the exposome of human leukemia by using unbiased laboratory-based methods to find the unknown environmental factors that contribute to leukemia etiology.
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  T6.2 HLA分子与三氯乙烯药疹样皮炎发病的关系

  戴宇飞;张峻;杨海军;孟涛;牛勇

  2013, 27(S1): 157-158.

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  目的 从HLA功能入手,探索HLA-B*13:01等位基因与三氯乙烯(TCE)药疹样皮炎关联的分子机制。方法 分别构建表达HLA-B*13:01和HLA-B*13:02的Hmy2.C1R细胞系,采用免疫亲和层析法并结合分子筛技术分离HLA-B*13:01和HLA-B*13:02分子结合的抗原肽混合物,利用反相高效液相色谱-质谱技术分离并测定抗原肽的一级结构,分析特定HLA分子结合抗原肽的共同基序。通过流式细胞技术检测抗原肽与HLA分子的结合力。结果 通过分析抗原肽每个位点氨基酸出现的频率,发现在HLA-B*13:01抗原肽中,P2位锚定氨基酸为亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q),频率分别为39%和33%;PΩ位锚定氨基酸为L(35%),苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)(15%)和色氨酸(W)(11%)。HLA-B*13:02抗原肽中,P2位锚定氨基酸为Q(26%)和L(16%);PΩ位为L(26%)、缬氨酸(V)(21%)和I(14%)。通过HLA-抗原肽结合力试验发现,在HLA-B*13:01抗原肽中,RQDDPSYRSF(Q-F,即P2位为Q,PΩ位为F,下同)、AGDGTFQKW(G-W)、ALLNLAERL(L-L)与HLA-B*13:01结合力较高,结合力分别为54%, 50%和45%;在TCE存在的条件下,Q-F和G-W等抗原肽与HLA-B*13:01的结合力分别由54%和50%下降为11%和32%,降低值分别为43%和18%。在HLA-B*13:02抗原肽中,KLKGEENTV(L-V)的结合力最高,达到73%,但是TCE对抗原肽与HLA-B*13:02的结合力并不产生影响。结论 (1)HLA-B*13:01与HLA-B*13:02提呈抗原肽的差别主要在于抗原肽的PΩ位氨基酸,而该位点氨基酸主要结合于HLA-B分子的F口袋,提示TCE药疹样皮炎的发生与HLA-B*13:01F口袋的结构特异性有关;(2)TCE可以影响某些抗原肽与HLA-B*13:01的结合,而不改变抗原肽与HLA-B*13:02的结合,这与HLA-B*13:02基因与TCE药疹样皮炎无关联的结果相吻合。TCE可以使HLA-B*13:01对所结合的抗原肽的偏好发生改变,通过提呈致病性抗原肽,进一步引起机体免疫应答。
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  T8.9 80%乙蒜素乳油的急性吸入毒性

  黄雅丽;顾刘金;杨校华

  2013, 27(S1): 210-210.

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  目的 研究80%乙蒜素乳油的急性吸入毒性。方法 GB15670-1995《农药登记毒理学试验方法》中急性吸入毒性试验方法进行,采用霍恩氏法,设215, 464, 1000和2150 mg·m^-3四个剂量组,每组SD大鼠10只,雌雄各半,口鼻式动式吸入染毒,有效染毒时间2 h。观察大鼠死亡情况、中毒症状和体重变化,观察时间14 d。结果 染毒及染毒后观察期间,464, 1000和2150 mg·m^-3剂量组动物出现呼吸困难、流涎、蜷缩不动等症状,雌性大鼠急性吸入LC₅₀值为750 mg·m^-3,雄性大鼠急性吸入LC₅₀值为619 mg·m^-3,根据《农药登记毒理学试验方法》中农药急性吸入毒性分级标准,80%乙蒜素乳油对雌雄大鼠的急性吸入毒性均属于中等毒。结论 在本试验条件下,80%乙蒜素乳油急性吸入毒性为中等毒,对大鼠的毒作用靶器官为神经系统和呼吸系统,在实际使用过程中应采取严格的防护措施。
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  T6.3 苯作业工人基于遗传毒性、血液毒性指标的基准剂量

  张光辉;叶玲丽;李勇;陶惜旦;徐晓文;张德亭;朱怡良;夏昭林

  2013, 27(S1): 158-158.

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  目的 探讨苯累积接触造成的遗传毒性效应和外周血白细胞的影响及其可能影响因素,建立苯接触与效应指标间的剂量-反应关系,并分别计算其基准剂量值(BMD)。方法 选择317名苯作业工人为接触组,以无职业接触任何有害化学物质的办公室人员102名作为对照组。在取得知情同意后职业体检时采集外周血样,问卷调查收集样本的年龄、性别、喝酒史、吸烟史和既往疾病史等常规资料。应用自动检测仪检测外周血白细胞值,用胞质阻滞微核试验检测外周血淋巴细胞微核。定点监测职业工人作业点的苯浓度,根据作业工人的作业地点和作业时间计算累积接触剂量(CED)。结果 对照组微核率为(1.82±1.17)‰,接触组微核率为(3.22±1.92)‰,两组比较差异有统计学意义 (P<0.01);对照组白细胞计数值为(6.45±1.42×10⁹),接触组白细胞计数值为(5.96±1.61×10⁹),两组比较,差异有统计学意义 (P<0.01);苯的累积接触剂量值与白细胞降低和微核率均具有剂量-反应关系。在对照组((2.15±1.23)‰ vs (1.47±1.00)‰, P<0.05)和接触组((3.54±1.99)‰ vs (3.00±1.86)‰, P<0.01),均发现年长组微核率高于年轻组。以微核率升高为损伤效应指标,得到的男性、女性和总人群的BMDL10分别为5.75, 5.56和6.31 mg·m^-3-year,而以白细胞降低为效应指标,得到的男性、女性和总人群的BMDL10分别为24.08, 14.33, 21.97 mg·m^-3-year。将工作年限按照40年计算,以MN得到的时间加权浓度为0.16 mg·m^-3。结论 苯作为职业致癌物,其累积接触剂量与作业工人的白细胞降低和微核率升高存在着关联,基准剂量有助于推动有害物质接触人群的职业接触限值的制/修订。
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  T6.4 职业人群铬酸盐危害新证据及其健康监护建议

  贾光;李阳;于善法;张济

  2013, 27(S1): 159-159.

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  目的 为认识铬酸盐健康危害提供新的证据。方法 选择115名铬酸盐制造车间工人为暴露组,100名当地、性别年龄匹配的居民为对照组。铬酸盐车间内,对每个岗位进行了空气个体采样,并收集外周静脉血、末班尿样本进行分析。促凝血和抗凝血以3500 rpm,离心10 min,分别获得血清和血浆。血样和尿样保存于-80℃。通过ICP-MS测量血铬和尿铬含量。以血清胱抑素C(Cys-C)反映肾小球过滤功能,结合尿微球蛋白(mALB)、尿β2微球蛋白(β2M)、尿N-乙酰葡糖胺(NAG)反映早期肾小管功能损伤。以血清游离性和总前列腺特异性抗原(PSA)反映前列腺功能损伤。以血清C反映蛋白反映非特异性炎症程度。以外周血淋巴细胞胞质分裂阻断法微核率、尿8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)反映遗传损伤程度。同时检测血清叶酸、外周血DNA提取物总甲基化程度等指标。本研究经过北京大学医学伦理审查委员会的批准。结果 铬酸盐空气检测:90%的铬酸盐工人空气铬暴露水平低于国家职业卫生标准(PC-TWA,50 μg·m^-3);肾功能检测:Cys-C、尿mALB、NAG和β2M在暴露组中的水平显著大于其在对照组的水平(P<0.05)。尿mALB、β2M水和NAG水平与尿铬有显著线性相关关系(r=0.608, P<0.05; r=0.267, P<0.05; r=0.286, P<0.05)。提示,慢性职业性铬酸盐接触可导致肾功能综合性损伤,其对肾小管的损伤比肾小球尤为明显;前列腺损伤检测:暴露组血清游离前列腺特异性抗原(PSA)水平显著大于对照组(P<0.05)。血清总PSA与尿铬显著相关(r=0.232, P<0.05)。多元线性回归提示血清游离PSA和总PSA与血清C反应蛋白和尿铬相关(P<0.05)。提示,慢性职业性铬酸盐接触可导致前列腺损伤,非特异性炎症可能是导致血清总PSA升高的潜在原因之一。遗传损伤检测:暴露组双核淋巴细胞微核率(BNMN)显著高于对照组(P<0.05)。暴露组中BNMN与血铬和尿铬存在显著相关关系(r=0.488, P<0.01; r=0.517, P<0.01)。提示,铬酸盐暴露可导致早期DNA损伤。生化代谢检测:铬酸盐接触工人中,外周血红细胞铬含量与血清叶酸水平成负相关(r=-0.228, P<0.05)。血清叶酸水平与尿8-OHdG和全基因组DNA甲基化呈显著相关((r=-0.249, P<0.05; r=0.163, P<0.05)。提示,慢性铬酸盐接触可导致叶酸缺乏,可能进一步导致促进DNA损伤和全基因组低甲基化程度。结论 低剂量铬酸盐暴露(<50 μg·m^-3)可导致多器官和靶点损伤,包括肾、前列腺、染色体。炎症和叶酸缺乏导致的DNA低甲基化是其中可能的机制之一。
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  T6.5 CYP3A4基因沉默和高表达对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响

  徐新云;毛侃琅;毛吉炎

  2013, 27(S1): 159-160.

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  目的 建立CYP3A4沉默细胞株和CYP3A4高表达细胞株,观察CYP3A4基因沉默和高表达对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响。方法 根据GenBank提供的CYP3A4 基因mRNA序列设计合成shRNA,将shRNA连接到质粒中,构建慢病毒载体,对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞,用嘌呤霉素筛选得到CYP3A4沉默细胞株。根据GenBank提供的CYP3A4 基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表达载体,将慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞,筛选得到CYP3A4高表达细胞株。应用荧光定量PCR和Western blot对CYP3A4基因沉默和高表达细胞进行鉴定。用不同剂量TCE(0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mmol·L^-1)对正常肝细胞、CYP3A4沉默细胞和CYP3A4高表达细胞染毒12 h,观察凋亡基因和癌基因表达变化。结果 ① 基因测序证明插入载体的CYP3A4干扰序列与设计序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4沉默细胞CYP3A4基因表达比正常肝细胞下降77.3%,Western blot实验显示CYP3A4沉默细胞CYP3A4蛋白表达水平比正常肝细胞下降84.6%。CYP3A4沉默细胞经三氯乙烯染毒后Bcl-2表达水平显著高于L02肝细胞;胱天蛋白酶3表达水平无明显改变;胱天蛋白酶8仅在TCE高剂量组表达下降;胱天蛋白酶9在TCE≥1.0 mmol·L^-1表达水平下降;癌基因c-fos, c-myc, k-ras和p53表达水平都有一定程度下降,部分剂量组存在显著差异(P<0.05或P<0.01)。② 基因测序证明高表达载体CYP3A4基因序列与GenBank提供的CYP3A4序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4高表达细胞比正常肝细胞CYP3A4基因表达提高94倍,Western blot实验显示CYP3A4高表达细胞株CYP3A4蛋白表达比正常肝细胞升高136%。CYP3A4高表达细胞经TCE染毒后Bcl-2表达水平下降;凋亡基因胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9表达水平高于正常肝细胞。p53在CYP3A4高表达细胞中表达水平比正常肝细胞表达下降;c-fos, c-myc和k-ras基因表达都是CYP3A4高表达细胞显著高于正常肝细胞。结论 沉默CYP3A4基因可使肝细胞中的凋亡基因和癌基因表达水平下降,而CYP3A4基因高表达可以促进凋亡基因和癌基因表达,提示CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在明显关系。
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  T6.6 多种化学致敏物对THP-1巨噬细胞细胞因子表达的影响

  赵雪铮;贾强;张峻;李雪;郑玉新;张艳淑;戴宇飞

  2013, 27(S1): 160-160.

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  目的 探讨多种化学致敏物作用于THP-1源性巨噬细胞后,细胞上清液中细胞因子表达的变化,为确定化学物是否具有致敏性提供更有效的参考指标,从而减少职业人群中化学致敏物的接触,有效的预防过敏性疾病的发生。方法 首先将人单核细胞株THP-1细胞用佛波酯(PMA,0.1 mg·L^-1)诱导72 h,使之转化为具有贴壁能力的THP-1巨噬细胞。选择硫酸镍(NiSO₄)、2,4-二硝基氯代苯(DNCB)、 苯二胺(PPDA)、重铬酸钾(K₂Cr₂O₇)、甲苯二异氰酸酯(TDI)5种化学致敏物和十二烷基磺酸钠(SDS)、异丙醇(IPA)2种非化学致敏物为受试物,检测不同浓度受试物处理细胞的不同时间点时细胞因子表达的变化。分别用ELISA法检测细胞培养上清中IL-6和TNF-α的水平,用流式液相多重蛋白定量技术(CBA)检测IL-1β和IL-8细胞因子的表达水平。结果 5种化学致敏物均能引起IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-8的表达升高,不同的致敏物诱导细胞分泌细胞因子表达的时间并不相同,NiSO₄, DNCB, K₂Cr₂O₇作用6 h,PPDA, TDI 作用12 h时,THP-1细胞上清中IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-8 四种细胞因子的表达量最高。NiSO₄, DNCB和TDI组细胞上清中IL-1β, TNF-α和IL-8表达量增加并呈剂量反应关系。K₂Cr₂O₇, PPDA组IL-6, IL-8表达升高且有剂量反应关系。5种化学致敏物NiSO₄, DNCB, K₂Cr₂O₇, PPDA, TDI在最适时间点最适浓度刺激细胞分泌IL-6的水平分别为对照组的40, 25, 20, 50和50倍,TNF-α水平为对照组的20, 12, 20, 8和5倍,IL-1β水平为对照组的30, 60, 25, 30和45倍,IL-8水平为对照组的15, 12, 15, 12和7倍;非致敏物SDS与IPA处理组IL-6水平均有升高,其中SDS组升高最明显,且呈明显的剂量反应关系,SDS高剂量组(1 mg·L^-1)IL-6含量约为空白对照组的30倍左右,因此提示IL-6指标不能作为评价致敏物的有效指标。TNF-α, IL-1β和IL-8表达水平无明显变化,因此TNF-α, IL-1β和IL-8这三个指标可作为评价化学物致敏性的有效标记。结论 THP-1巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α, IL-1β, IL-8受化学致敏物的影响,但不受非致敏物的影响。因此这3个指标可作为鉴别化学致敏物和非致敏物的有效参考指标。
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  T6.7 P53蛋白对苯并(a)芘诱导的P21、周期蛋白D1和CDK4蛋白间相互作用的影响

  叶萌

  2013, 27(S1): 161-161.

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  目的 探讨在苯并(a)芘(benzo(a)pyrene, B(a)P)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中P53蛋白对P21、周期蛋白D1和CDK4蛋白间相互作用的影响。方法 向转染p53小干扰RNA(p53siRNA)质粒的HELF细胞即p53-H细胞组、载体CMV的HELF细胞即HELF/CMV细胞组中分别加入B(a)P 2 μmol·L^-1作用24 h,向p53化学抑制剂Pifithrin-α(PFT-α)即HELF/CMV+PFT-α细胞组中同时加入B(a)P 2 μmol·L^-1和PFT-α 20 μmol·L^-1作用24 h,各组同时设立不做任何处理的对照组。用免疫印迹(Western blot)法检测细胞中P53, P53-ser20以及P21、周期蛋白D1和CDK4蛋白水平的变化,同时利用免疫沉淀方法分析P53蛋白对P21、周期蛋白D1以及CDK4蛋白间相互作用的影响。结果 利用PFT-α或P53小干扰RNA技术抑制P53蛋白后,B(a)P诱导的P53蛋白20位丝氨酸磷酸化水平和P21蛋白水平的增高受抑制, B(a)P诱导的周期蛋白D1水平的增加不受影响,CDK4的水平不受B(a)P的影响;免疫沉淀实验结果表明,B(a)P引起的P21和CDK4结合的增加受到抑制,B(a)P引起的P21与周期蛋白D1结合的增加不受影响,周期蛋白D1和CDK4的结合不受B(a)P的影响。结论 B(a)P通过P53蛋白影响人胚肺成纤维细胞P21和CDK4的结合。
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  T6.21 焦炉逸散物致基因组DNA异常甲基化改变

  段化伟;何志妮;马俊香;张波;牛勇;宾萍;戴宇飞;陈雯;肖永梅;郑玉新

  2013, 27(S1): 168-169.

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  目的 探讨长期暴露多环芳烃化合物与肺癌的发生机制。方法 招募82名焦炉工和62名非多环芳烃暴露的对照组工人。通过检测其工作环境中多环芳烃的浓度和尿中1-羟基芘水平,评估其暴露水平。利用彗星实验和胞质阻滞微核实验分别检测个体DNA和染色体损伤改变。基因组DNA经亚硫酸盐修饰后,以长散在重复序列(LINE-1)代表基因组甲基化水平,O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)为候选基因甲基化研究;利用焦磷酸盐测序技术对上述基因进行甲基化定量分析。同时收集焦炉作业炉顶区域的焦炉逸散物,以人支气管上皮细胞(16HBE)为体外模型,经焦炉逸散物有机提取物处理后,检测候选基因甲基化改变和蛋白表达水平改变。结果 焦炉工的尿中1-羟基芘浓度、Olive尾距和淋巴细胞微核率也显著高于对照组。焦磷酸盐甲基化测序发现,与对照组相比,焦炉工淋巴细胞基因组LINE-1甲基化水平降低,其中位数是59%[四分位数间距(IQR)为 58.3%~59.7%],对照组是63%(IQR=58.9%-64.1%),差异有统计学意义(P<0.001)。MGMT基因启动子区甲基化水平也呈降低趋势[4.56%(3.59%~5.55%)比5.34%(4.12%~6.12%),P=0.018],并具有位点特异性。LINE-1和MGMT启动子区甲基化水平与尿中1-羟基芘浓度呈负相关趋势,提示多环芳烃暴露可导致基因组和MGMT启动子区甲基化水平降低。此外,LINE-1甲基化与彗星Olive尾距和微核率分别呈负相关趋势。将MGMT甲基化水平按二分位法分组后,在低MGMT甲基化组中也有较高的淋巴细胞微核率。体外细胞学实验也证实了高浓度焦炉逸散物暴露后,细胞基因组和MGMT启动子区呈低甲基化改变,该甲基化异常改变可能与BPDE-DNA加合物的形成有关。结论 LINE-1和MGMT启动子区低甲基化改变可以作为评估焦炉逸散物或多环芳烃暴露人群健康损害的生物标志物,或可用于肿瘤高风险人群的早期健康监护。
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  T6.23 三氯乙烯对未成熟人树突状细胞的毒性作用

  赵娜;吴奇峰;李宏玲;王海兰

  2013, 27(S1): 169-170.

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  目的 探讨三氯乙烯(TCE)对体外诱导人未成熟树突状细胞(DC) 的细胞毒性作用。方法 分离人外周血单核细胞,应用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)诱导获得未成熟DC(iDC),进行细胞形态学观察和流式细胞仪(FACS)检测细胞表面标记鉴定。 给予TCE处理进行剂量-效应和时间-效应分析,采用CCK-8检测细胞毒性作用。结果 诱导获得的iDC呈悬浮状态,部分细胞聚集成簇,大部分细胞呈圆形,部分细胞的胞浆存在少量不明显的毛刺样树突伸出。细胞表面标志分子表达阳性率CD14为0.64%,HLA-DR为51.95%,CD1a为38.01%,CD40为18.01%,CD80为8.79%,CD83为26.63%,获得的细胞具有iDC的特征性表型。TCE 0.5, 1.0, 5.0和10 mmol·L^-1处理组随作用剂量增加,细胞数呈不同程度减少,细胞皱缩现象逐渐增多,成熟DC特有的大量毛刺状树突逐渐消失,细胞变圆; TCE 0.5, 1.0, 5.0和10 mmol·L^-1处理组作用时间(24~72 h)TCE染毒组细胞增殖抑制率不同程度增高, 呈剂量-和时间-依赖性关系,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 诱导获得人未成熟DC;TCE作用可致人未成熟DC的细胞毒性效应。
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  T6.25 噪音对大鼠的学习记忆及脏器的影响

  王忠;赵效国;孙建新

  2013, 27(S1): 170-171.

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  目的 探讨不同分贝噪音对大鼠的学习记忆及脏器系数的影响。方法 取60只SD大鼠,雌雄各半,适应性饲养1周,于第2周进行Y迷宫训练测试,淘汰测试不合格的大鼠。选取40只测试合格的SD大鼠随机分为4个组:空白对照组(20 db以下)、60 db干预组、80 db干预组、110 db干预组,每组10只。各组大鼠按照设定的噪音分贝量,每天给予8 h不规则噪音刺激,连续30 d,各组动物在普通环境下正常饲养。于第30天,用Y型迷宫测量大鼠学习记忆能力;第31天处死动物,解剖大鼠,取大脑、心脏、肾上腺、卵巢、睾丸观察脏器形态学变化,计算脏器系数。结果 80和110 db干预组大鼠的记忆力与空白对照组大鼠相比较,记忆力明显减退,差异显著,具有统计学意义 (P<0.01); 80和110 db干预组大鼠的记忆力与60 db干预组的大鼠相比较,记忆力明显减退,差异显著,具有统计学意义(P<0.01)。80和110 db干预组大鼠的心脏系数与空白对照组相比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.05);110 db干预组大鼠的卵巢系数与空白对照组相比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.05);60, 80和110 db干预组大鼠的肾上腺系数与空白对照组相比较,显著差异,具有统计学意义(P<0.01)。110 db干预组大鼠中有一只雄性大鼠出现了脑萎缩和睾丸萎缩。结论 噪音可降低大鼠的学习记忆能力,对大鼠脏器有危害作用。
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  T6.26 正己烷对大鼠抗氧化酶活力与DNA损伤的影响

  齐宝宁;唐国慧;郭剑锋

  2013, 27(S1): 171-171.

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  目的 研究正己烷对大鼠肝组织抗氧化酶活力和DNA损伤的影响。方法 40只雄性SD大鼠随机分成5组,即阴性对照组、75、150、300 mg·kg^-1染毒组和阳性对照组(环磷酰胺),每组8只。经腹腔注射染毒4周,检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力,用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测大鼠肝细胞DNA的损伤。结果 随染毒剂量增加,肝组织匀浆中GSH-Px, SOD活力随染毒剂量增加而减小,经方差分析,组间差异有统计学意义(P<0.05);各实验组与阴性对照组作Dunnett-t检验,高剂量组与阴性对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),该结果与阳性对照组结果一致;实验组之间再作SNK-q检验,低剂量组和高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。肝细胞经SCGE检测,阳性对照组与阴性对照组比较,尾长、尾DNA%、尾矩、Olive尾矩差异均有有统计学意义(P<0.01);中、高剂量组与阴性对照组比较,尾长、尾DNA%、尾矩、Olive尾矩均有有统计学意义(P<0.01);低剂量组与阴性对照组,差异无统计学意义;实验组之间再作SNK-q检验,低剂量组和高剂量组差异均有有统计学意义(P<0.05)。尾矩值与染毒剂量作相关分析,相关系数r为0.981,呈正相关(P<0.05)。结论 正己烷使大鼠机体抗氧化能力受到明显的影响和肝细胞DNA发生损伤。
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  T6.27 血管紧张素Ⅱ在大鼠全氟异丁烯急性吸入性肺损伤中的作用

  王和枚;王延琳;王虎;赵建;黄春倩;瞿文生;丁日高

  2013, 27(S1): 171-172.

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  目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在大鼠全氟异丁烯(PFIB)急性吸入性肺损伤中的作用。方法 1)PFIB染毒后内源性AngⅡ及血管紧张素转化酶(ACE)表达的时-效规律观察。28只雄性Wistar大鼠,随机分为空白对照组(0 h)和PFIB染毒后1, 2, 4, 8, 16和24 h活杀组(n=4)。其中PFIB染毒组行头部暴露动态吸入PFIB染毒(剂量为145 mg·m^-3×8 min),空白对照组行过滤空气暴露8 min。分别在染毒后相应时间点收集大鼠肺组织、血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)等样本,测定肺湿/干重比(W/D)、BALF 蛋白含量,并进行肺组织病理学检查;同时测定肺组织匀浆与血浆中AngⅡ含量及肺组织匀浆ACE活性。2)血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)阻断剂氯沙坦钾在PFIB中毒性肺损伤中的防治学意义研究。分别从时-效与量-效两个方面对氯沙坦钾防治大鼠PFIB中毒性肺损伤的效果进行考察。如上采用大鼠头部暴露动态吸入PFIB染毒,剂量为145 mg·m^-3×8 min。在时-效关系研究中固定氯沙坦钾给药剂量为10 mg·kg^-1,设PFIB染毒前1和0.5 h与染毒后0.5, 1, 2, 4和8 h给药等7个药物干预组;在量-效关系研究中固定给药时间为染毒前1 h,设氯沙坦钾1.25, 2.5, 5, 10和15 mg·kg^-1干预组;两者均设相应溶剂对照组与PFIB染毒对照组。以上各组动物数均为4只。在染毒后24 h处死动物,分别收集右肺组织及左肺BALF等样本,测定肺系数和BALF中总蛋白含量以评价肺损伤程度。结果 1)大鼠PFIB染毒后16 h肺W/D和BALF中蛋白含量显著升高,发生急性肺间质与肺泡水肿伴大量中性粒细胞渗出,染毒后24 h肺损伤程度明显缓解。肺组织AngⅡ含量在染毒后8 h前各时点呈现升高的趋势,但无统计学意义,染毒后16与24 h则显著低于空白对照组动物;血浆中AngⅡ含量与肺组织ACE酶活性在染毒后各时点呈现一定程度的波动,但与对照组比较均无显著性差异。2)PFIB急性吸入染毒后,时-效与量-效关系研究均显示氯沙坦钾对染毒大鼠肺系数及BALF中总蛋白含量均无显著影响,各药物干预组同相应PFIB染毒对照组比较均无显著性差异。结论 大鼠吸入PFIB中毒后肺组织ACE活性及AngⅡ含量与肺损伤程度未见明显关联,AT1阻断剂氯沙坦钾对PFIB中毒性肺损伤无明显影响,提示AngⅡ在PFIB中毒性肺损伤中作用有限。
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  T6.28 焦炉逸散物对作业工人心血管系统一般指标的影响

  解秋艳;李红丽;牛勇;赵秀兰;郑玉新;段化伟

  2013, 27(S1): 172-172.

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  目的 探讨焦炉逸散物是否会引起暴露人群心血管系统一般指标的改变。方法 组织281名焦炉作业工人与211名对照工厂工人进行健康体格检查,包括信息记录和血压测量及心电图检查。结果 研究发现焦炉逸散物暴露工人的血压较对照组相比具有升高趋势,其中焦炉工的收缩压为(124.07±14.38)mmHg,而对照组氧气工的收缩压为(119.19±14.74)mmHg,二者相比具有统计学意义(P<0.05)。焦炉工舒张压为(81.53±10.74)mmHg,氧气工舒张压为(80.37±10.50mm)Hg,差异无统计学意义(P>0.05)。在校正身体质量指数(BMI)和工龄的情况下,结果未发生明显改变。焦化厂工人高血压(收缩压≥140 mmHg或者舒张压≥90 mmHg)患病率为17.9%(50/280),对照厂工人高血压患病率为16.2%(34/210),差异无统计学意义。焦化厂工人心电图异常率为10.0%(28/281),对照厂工人心电图异常率为8.5%(18/211),差异无统计学意义。研究对象以年龄≤33岁,33~40岁和 >40岁分为低年龄、中年龄和高年龄三组,发现血压有随年龄增长而增高的趋势。在焦炉工中,不同年龄组间的收缩压与舒张压均有明显改变,其中高年龄组与低年龄组、高年龄组与中年龄组间的差异有统计学意义(P<0.05);对照厂工人的舒张压的变化与焦化厂结果相似,但收缩压只有低年龄组与高年龄组间有统计学差异。在焦炉工中没有发现吸烟对血压和心电图指标的明显效应,但在氧气工中吸烟者血压高于不吸烟者,差异有统计学意义(P<0.05)。在焦炉工与氧气工中发现饮酒者血压均高于不饮酒者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 焦炉逸散物会引起暴露人群收缩压等心血管系统指标的改变。相对于吸烟,饮酒与焦炉逸散物对心血管系统的联合作用更应该值得关注。
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  T6.29 纳米SiO₂致大鼠肺组织损伤病理形态及超微结构动态改变

  张迎建;李文超;杨红

  2013, 27(S1): 172-173.

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  目的 为探明纳米SiO₂致大鼠肺组织损伤的发病机制提供依据。方法 SPF级健康雄性SD大鼠150只,按体重随机分成纳米SiO₂ 6.25, 12.5, 25 g·L^-1和微米SiO₂ 25 g·L^-1及生理盐水组,每组30只,采用一次性非暴露式气管灌注方式染尘1 ml。在第7, 15, 30, 60和90天,分别从各组中随机选6只实验动物处死,计算肺脏脏器系数、观察肺组织病理及超微结构改变。结果 在所有染尘时间点,25 g·L^-1微米SiO₂组与纳米SiO₂组大鼠肺脏器系数高于生理盐水组(P<0.05),纳米SiO₂ 6.25和12.5 g·L^-1组大鼠肺脏器系数较生理盐水组增加,差异无统计学意义(P >0.05),微米SiO₂ 25 g·L^-1组大鼠肺脏器系数高于同剂量纳米SiO₂组(P<0.05),染尘30和60 d 25 g·L^-1纳米SiO₂组大鼠肺脏器系数高于6.25和12.5 g·L^-1纳米SiO₂组(P<0.05);随着染尘时间的延长,微米SiO₂ 25 g·L^-1组大鼠肺脏器系数增高,各剂量纳米SiO₂组大鼠肺脏器系数降低,呈现时间-效应关系。光镜下可见染尘7 d时,微米SiO₂组肺泡腔内及肺泡巨噬细胞(AM)聚集,形成细胞性结节,15 d肺内弥漫性分布细胞性结节,30 d少量结节融合,60 d大量结节融合,90 d肺内有细胞纤维性结节,其周围肺泡呈代偿性肺气肿;纳米SiO₂ 6.25和12.5 g·L^-1组病理改变相似,染尘7和15 d肺泡间隔略增宽、炎症细胞浸润,30 d支气管和血管周围及小叶间隔有纤维结缔组织沉积,60, 90 d纳米SiO₂ 12.5 g·L^-1组可见支气管及血管周围少量纤维结缔组织沉积;染尘7 d纳米SiO₂ 25 g·L^-1组局灶性AM集聚和纤维母细胞增生,肺组织实变,15 d部分区域肺泡壁和小叶间隔增宽,纤维结缔组织增生,30, 60和90 d支气管和血管周围、肺泡壁和小叶间隔增宽,纤维结缔组织轻度增生。透射电镜下可见微米SiO₂组染尘后7 d Ⅱ型肺泡上皮细胞(TAⅡ)嗜锇板层小体肿胀,AM内吞噬有粉尘颗粒,间质中胶原及弹力纤维增生,15 d Ⅱ型肺泡上皮细胞胞质内嗜锇板层小体增多,AM内吞噬有嗜锇板层小体和粉尘颗粒,间质中胶原及弹力纤维增生,30, 60和90 d TAⅡ内嗜锇板层小体增多,30 d间质中胶原及弹力纤维增生,90 d间质中可见粉尘颗粒;纳米SiO₂ 25 g·L^-1组染尘后7 d可见TAⅡ内嗜锇板层小体肿胀,15和30 d TAⅡ内嗜锇板层小体增多并空泡样变,间质中胶原及弹力纤维增生,60 d Ⅱ型肺泡上皮细胞嗜锇板层小体肿胀、空泡样变,间质中胶原及弹力纤维增生,90 d TAⅡ内嗜锇板层小体增多,间质中胶原及弹力纤维增生。结论 纳米SiO₂颗粒暴露可致大鼠肺组织损伤,前期以炎症为主,后期则主要表现为肺间质纤维化,不同于微米SiO₂所致结节性肺纤维化,其致纤维化能力较同浓度微米SiO₂弱。
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  T6.32 亚慢性苯吸入染毒致小鼠骨髓细胞全基因组甲基化差异基因的筛查

  林冲;纪思思;刘子巍;张积太;杨新军;闫洪涛

  2013, 27(S1): 174-175.

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  目的 目前已有苯暴露导致一些特定基因甲基化变异的研究报道,但对全基因组启动子区甲基化的变化模式缺乏全面了解。本研究应用高通量甲基化芯片技术,比较不同浓度苯暴露下小鼠骨髓细胞全基因组启动子区甲基化状态,筛查甲基化差异基因,为深入研究其表观遗传毒性机制提供线索。方法 6~8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,随机分为0, 1和100 ppm组。实施每天8 h,每周5 d,共13周的亚慢性动式吸入染毒。染毒结束,处死小鼠,提取骨髓DNA,经MseⅠ酶切,甲基化富集,荧光染料Cy3和Cy5分别标记后与罗氏NimbleGen甲基化芯片进行杂交(3×720 K格式,该芯片覆盖了所有UCSC注释的CpG岛和所有RefSeq数据库基因的启动子区域)。激光扫描仪扫描,NimbleScan软件分析Cy3和Cy5的强度,用SignalMap软件,以Cy3和Cy5的比值(log₂ Cy5/Cy3, log₂ratio),结合基因KEGG通路分类和GO功能分类,分析全基因组甲基化模式,筛选甲基化差异基因。结果 ① 芯片实验结果质控:通过DNA甲基化芯片杂交图谱分析,杂交信号均一,划痕、气泡等瑕疵面积没有超过点阵面积的5%;Alignment Oligo的杂交信号值正常;由STC信号判断同一张芯片上相邻点阵之间的样品不存在交叉污染,表明杂交反应成功、实验结果可靠。② 甲基化差异基因:与0 ppm组比较,1 ppm组有2585个基因甲基化降低,3个基因甲基化水平升高,100 ppm组有2709个基因降低,7个基因升高。与1 ppm组比较,100 ppm组有64个基因降低,40个基因升高。除Y染色体外,其他22条染色体甲基化谱均发生了改变,其中改变最多的是Chr7(198个基因),最少的是ChrX(9个基因)。③ 甲基化差异基因参与的信号通路和功能分类: 通过晶芯^®生物分子功能注释系统(MAS)V3.0分析,结果显示苯暴露致小鼠骨髓细胞甲基化变异的基因主要涉及细胞因子-细胞因子受体介导的信号通路(Cytokine-cytokine receptor interaction),发生甲基化差异的基因有26个;MAPK signaling pathway,23个;Wnt signaling pathway,15个; 白细胞经内皮迁移信号通路(Leukocyte transendothelial migration),13个;造血相关信号通路(Hematopoietic cell lineage),10个。这些甲基化差异基因参与了基因转录调控、发育、代谢、离子转运、细胞生长和增殖、细胞分化和凋亡、细胞通讯、信号转导、细胞黏附等广泛的生物学过程。结论 亚慢性苯暴露可以导致小鼠骨髓细胞广泛的基因甲基化修饰异常,涉及多种生理功能。
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  T6.33 汉防己甲素对大鼠早期实验性矽肺预防性治疗效果观察

  郑艳艳;潘瑞辉;梁丹玉;谢晶;甘永金;梁恒秋;凌健安

  2013, 27(S1): 175-175.

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  目的 了解汉防己甲素对大鼠早期实验性矽肺的预防治疗作用。方法 取健康初成年大鼠90只随机分成汉防己甲素预防给药组、阳性对照组(同期染尘)、阴性对照组(不染尘)。用石英粉尘注入大鼠气管,造矽肺动物模型。染尘后第4天开始给药,治疗4周后分别处死动物进行全肺干湿重、羟脯氨酸含量、支气管肺泡灌洗液计数及分类、病理组织学等检查。结果 汉防己甲素组比阳性对照组体重早些逐渐接近正常;汉防己甲素组大鼠的干湿重低于阳性对照组(P<0.05);染尘第50d时羟脯氨酸含量仍与阴性对照组无差异,而阳性对照组与阴性对照组有统计学差异(P<0.05);病理组织学提示汉防己甲素组比阳性对照组肺实变略轻。结论 汉防己甲素对大鼠早期实验性矽肺的预防治疗有一定的改善作用。
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  T7.23 HBDE对RA诱导SH-SY5Y分化细胞的毒性效应

  钟玉芳;陈岑;王秀;安静

  2013, 27(S1): 194-195.

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  目的 探索六溴环十二烷(HBCD)神经毒性的分子机制。方法 反式维甲酸(RA)10 μmol·L^-1 RA诱导指数生长期的SH-SY5Y细胞48 h后,随机分为溶剂对照和A, B和C三个处理组,A组继续单独以10 μmol·L^-1 RA处理,B组为RA和10 μmol·L^-1 HBCD联合染毒组,C组为10 μmol·L^-1 HBCD作用组。24 h时拍摄神经细胞突起生长程度,免疫荧光法检测细胞突起生长标志蛋白MAP2的表达变化。4和24 h后Rhodamine 123检测细胞线粒体膜电位,Fluo-4检测钙离子浓度,并分别收集以上三个时间点的细胞检测AMPK, mTOR, Akt和GAPDH的蛋白活性或含量变化,结果 24 h后,与RA处理组相比,HBCD联合RA处理组具有长细胞突起的细胞数量较RA组减少,HBCD单独处理组24 h后细胞突起生长数量明显减少,与对照组相当;RA组和HBCD与RA联合组MAP2表达在24 h显著较对照组增加,HBCD染毒组MAP2表达对照组无显著差异,HBCD与RA联合组以及HBCD组MAP2表达均低于RA组;4和24 h时RA组线粒体膜电位与对照组相比无显著差异(P>0.05),RA联合HBCD组以及HBCD单独处理组的线粒体膜电位与对照组和RA组相比,4和24 h时均显著下降(P<0.05);RA组钙离子浓度[Ga²⁺]_i与对照组相比24 h时显著升高(P<0.05),RA与HBCD联合染毒组[Ga²⁺]_i 4 h时较对照组和RA组升高(P<0.05),24 h之后与RA组无显著差异(P>0.05),但仍高于对照组(P<0.05),HBCD组[Ga²⁺]_i 在4和24 h均高于对照组和RA组(P<0.05);与对照组和RA组相比,RA与HBCD联合组和HBCD组4 h时AMPK, mTOR和Akt表达均无变化,24 h后AMPK和mTOR表达增加,Akt表达降低。结论 HBCD对RA诱导分化的神经细胞有抑制细胞突起生长的作用,原因推测可能与线粒体膜电位下降、钙离子蓄积等线粒体功能损伤有关,对能量变化敏感的AMPK升高、促进细胞增殖的mTOR表达升高,可阻滞细胞分化,Akt表达降低则可能抑制细胞增殖。
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  T6.34 低水平职业性铅接触人群生物标志物间的关系

  杨红;张恒东;周倩倩;龚伟;朱宝立;李文超;周洋;王丽

  2013, 27(S1): 175-176.

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  目的 探讨铅毒性生物标志物用于评价低水平职业性接触铅人群健康危害的可行性、敏感性和特异性。方法 应用职业卫生检测方法测定江苏省某铅酸蓄电池生产企业作业场所铅烟与铅尘浓度,对该企业233名职业性铅接触工人和76名非职业性铅接触工人分别采用石墨炉原子吸收光谱法测定血铅(Pb-B)、血液荧光计法测定锌原卟啉(ZPP)、分光光度计法测定血δ-氨基乙酰酮戊酸脱水酶(ALAD)、Taqman荧光探针实时定量聚合酶链反应测定ALAD基因多态性,用石墨炉原子吸收光谱法测定尿铅(Pb-U)、分光光度测定方法测定尿δ-氨基乙酰丙酸(ALA-U),多元线性回归法分析其相关关系。结果 18个铅烟与30个铅尘检测点浓度分别为0.002~0.019和0.004~0.013 mg·m^-3;233名职业性铅接触工人Pb-B, Pb-U与ZPP之间相关;Pb-U≤70 μg·L^-1的218人(93.6%)中,15人(6.9%)Pb-B≥400 μg·L^-1;ALA-U仅与Pb-U相关,ALAD与Pb-B, ZPP相关;Pb-B<190 μg·L^-1时,Pb-B与ZPP不相关(r=0.18,P=0.068),与ALAD呈负相关(r=-0.81,P<0.01),Pb-B≥190 μg·L^-1时,Pb-B与ZPP呈正相关(r=0.36,P<0.01),与ALAD呈负相关(r=-0.65,P<0.01);233名接触铅工人中Pb-B<400 μg·L^-1者,其ALAD水平的95%参考值为26.57 μmol·L^-1;ALAD₁和ALAD₂等位基因频率分别为97.9%和2.1%;ALAD1-2基因型工人Pb-B高于ALAD_1-1基因型工人,ZPP水平和ALAD活性低于ALAD_1-1基因型工人,差异无统计学意义(P>0.05);ALAD_1-2基因型工人中Pb-B≥400 μg·L^-1比例高于ALAD_1-1基因型,差异无统计学意义(P>0.05);76名非接触铅工人中,ALAD_1-2基因型工人ALAD活性低于ALAD_1-1基因型工人,Pb-B和ZPP平均水平高于ALAD_1-1基因型工人,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 低水平职业性铅接触人群中,Pb-B是较Pb-U敏感的接触标志物,ZPP和ALAD是较ALA-U敏感的效应标志物;ZPP与Pb-B相关的阈值为190 μg·L^-1,ALAD可作为低血铅水平时毒作用的效应标志物;ALAD基因多态性对职业性铅接触人群与非职业性铅接触人群Pb-B水平及其毒性效应的影响不同。
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  T6.35 持续性职业锰暴露对工人多系统健康损害的队列研究

  陈康成;吕应楠;黄大敏;李琴;卿利;刘静;沈岳飞;邹云锋;杨晓波

  2013, 27(S1): 176-176.

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  目的 组建广西职业锰暴露工人健康队列(MEWHC),通过完成队列基线调查及职业健康体检,阐明持续性职业锰暴露对工人产生多系统的健康损害。方法 采用队列研究设计,以广西某大型锰系铁合金生产企业为研究现场,将在该锰系铁合金生产企业工作1年以上,于2011年7月-2012年9月参加职业健康体检的锰作业工人纳入队列,并进行基线调查。以冶炼工、铁合金加工等1538名工人作为暴露组,以同厂的配电工等辅助工350名作为对照组,并对不同工种岗位的锰尘浓度进行个体及定点采样,计算工人的锰累积暴露指数(CEI),结合该厂职业健康体检,评价锰暴露工人的健康损害程度。同时采用蒙特利尔认知评估量表(MoCA)对工人进行认知功能测试,并测定血浆多巴胺含量。结果 本队列共观察1888人,男性1197(63.4%),女性691(36.6%),平均年龄为40.2±7.8岁。神经认知测试结果显示,暴露组认知功能测试总分为23.62±4.61分,对照组为27.16±2.51分,差异具有统计学意义(P<0.05);经偏相关分析,CEI与认知功能呈负相关(r=-0.210,P=0.000)。此外,对照组多巴胺水平显著低于暴露组(P<0.05),暴露组血浆多巴胺水平有随CEI增加而呈下降趋势。暴露组尿隐血、尿蛋白异常检出率分别为10.4%和2.2%显著高于对照组2.0%和0.3%,差异具有统计学意义(P<0.05);将暴露组以CEI、尿锰浓度进一步分层,尿隐血、尿蛋白异常检出率有随锰CEI、尿锰浓度增加而呈上升趋势。肺功能测试显示,暴露组用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼气量(FEV_1.0)、一秒率(FEV_1.0/FVC)均值分别为3.805±0.904 L, 3.235±0.758 L, 85.61±9.55%,对照组FVC, FEV_1.0, FEV_1.0/FVC均值分别为4.078±0.923 L, 3.470±0.820 L, 85.69±9.59%。暴露组FVC和FEV_1.0均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),且暴露组FVC和FEV_1.0有随工龄增加而呈下降趋势(P<0.05)。结论 持续性职业锰暴露可对工人造成多系统的健康损害,其损害程度与锰暴露水平存在剂量-效应关系。长期锰暴露可导致工人神经认知功能损伤,且与锰CEI呈剂量-效应的关系;而血浆多巴胺可作为职业锰暴露人群早期神经损伤的效应指标。
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  T6.37 铝职业暴露工人血浆铝含量对认知功能的影响

  宋斐翡;王昊;贾志建;牛侨;路小婷

  2013, 27(S1): 177-178.

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  目的 本研究通过现状调查了解铝职业暴露人群的认知功能状况筛检轻度认知功能障碍(MCI)患者探讨其影响因素。方法 山东某铝厂电解工人及铝矿工人等共172例铝职业暴露工人,空腹采集静脉血液样本,用石墨炉原子吸收分光光度法检测血浆铝含量;采用简短精神状态量表(MMSE)、画钟实验(CDT)、数字广度(DP)、物体记忆实验(FOM)、言语流畅性测验(RVR)等问卷调查工人的一般情况及认知功能现状。其中MMSE和CDT能快速客观评价总体认知功能,DP, FOM及RVR可以全面考察受试者记忆能力。结果 以测得的工人血浆铝含量中位数(6.28 μg·L^-1)为界点将受试者划分为高内暴露组与低内暴露组,经统计分析发现,172名研究对象中有20名出现认知功能障碍,其中高暴露组13人,低暴露组7人,高暴露组MMSE总分为25.36±3.73,低暴露组为26.38±3.82,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。其两组间MMSE分项指标时间和地点定向力、短时记忆、计算力高暴露组明显低于低暴露组(P<0.01)。CDT高暴露组分数为2.88±0.23,低暴露组为3.12±0.68,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。DP, FOM及RVR实验中两组得分差异均有统计学意义(P<0.05)。且CDT, DP, FOM及RVR测试铝高暴露组明显低于低暴露组(P<0.01)。此外受测者性别、年龄、接害工龄、教育程度、饮酒及血铝含量等因素是问卷的得分的影响因素;若按照世界卫生组织发布的铝元素含量的健康最高值标准,以0.22 μmol·L^-1(5.94 μg·L^-1)为界将血浆铝组分为高内暴露组和低内暴露组, 发现认知功能损伤与不同血浆铝浓度组之间分布差异仍有统计学意义(P<0.05)。结论 长期职业性铝接触可影响工人的认知功能,且对认知功能的损害以记忆功能损害为主。
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  T9.27 纳米与超细二氧化钛和氧化锌颗粒的致突变性

  王艳;李小林;蒋静;邱璐

  2013, 27(S1): 227-227.

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  目的 比较了纳米与超细二氧化钛和氧化锌颗粒的致突变性差异。方法 采用Ames试验平板掺入法,选用TA97, TA98, TA100和TA102标准测试菌株,分别计数不加S9和加S9体外代谢情况下这四种菌株分别在超细颗粒和纳米级二氧化钛和氧化锌5个不同浓度下的回变菌落数。结果 超细与纳米二氧化钛颗粒在5, 10, 20, 100和500 μg/皿;超细和纳米氧化锌颗粒在5, 10, 25, 50和100 μg/皿剂量下均未引起测试菌株回变菌落数的明显增加,Ames试验结果均为阴性。结论 在本实验条件下,纳米和超细粒径的二氧化钛和氧化锌颗粒在实验剂量范围内均未显示致突变性。
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  T9.28 纳米二氧化硅颗粒血管内皮细胞毒性

  郭彩霞;李艳博;周维;段军超;于永波;孙志伟

  2013, 27(S1): 227-227.

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  目的 研究纳米二氧化硅颗粒的血管内皮细胞毒性。方法 本实验以体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型,对暴露于纳米二氧化硅颗粒可能产生的生物学效应及其机制进行初步的探索。采用透射电镜(TEM)观察纳米二氧化硅颗粒粒径、形貌及分散性;MTT法测定细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞膜的完整性;流式细胞术(FCM)检测细胞内ROS含量的变化;单细胞凝胶电泳(SCGE)法检测细胞内DNA损伤情况;实时荧光定量PCR法检测细胞内IL-6, IL-8, TNF-α和ICAM-1 mRNA水平的变化。结果 TEM结果显示,纳米SiO₂颗粒分布均匀,大小一致,颗粒呈球形,分散性好,未发生聚集。平均粒径为(63.88±10.34)nm。纳米二氧化硅颗粒作用于HUVECs,显示出血管内皮细胞毒性作用,且存在明显的剂量依赖关系。纳米二氧化硅颗粒暴露,可引起HUVECs细胞存活率下降,且随着作用剂量的增加和作用时间的延长,细胞存活率逐渐下降(P<0.05),其中100 mg·L^-1剂量作用48 h后细胞存活率下降至44.28%;可引起细胞膜完整性的改变,导致培养液中LDH释放增加;还可引发细胞内ROS水平升高,引起细胞DNA损伤,且上述细胞效应均表现为随颗粒作用剂量的升高而逐渐明显,呈现一定的剂量依赖关系。同时,100 mg·L^-1纳米二氧化硅颗粒作用下,细胞内炎性细胞因子IL-6, IL-8, TNF-α和ICAM-1 mRNA表达水平发生改变(P<0.01)。结论 纳米二氧化硅颗粒具有血管内皮细胞毒性,且毒作用存在明显的剂量依赖性,可降低HUVECs细胞存活率,破坏细胞膜的完整性,诱导细胞内ROS水平升高,致使细胞氧化还原失衡,进而引发DNA损伤,以及调节炎症相关基因转录,诱发炎症。
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  T6.38 Microarray analysis for lncRNA combined with mRNA expression profiles to identify hub lncRNA and mRNA involved in benzene hematotoxicity

  GAO Ai;YANG Jing;Bai Wen-lin;CHEN Li;ZHANG Le-feng;MA Jun-xiang;NIU Pi-ye;TIAN Lin

  2013, 27(S1): 178-178.

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  OBJECTIVE It was to identify key hub lncRNA and mRNA critical for benzene hematotoxicity. METHODS Microarray analysis for lncRNA combined with mRNA expression profiles was performed and the integrated analysis of lncRNA and mRNA expression was conducted to identify key hub genes, pathways and biological processes by using multiple bioinformatics analyses. RESULTS 1) We identified 677 differentially expressed lncRNA and 1821 differentially expressed mRNA from four patients of chronic benzene poisoning, three benzene-exposed workers and three health controls matched age and gender without benzene exposure. 2) Co-expression network of lncRNA-mRNA related to benzene hematotoxicity included 1984 connections among 89 lncRNAs and 726 mRNAs. Three main k-core subnets were identified and the majority of these genes were involved in immune response, hematopoiesis, B cell receptor signaling pathway and chronic myeloid leukemia. BC017297, NR_045623 and NR_028291 might be closely associated with benzene hematotoxicity. CONCLUSION LncRNA provided a rationale for the potential development of lncRNA-targeted approaches for the prevention and early diagnosis of benzene poisoning.
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  T6.39 Formaldehyde influence DNA damage repair process through PARP-1 pathway in the human bronchial epithelial cell lines

  JIA Xiao-wei;ZHENG Yu-xin

  2013, 27(S1): 178-179.

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  OBJECTIVE To investigate the cellular pathways or proteins involved in DNA damage repair induced by low concentration formaldehyde in human bronchial epithelial (HBE) cells. METHODS The cell counting Kit-8 was used to measure the cytotoxic effects of formaldehyde on HBE cells. An alkaline COMET assay was conducted to test DNA damage by formaldehyde. The protein expression level was assessed by Western Blot. We used RNA interference cell to test the role of ATM in formaldehyde-induced DNA damage repair and NBS1 and p-p53 expression. RESULTS In the results, we found that the formaldehyde could induce the single-strand breaks (SSBs) in low concentration of 5 μmol·L^-1. Interestingly, the SSB is accompanied with increased expression of ataxia telangiectasia mutated (ATM), Nbs1 and p-p53. In addition, formaldehyde-induced SSBs were quickly repaired in ATM siRNA depleted cells, demonstrating that ATM is not required for efficient completion of SSBs. Moreover, consistent with knocking down of ATM, expressions of Nbs1 were significantly decreased, and p-p53 expression was showed a slight decrease. Formaldehyde was also found to trigger up-regulation of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP). Furthermore, pretreatment of cells with PJ34, a specific PARP-1inhibitor, we found a high level of DNA damage and delayed repair in PARP-1 inhibited cells, as reflected by a significant increase of the three COMET parameters compared with controls. CONCLUSION In summary, our results indicate that low concentration FA-induced DNA damage repair may be through PARP-1 pathway, but not ATM pathway. These findings will help us to understand the signal transduction mechanisms involved in the carcinogenic effects of FA at DNA damage repair level.
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  T6.40 Proteomic analysis of hippocampal phosphoprotein reveals up-regulation of phosphorylated 14-3-3 theta in F344 rats exposed to 1-bromopropane

  HUANG Zhen-lie;Gaku ICHIHARA;Sahoko ICHIHARA;CHANG Jie;ZHANG Ling-yi

  2013, 27(S1): 179-179.

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  OBJECTIVE 1-Bromopropane (1-BP) has been introduced as an alternative toozone-depleting solvents and exhibits neurotoxicity both in experimental animals and human. To obtain further information on the underlying mechanisms of 1-BP-induced neurotoxicity in the central nerve system (CNS), a proteomic analysis was conducted to identify and characterize 1-BP-induced modification of phosphoprotein expression in the hippocampus of rats. METHODS Male F344 rats were exposed to 1-BP at 0, 400, or 1000 ppm for 8 h·d^-1 for 1 week and 4 weeks by inhalation (n=9 rats of each group). Hippocampal protein extracts (n=3 rats of each group) from control and 1000 ppm in 4-week exposure were resolved by two-dimensional electrophoresis (2DE), Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Staining and SYPRO gel staining for qualitation of phosphoproteins. Two-dimensional difference in gel electrophoresis (2D-DIGE) was conducted to quantitatively analysis of phosphoprotein (n=6 rats in each group) and matrix-assisted laser-desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) was used for protein identification. Selected protein was further confirmed by Phos-tag SDS-PAGE. RESULTS 2D-DIGE revealed 28 protein spots in 1000 ppm group of 4-week 1-BP exposure with statistically significant difference (P<0.05) compared with the controls, including 21 up-regulated spots and 7 down-regulated spots, which were detected as phosphoproteins by Pro-Q Diamond gel staining combined with SYPRO staining. MALDI-TOF-TOF/MS successfully identified 19 up-regulated spots and 7 down-regulated spots. These identified proteins participate in the biological processes of metabolic, immune, response to stimulus, transport and cellular communication, and involved in pathways including Parkinson's disease, apoptosis signaling, FGF and EGF receptor signaling pathway, etc. Expression of phosphorylated 14-3-3 theta protein was further confirmed by Phos-tag SDS-PAGE. CONCLUSION These results help us understand the pro-apoptosis mechanism of 1-BP-induced hippocampal response and establish potential biomarkers for neurotoxicity induced by 1-BP in the CNS.
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  T8.11 多杀霉素原药毒性

  殷霄;谢植伟;宋向荣;葛怡琛;曾玉梨;陆丰荣;陈晓燕;黄建勋

  2013, 27(S1): 211-211.

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  目的 研究多杀霉素原药的毒性作用特点和最大无作用剂量,为慢性毒性试验和安全生产提供剂量参考依据。方法 依据中华人民共和国国家标准GB-15670《农药登记毒理学试验方法》进行急性经口毒性试验和90 d亚慢性经口毒性试验,依据中华人民共和国卫生部2005年《化学品毒性鉴定技术规范》进行体外哺乳动物基因突变试验和染色体畸变试验。结果 91%多杀霉素原药对SD大鼠的急性经口半数致死剂量(LD₅₀)在雌性大鼠为6810 mg·kg^-1,雄性大鼠大于5000 mg·kg^-1。91%多杀霉素原药对体外培养的V79细胞HPRT位点基因突变试验和体外培养的CHL细胞染色体畸变试验结果均为阴性。91%多杀霉素原药对SD大鼠90 d连续经口染毒后,血常规结果显示高剂量组雌性动物白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞比积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)与对照组相比降低(P<0.05), 高、中剂量组雄性动物白细胞计数(WBC)与对照组相比降低(P<0.05)。尿常规结果显示高、中剂量组雌性动物尿亚硝酸盐(NIT)与对照组相比升高(P<0.01)。脏器系数显示中剂量组雄性动物脾体比与对照组相比升高(P<0.05)。高剂量组雄性动物脾体比、肾体比与对照组相比升高(P<0.05)。病理检查结果显示高剂量雌、雄性大鼠甲状腺病变总发生率与对照组相比均明显升高(P<0.05)。结论 91%多杀霉素原药的急性经口毒性属低毒级;91%多杀霉素原药不诱发体外培养的哺乳动物细胞基因突变和染色体畸变。91%多杀霉素原药对SPF级SD大鼠亚慢性(90 d)经口喂养试验的最大无作用剂量在雌性为5.13 mg·kg^-1,雄性为5.35 mg·kg^-1。91%多杀霉素原药可对动物血液系统和泌尿系统产生影响,并且使动物脾和肾等器官出现代偿性增大,对动物甲状腺可产生明显影响,甲状腺有可能是多杀霉素毒性作用的靶器官之一。
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  T6.41 Intervention study on apoptosis of SH-SY5Y cells induced by manganese

  MA Jun-xiang;CHEN Li;YU Tong;GAO Ai;TIAN Lin;NIU Pi-ye;

  2013, 27(S1): 180-180.

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  OBJECTIVE To investigated the variation of apoptosis rate, necrosis rate and cell cycle in SH-SY5Y cells after they exposed to MnCl₂ directly, or preconditioned with agonist (pyrroloquinoline quinine, PQQ) and suppressant (LY294002), respectively, and then exposed to MnCl2, which provided theoretical basis for the mechanism of Mn neurotoxicity and its possible interventions. METHODS The SH-SY5Y cells were cultured in Dulbecco's modification of Eagle's medium (Hyclone) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco), penicillin 50 mg·L^-1 and streptomycin 100 mg·L^-1 at 37℃ in a humidified air atmosphere containing 5%CO₂. They were divided into three groups, a non-pretreatment group and two intervention groups. In non-preconditioning group, SH-SY5Y cells were directly exposed to different concentrations of MnCl₂ (0, 0.5, 1.0, 2.0 and 4.0 mmol·L^-1) for 12 h, and the control was treated with 0.9% NaCl solution. In the two intervention groups, SH-SY5Y cells were preconditioned with 0.1 μmol·L^-1 PQQ and 10 μmol·L^-1 LY294002 for 1 h, respectively, and then treated with MnCl₂ in the same way with non-preconditioning group. After treatment, the cell viability, apoptosis rate, necrosis rate and every phases of cell cycle were detected by MTT and flow cytometry, severally. RESULTS The cell viability decreased in three groups compared to the control (P<0.01), and it dropped much more in LY294002 group than in non-preconditioning group. The rate of cell apoptosis and necrosis showed obvious dose-response relationships, which significantly increased in three groups with concentrations of MnCl₂ rising. And the increment in LY294002 group was much more than in non-preconditioning group, while the increment was less in PQQ group than in non-preconditioning group. The ratio of G₀/G₁ and G₂/M were significantly decreased but the percentage of S phase was obviously increased in three groups versus the control (P<0.01). And the decrements of G₀/G₁ and G₂/M ratio and increment of the percentage of S phase in LY294002 group were much more than in non-preconditioning group, while they were less in PQQ group than in non-preconditioning group. CONCLUSION Mn can promote apoptosis and necrosis, and vary cell cycle of SH-SY5Y cells. PQQ or LY294002 can protect or enhance, respectively, the neurotoxicity of Mn by regulating apoptosis, necrosis, and cell cycle of SH-SY5Y cells. Our findings provide reliable evidences that Mn-induced cells apoptosis and necrosis of may underlie crucial mechanisms of Mn-induced degenerative neuropathy. Furthermore, it is reasonable to speculate that PQQ may be an effective intervention in the process of Mn-induced degenerative neuropathy by reducing apoptosis rate and necrosis rate caused by Mn.
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  T6.42 Heat shock protein 10 modulated apoptosis induced by manganese in SH-SY5Y cell lines

  CHEN Li;SHI Zhi-xiong;XIAO Zhong-xin;GUO Cai-xia;ZHANG Jie;MA Jun-xiang;GAO Ai;TIAN Lin;NIU Pi-ye;

  2013, 27(S1): 180-181.

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  OBJECTIVE To examine cell viability, apoptosis and heat shock protein 10 (Hsp10) mRNA expression changes caused by Mn²⁺ in SH-SY5Y cells. METHODS SH-SY5Y cells are divided into experimental group and control group: Group A (normal saline, 0.9%NaCl) as control group, Group B (Mn²⁺ 0.5 mmol·L^-1), Group C (Mn²⁺ 1.0 mmol·L^-1), Group D (Mn²⁺ 2.0 mmol·L^-1), Group E(Mn²⁺ 4.0 mmol·L^-1) as experimental group. Cells are exposed to Mn²⁺ for 12 h, and then the cell viability was measured by MTT method. Cell Apoptosis was detected using flow cytometry with AnnexinⅤ-FITC/Propidium iodide (PI) staining. Meanwhile, the mRNA expressions of Hsp10 in SH-SY5Y were measured by real-time RT-PCR. RESULTS After exposed to Mn²⁺, the cell viability of group B, C, D and E(94.50%, 90.08%, 83.95% and 79.40% respectively) are obviously decreased compared with group A (P<0.01). The rate of cell apoptosis in group B, C, D, and E increased. According to the results of the AnnexinⅤ-FITC mark, the rate of cell apoptosis in group B, group C, group D, and group E increased 2.58, 4.65, 8.64, and 12.76 times as high as normal saline control group respectively;the rate of cell apoptosis in group B and group C increased significantly (P<0.05);the rate of cell apoptosis in group D and group E increased clearly significantly (P<0.01). According to the PI tag results, the rate of cell apoptosis in group B, C, D and E increased 1.27, 9.23, 5.38, and 3.19 times as high as normal saline control group respectively;compared with control group, the rate of cell apoptosis in group B increased significantly (P<0.05);the rate of cell apoptosis in group C, D and E increased clearly significantly (P<0.01). Real-time RT-PCR shows 0.95, 0.84, 0.63, 0.46 folds increase of Hsp10 mRNA expression in group B, C, D, and E respectively compared with group A. In SH-SY5Y cells, the rate of cell apoptosis increased but the Hsp10 mRNA decreased with the increased concentration of Mn²⁺. The correlation analysis between the rate of cell apoptosis and Hsp10 mRNA showed a negative correlation (r=0.996, P<0.01), suggesting that the Hsp10 expression level decreased and the rate of cell apoptosis increased. CONCLUSION With the increased concentration of Mn²⁺, Hsp10 mRNA expression and cell viability of SH-SY5Y cells declined, but the rate of cell apoptosis increased. And with the higher concentration of Mn²⁺, the Hsp10 mRNA concentration and the rate of cell apoptosis had a negative correlation, suggesting that cell oxidative stress and DNA mutations are the causes making the decrease of Hsp10 mRNA content, cell apoptosis and damage to nerve cells. The experimental results are almost consistent with other research results.
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  T7.1 New directions in toxicological studies of human diseases：from diet and chemical exposure

  ZHENG Wei

  2013, 27(S1): 181-182.

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  Increased occurrence of Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), essential tremor (ET) and other degenerative diseases suggests that far beyond genetic origins, the contributions of environmental exposure, occupational activity, and/or life style to these neurological diseases and disorders cannot be underestimated. This presentation will start with a brief review of multiple exogenous sources in these brain diseases, such as manganese (Mn)-induced parkinsonian disorder, lead (Pb)-associated AD pathology, and carboline (presented in the food)-induced essential tremors. The discussion will then be focused on the role of metal exposure in human diseases. The unique physical, chemical and biological properties of metals, which distinguish themselves from organic chemicals with regards to their distinctive effects on organ systems, will be first addressed. A detailed review then follows for metal toxicities on the central nervous system by using Mn-associated parkinsonian disorders as an example. The recent evidences by synchrotron X-ray fluorescence technique and PET scan will be presented to show the overlapping pathogenesis between manganism and idiopathic PD. The effect of metal exposure on the vascular system, such as Pb-induced vascular injury with an ensuing extravascular aggregation of amyloid polypeptides, will be extensively discussed. The specific data will establish that Pb exposure reduces Aβ clearance from brain, directly participates in physiochemical reaction with Aβ molecules, and increases the concentrations of other metals in brain tissues. This will be followed by discussion of metal accumulation in the bone as the source of internal exposure, a newly revitalized research area, by using bone accumulation of Mn as example. New data from this laboratory not only demonstrate an extensive accumulation of Mn in bone, but also reveal a significant correlation between bone Mn and Mn levels in targeted brain areas. Finally, the speaker will discuss the fast evolving trend in using newly developed/developing technologies such as synchrotron X-ray fluorescence (XRF) technique for precise location and quantitation of trace metals in tissues and the neutron-based fluorescent noninvasive quantitation technique for real-life human sample analysis in metal toxicological research. The presentation will focus on the new trends in emerging research fields, new directions in existing metal neurotoxicological research, and new technologies applicable to trace element research, in the hope to inspire the new ideas for toxicological research.
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  T7.2 Toxic effects of Western diet-induced obesity on the blood-brain barrier, the hippocampus, and memory

  Terry L DAVIDSON

  2013, 27(S1): 182-183.

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  Obesity and cognitive dementias, such as Alzheimer's disease (AD), are among the most pernicious and costly of challenges to human health and well-being. According to the World Health Organization (WHO), in 2008 there were more than half a billion obese adults world-wide, That number that has nearly doubled since 1980 and it projected to more than double again by 2030. Although the largest concentration of overweight and obese people currently reside in the Americas, increasing rates of obesity are also a cause for concern in Asia and other non-western societies. Alzheimer's disease (AD) and AD-like cognitive dementias are characterized by a progressive, age-related, deterioration in memory function which becomes so severe that independent living is impossible. Over 35 million people suffered from dementia across the globe in 2009. That number is expected to nearly double by 2030, with industrialized nations, including the United States and China, likely to see the largest increases. Obesity and cognitive dementia have traditionally been viewed as independent problems, that target brain structures and circuits that perform qualitatively distinct behavioral and biological functions. However, recent epidemiological and experimental findings suggest that both disorders may have much in common. For example, it appears that obesity in mid-life is associated with higher incidence of late-life AD and AD-like dementias, even when the effects of co-morbidities such as cardiovascular and metabolic disease, are taken into account. In addition, more recent findings link obesity to less severe forms of cognitive decline across the lifespan, from childhood to old age. While the root causes of both obesity and dementia are likely to be complex, these types of epidemiological findings suggest that both diseases might have similar origins. Our recent research indicates that one of these origins may be dietary. The "western diet" (WD) is energy-rich (with high levels of saturated fat and sugar), highly-palatable, low-cost, and its popularity has been linked to excessive caloric intake and obesity in western and westernized societies. Rats given free-access to WD exhibit both increased body weight and body adiposity and also show impairments on learning and memory tasks that are similar to the deficits shown by rats that have selective damage to the hippocampus. The hippocampus is medial temporal lobe structure that is an early site of neurodegeneration produced by exposure to toxins, ischemia, hypoxia and other insults, Furthermore, there is evidence that pathologies leading to AD and AD-like dementias have their origins in the hippocampus or the larger hippocampal formation. Our research shows that intake of WD weakens the protection afforded to the hippocampus by the blood-brain barrier (BBB) while leaving other brain areas that are involved with cognitive functioning undisturbed. Increased inflammation, infiltration of microglia, and reduced neurogenesis have also been observed in the hippocampus of rats maintained on WD. Furthermore, like exposure to WD, neurotoxic damage that is confined to the hippocampus increases food intake and body weight gain as a consequence of what appears to be impairment in the learned inhibitory control of appetitive and eating behavior. The adverse effects of WD on hippocampal-dependent cognitive function are only observed in rats that are also sensitive to the obesity-promoting effects of that diet. These findings suggest that consuming a WD may have toxic effects that can disrupt both energy regulation and cognitive functioning. Overall, our results support a "vicious-cycle" model in which intake of WD impairs hippocampal-dependent memory function, leading to impaired cognitive inhibitory control of feeding behavior. This impairment results in further intake of WD which leads to progressively greater deterioration of hippocampal functioning and ultimately to serious cognitive dysfunction.
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  T7.3 Environmental causes of Alzheimer’s disease：Lead exposure and brain amyloid aggregation

  DU Yan-sheng

  2013, 27(S1): 183-184.

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  Epidemiological evidences have shown that the altered epigenetic regulatory factors underlying the formation of amyloid plaques is significantly associated with lead (Pb) exposure in humans. Animal studies have also provided the evidence of early Pb exposure-associated late-onset of amyloid aggregation in brain tissues. Since the hallmark of AD pathology is the aggregation of beta-amyloid (Abeta), it became interesting to seek the direct linkage between Pb exposure and the formation of amyloid plaques. SWDI APP transgenic mice developed in this laboratory have the ability to overexpress human amyloid precursor protein (APP) with a mutation (V717F) that causes the formation of amyloid plaques at 2-3 months of age. The transgenic mice were exposed to 27 mg Pb/kg, once daily by oral gavage 5 d per week for 6 weeks. Brain samples were subjected to immunohistrochemical staining, A quantification, and plaque examination. We found a significant increase of Aβ in the CSF, brain cortex and hippocampus. There was also a significant increase of amyloid plaques in the hippocampal region. More interestingly, the deposits of amyloid aggregation were observed alongside the cerebral capillaries. While APP expression and amyloid secretase (beta- and gamma-) activities were not changed in Pb-exposed animals, the expression of low-density lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP1) was significantly decreased in the choroid plexus. To understand if the LRP1 participated in the clearance of Abeta by the choroid plexus, we treated the transgenic mice with the intravenous immunoglobulin (IVIG) and found that IVIG decreased Abeta in brain but increased Abeta in blood. Both blocking LRP1 using a specific LRP1 inhibitor and knocking-down LRP1 by siRNA technique effectively antagonized IVIG effect, suggesting that IVIG-induced Abeta reduction in brain is due to the increased efflux of Abeta via LRP1-mediated mechanism. Pb, by interacting with LRP1, may block the Abeta efflux or clearance mechanism existing in the brain barrier system leading to Abeta accumulation in brain. The current study is gearing towards the understanding of the molecular mechanism whereby Pb exposure alters the Ab clearance and potentiates the Ab aggregation along cerebral microvessels. Our studies will better explore the trans-membrane transport mode of Ab in brain and help develop the approaches for treatment of AD and protection again the environmental insults that contribute to the etiopathological causes of AD.
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  T7.4 Manganese neurotoxicity：Lessons from worms to neonates

  Michael ASCHNER

  2013, 27(S1): 184-184.

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  Manganese is an essential mineral required for normal growth and development. Exposure to high Mn concentrations results in destructive symmetrical lesions in the basal ganglia, particularly in the globus pallidus (GP), a disease referred to as manganism; it shares multiple features with Parkinson's disease (PD). Combining genetics and biochemical assays, we established in the nematode (C elegans) that dopamine (DA) is responsible for Mn-induced DAergic neurodegeneration and that this process (1) requires functional DA-reuptake transporter (DAT-1) and (2) is associated with oxidative stress and lifespan reduction. Additional studies tested whether parenteral nutrition, PN (which is routinely supplemented with Mn) and liver disease represent risk factors for increased Mn brain deposition in human neonates. Brain Mn was assesed by T1 relaxation (T1R) times (using magnetic resonance imaging; MRI) focusing on the GP. Brain Mn and its relationship to total dietary Mn, total days on PN, conjugated bilirubin levels and blood Mn concentrations was determined. Dietary Mn exposure was found to be inversely associated with GP T1R. The results establish that T1-weighted MRI can be used to screen infants on prolonged PN for increased brain Mn deposition. Hepatic cholestasis was also found to represent a risk factor for increased brain Mn deposition in neonates receiving PN. Combined our data suggest that some infants receiving prolonged PN may be at risk for Mn neurotoxicity.
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  T7.5 锰的神经毒性及其相关机制

  蔡同建;赵芳;曹子鹏;刘明朝;陈景元;骆文静

  2013, 27(S1): 184-185.

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  锰的毒性正受到日益关注。神经系统是锰的主要毒作用器官,成年个体锰中毒主要表现为神经毒性,可出现明显的锥体外系受损症状,与帕金森病症状类似。同时,锰还可导致儿童智力发育迟缓。为深入揭示锰神经毒性的机制,近年来,我们围绕关键分子的修饰、表达与降解以及小胶质细胞的活化两个方向开展了锰的神经毒性机制研究。在关键分子的修饰、表达与降解方面,我们首先围绕α突触核蛋白, tau, p21蛋白开展研究。α突触核蛋白和tau都在神经退行性疾病发生过程中发挥重要作用,我们首先发现,锰可通过诱导ERK MAPK激活诱导α突触核蛋白高表达和tau过度磷酸化,两者均参与锰的神经毒性。进一步研究发现两者之间存在一定相互作用,同时这种相互作用也参与了锰的神经毒性。p21作为周期白依赖激酶抑制因子中CIP家族中的一员,其表达对细胞增长停滞起关键作用。我们发现,锰可以通过促进启动子的活性增加p21 mRNA 以及蛋白的表达并进一步使其发生G₂/M细胞周期阻滞并最终导致细胞毒性。在确定了上述三个蛋白在锰神经毒性中的作用后,我们探讨了真核细胞内主要的降解系统蛋白酶体通路和自噬通路在锰毒性中的作用。发现一方面锰可以通过诱导氧化应激抑制蛋白酶体活性,而另一方面锰诱导大鼠黑质自噬水平先增高再降低,同时自噬水平改变可能与mTOR/p70s6k途径有关。在PC12细胞,锰诱导自噬水平增高,同时自噬水平增高也与mTOR/p70s6k途径抑制有关。进一步发现锰诱导自噬水平增高是一种代偿性保护效应,这种代偿效应可能与对α突触核蛋白的降解作用有关。小胶质细胞在多种神经疾病中发挥重要作用。我们通过体内外研究发现锰的毒性过程中伴随小胶质细胞活化,表现为细胞形态学的改变以及iNOS, TNFα, IL-1β等神经炎性因子表达的增高。利用特异性的小胶质细胞活化抑制剂能够抑制锰所诱导的小胶质细胞活化以及多巴胺能神经元的损伤。我们的结果初步证实小胶质细胞活化在锰诱导的多巴胺能神经毒性过程中可能发挥着关键的作用,抑制小胶质细胞活化可以作为一种防治锰神经毒性的有效手段。通过以上两方面的研究,我们为进一步深入认识锰的神经毒性机制提供了有价值的新资料,同时也为锰神经毒性的防治提供了新的可能途径。
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  T7.6 丙烯酰胺神经突触损伤及干预的体内研究

  肖经纬;于常艳;牛凯龙;牛勇;李斌;郑玉新

  2013, 27(S1): 185-185.

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  目的 研究其在丙烯酰胺(ACR)神经损伤中的作用并进行针对性的干预,以期为ACR职业危害的防治提供一定的线索和依据。方法 ① ACR神经损伤动物模型建立:ACR腹腔注射7.5, 15和30 mg·kg^-1染毒3周,体重、神经行为学参数(步态评分、热觉指数)结合病理学测试提示动物神经损伤指征;② ACR神经突触损伤的定量分析:突触结构损伤(电镜突触结构参数变化)和功能损伤(突触素Ⅰ定性、定量、定位)测试;ACR突触损伤后通过神经递质传导链激发下游神经细胞结构和功能损伤(DRG神经元电镜结构和关键酶活性变化);③ 脑源性神经营养因子(BDNF)对ACR所致神经损伤动物水平干预评价:体重、神经行为(步态评分、后肢撑力)、组织病理、突触超微结构、组织和血浆BDNF含量测试等。结果 ① ACR神经损伤动物模型的特点:染毒集中、周期不长、体征明确、神经毒性针对性较强;② ACR损伤神经突触,突触活性带长度缩短、突触数量减少、突触素Ⅰ蛋白表达较对照显著降低(P<0.05);神经突触损伤继发下游神经细胞损伤,节细胞器破坏及节内神经纤维结构紊乱,随染毒剂量增加,ATP酶活性降低;③ 适当剂量的BDNF在动物水平可缓解ACR所致神经损伤效应。结论 ① ACR可造成神经突触结构和功能损伤,突触素Ⅰ是其中的重要效应因子,突触结构参数的变化以突触前较为明显;② 适当剂量的BDNF可在体内对ACR的神经毒性发挥一定的拮抗作用。
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  T4.14 纳豆脂肽对人乳腺癌细胞MCF-7的作用

  安秀峰;安雪娇;刘河汝;张波

  2013, 27(S1): 128-128.

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  目的 初步探讨纳豆脂肽对人乳腺癌细胞MCF-7的作用。方法 纳豆脂肽0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4和8 mg·L^-1作用MCF-7细胞12 h后,MTT法检测细胞存活率,活细胞工作站观察细胞形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期分布。结果 纳豆脂肽作用MCF-7细胞12 h以后,纳豆脂肽1, 2, 4和8 mg·L^-1可以显著抑制MCF-7的存活率(P<0.05),且呈一定的剂量效应关系,其IC₅₀是3.68 mg·L^-1。活细胞工作站下观察细胞出现了明显的衰老现象,逐渐由梭形皱缩为圆形。纳豆脂肽1, 2和4 mg·L^-1时对MCF-7的细胞凋亡率有显著影响,细胞凋亡率分别为8.47%, 9.47%和31.04%(P<0.05)。流式细胞仪检测细胞周期分布发现,随着脂肽浓度的增大,G₀/G₁期细胞所占百分比从68%下将至48%,S期细胞所占百分从20%上升至41%,表明纳豆脂肽可以将细胞周期阻滞在S期。结论 纳豆脂肽可以抑制MCF-7细胞的增殖,引起MCF-7的凋亡,并将细胞周期阻滞在S期。
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  T4.15 大鼠急性经口暴露毒死蜱的毒物代谢动力学和毒物效应动力学

  吴惠;乙楠楠;李亭亭;何贤松;赵敏娴;姚欣雅;王灿楠

  2013, 27(S1): 128-128.

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  目的 研究毒死蜱毒代动力学和毒效学的特征。方法 雌性SD大鼠一次性灌胃染毒,毒死蜱12.5,25,50和100 mg·kg^-1,染毒后1, 3, 6, 12和24 h分别在每个剂量组随机选择3只大鼠,乙醚麻醉,股动脉取血,颈椎脱臼处死,分离大脑皮质,用高效液相色谱法测定血清中毒死蜱(CPF)和3,5,6-三氯-2-吡啶(TCP)的浓度,胆碱酯酶试剂盒测定血清和大脑皮质中乙酰胆碱酯酶(AChE)活性。结果 血清毒死蜱和TCP的浓度随时间变化,时量曲线表现为先上升后下降,前者峰值浓度出现在染毒后3 h,后者为6 h左右;血清和皮质的AChE活性随时间变化,时量曲线表现为先下降后上升,血清AChE活性在染毒后3~6 h抑制程度最大,皮质AChE在染毒后6~12 h抑制程度最大。结论 毒死蜱经口暴露的毒代动力学特征为血清CPF和TCP浓度的时量曲线先上升后下降,毒效学的特征为血清和皮质的AChE活性的时量曲线先下降后上升。
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  T9.34 石墨烯量子点的生物学效应

  张智军;马宇飞;崇羽

  2013, 27(S1): 230-230.

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  目的 探讨石墨烯量子点(GQD)的生物学效应及安全性尚不清楚。方法 采用WST检测、ROS活性氧检测和Annexin凋亡检测等手段研究了GQD的细胞毒性,并研究其在小鼠体内的分布和代谢途径,最后按多次给药方式研究GQD对小鼠的影响。结果 实验结果表明,GQD为160 mg·L^-1未表现出明显细胞毒性。注射了GQD的小鼠未观察到明显异常或死亡,但注射了GO的小鼠在多次给药后期出现部分死亡的情况,存活的小鼠体重与对照组没有差异。解剖观察及组织切片后发现GQD对小鼠脏器没有影响,但GO在其体内蓄积造成小鼠肝肾变黑。血常规和血生化分析结果表明,注射了纳米材料的小鼠与对照组没有明显变化。结论 GQD未表现出明显的生物毒性,其生物安全性和生物相容性明显优于常用的氧化石墨烯。
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  T4.17 槲皮素-3-o-新橙皮糖苷改善L6细胞胰岛素抵抗及其作用机制

  陆明旸;张岭;马洁桃;来伟旗;刘臻;李卫;王茵

  2013, 27(S1): 129-129.

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  目的 观察槲皮素-3-o-新橙皮糖苷对L6肌管细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗;脂肪酸消耗以及对PPARα; PPARγ; GLUT4表达量的调节作用及其作用机制。方法 以250 μmol·L^-1的脂肪酸诱导形成L6肌管细胞胰岛素抵抗模型,以槲皮素-3-o-新橙皮糖苷干预24 h后,葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量,气相色谱法检测脂肪酸消耗量,Wester蛋白质印迹法检测细胞中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)以及PPARα和PPARγ的表达量。结果 槲皮素-3-o-新橙皮糖苷处理可提高L6细胞对葡萄糖的消耗(P<0.01),降低细胞脂肪酸摄入(P<0.05),上调GLUT4和PPARγ蛋白表达量(P<0.01),但对PPARα的表达量无明显影响。结论 槲皮素-3-o-新橙皮糖苷可提高L6细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量,降低脂肪酸摄入,调节PPARγ和GLUT4的表达,这些可能是受试物缓解胰岛素抵抗的机制之一。
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  T3.75 线粒体功能调节在环维黄杨星D抗多柔比星心脏毒性中的作用

  郭茜;郭家彬;袁海涛;赵君;彭双清

  2013, 27(S1): 107-108.

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  目的 研究环维黄杨星D(Cvb-D)对心多柔比星(DOX)心脏毒性保护作用的作用机制。方法 成年C57/BL小鼠每天单次灌胃给予Cvb-D(1 mg·kg^-1),连续给药4 d,随后单次腹腔注射给予DOX(15 mg·kg^-1)或生理盐水。DOX给药4 d后,采用无创超声心动图技术评价心功能,TBARS和DNPH比色法检测心肌组织脂质过氧化和蛋白羰基化水平,检测心肌组织中氧化型/还原型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH/GSSG)的比值以及线粒体超氧化物歧化酶(MnSOD)的活性;利用Western blot检测细胞浆/线粒体中细胞色素C的表达水平,以及线粒体生成调控关键蛋白过氧化物增殖体激活受体γ共激活因子(PGC-1a)和核转录因子(Nrf-1)的蛋白表达;qPCR测定线粒体基因(mtDNA)拷贝数。结果 与对照组相比,Cvb-D可明显改善DOX诱导的心功能改变,降低DOX引起的左心室舒张末期内径(LVIDD)和左心室收缩末期内径(LVIDD)增加、提高左室短轴缩短率(FS,%)和左室射血分数(EF,%)等参数;Cvb-D可减轻DOX诱导的心肌组织氧化损伤,降低心肌组织脂质过氧化和蛋白羰基化损伤程度,抑制DOX引起的GSH/GSSG比例下降,并改善DOX诱导的MnSOD活性下降和线粒体细胞色素C释放。此外,Cvb-D还能够显著减轻DOX对心肌组织线粒体生成(包括mtDNA拷贝数、PGC-1a和Nrf-1的蛋白表达等)的抑制作用。结论 Cvb-D对心DOX心脏毒性的保护作用与抑制心肌线粒体氧化应激、保护线粒体的生成功能密切相关。
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  T3.76 传统药物中重金属安全性评价现状与新思路

  魏立新;杜玉枝;李岑;高婷婷;毕宏涛;杨红霞

  2013, 27(S1): 108-108.

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  重金属与安全,是重大民生问题和世界性难题。追其根,究其源,才能得其策;正其理,得其法,才能解其难。只有建立重金属安全性评价的新理论与新方法,改变世界上以元素代替化合物的片面毒性评价模式,才能为重金属安全性的科学与客观评价扫清道路、奠定基础。将传统医学知识经验与现代科学技术相结合,是解决重金属安全性评价难题的最好切入点与途径。国内外有关背景:(1)重金属安全性问题,国内外关注度高、争议大。(2)重金属的长期药用历史及其临床价值。(3)片面的评价模式:以元素代替化合物、以食品标准代替药品标准。(4)评价重金属安全性的研究方法与技术。解决问题的新思路:(1)综合历史现状,充分交流信息,达成基本共识。尊重含重金属药物长期应用的世界历史,探讨重金属及含重金属药物的临床药用价值,特别是在炮制方法、剂量大小、服用时限、方剂配伍、临床经验等方面可能蕴含的科学道理;深入充分了解重金属安全性的国内外研究现状,包括日常生活环境中的重金属对人体健康的影响;关注其引起社会争议的焦点内容、不同声音、新的思路等;达成对重金属在一定条件下毒-效双重作用的基本共识。(2)明确问题特性,分析问题成因,把握问题重点。关注重金属安全性问题的评价特性(能具体衡量的指标、尺度等),搞清问题的实质,准确、完整、真实地表达问题;充分利用集体力量,用科学的分析方法找出造成重金属安全问题的所有可能原因;透彻分析各种类型问题间的逻辑关系,研究重金属用药安全的关键环节,包括重金属形态结构、价态配位、动态代谢、量效关系、毒效机制等;把握重要要因,了解各要因对问题的影响度各占多少,明确重点改善方面是什么。(3)凝练科学问题,落实方法技术,形成解决方案。在明晰重金属安全性重点问题形成原因基础上,进一步凝练出关键科学问题与技术难点;研讨重金属安全性评价的新技术、新方法、新理论,特别是代表性重金属与机体之间构-效-毒、量-效-毒、态-效-毒的识别和评价方法技术;建立多学科交叉解决思路,避免只考虑单一方向而不具多样性,以及预先设定解决方案而忽略创意方案;在方向选取、轻重缓急、资源配置等方面形成战略解决方案。
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  T4.19 咖啡酸苯乙酯与维生素E协同抗氧化损伤作用

  柏桦;刘瑞;张伟;王欣;海春旭

  2013, 27(S1): 130-130.

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  目的 采用不同氧化损伤模型中研究咖啡酸苯乙酯(CAPE)和维生素E是否存在协同抗氧化作用。方法 采用化学发光模型、微粒体脂质过氧化模型及伽马射线照射所致的L929细胞氧化损伤模型, 在体外及生物体系中研究CAPE和维生素E的协同抗氧化作用及可能的机制。结果 在三种化学发光体系中,CAPE和维生素E单独作用均可剂量依赖性的清除DPPH、超氧阴离子、羟自由基,联合作用后,CAPE 100 μmol·L^-1+维生素E具有协同清除DPPH作用,CAPE 0.025, 0.05 μmol·L^-1+维生素E具有协同清除超氧阴离子作用,CAPE 0.125, 0.25 μmol·L^-1+维生素E具有协同清除羟自由基作用。在CHP、Vc/Fe、NADPH/CCI4诱导的微粒体脂质过氧化模型中,CAPE单独作用可剂量依赖性的抑制脂质过氧化,Trolox单独作用存在促脂质过氧化作用,CAPE与维生素E联合作用使抗脂质过氧化活性显著增强。在射线照射导致的细胞氧化损伤模型中,与单独作用相比,CAPE与维生素E联合作用能显著降低ROS的产生,增加细胞活性,减轻射线导致的细胞膜脂质过氧化损伤,升高还原型谷胱甘肽水平,降低氧化型谷胱甘肽水平,促进Nrf2、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的表达,对过氧化氢酶,过氧化物歧化酶并无显著作用。结论 CAPE和维生素E具有显著的协同抗氧化作用,两者协同作用的基础可能为直接清除ROS,抑制脂质过氧化,通过调控Nrf2为核心的关键抗氧化酶的表达促进GSH循环。
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  T3.78 甘露醇甘油注射液对大鼠体内红细胞溶血的安全性

  黄立建;马丽;曾贵荣;邓友田;刘学武;蒋飞荣;张丹;潘善庆;姜德建

  2013, 27(S1): 109-109.

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  目的 观察不同剂量和不同给药速度对SD大鼠体内红细胞溶血的影响,检测给药后游离血红蛋白及间接胆红素的含量,探讨甘露醇甘油注射液对体内红细胞溶血作用的影响。方法 (1)雄性SD大鼠分为0.9%氯化钠注射液3 ml·min^-1组,0.9%氯化钠注射液6 ml·min^-1组,0.9%氯化钠注射液10 ml·min^-1组和甘露醇甘油注射液3, 6和10 ml·min^-1组,大鼠尾静脉给予相应的受试品,给药体积均为1 ml/只。(2)雄性SD大鼠分为0.9%氯化钠注射液组(5, 15和30 ml·kg^-1)和甘露醇甘油注射液组(5, 15和30 ml·kg^-1);5%甘油组(30 ml·kg^-1),10%甘油组(30 ml·kg^-1),10%甘油氯化钠注射液30 ml·kg^-1组,20%甘露醇注射液30 ml·kg^-1组,复方甘露醇30 ml·kg^-1组,各组给药速度均为6 ml·min^-1。0.9%氯化钠注射液30 ml·kg^-1组,甘露醇甘油注射液30 ml·kg^-1组,5%甘油30 ml·kg^-1组,10%甘油30 ml·kg^-1组,10%甘油氯化钠注射液30 ml·kg^-1组,20%甘露醇注射液30 ml·kg^-1组,复方甘露醇30 ml·kg^-1组,各组给药速度均为10 ml·min^-1。以上各组分别在注射给药后2和24 h眼眶采血,2000 rpm离心5 min,取血浆测定游离血红蛋白和间接胆红素含量。结果 不同剂量(5, 15和30 ml·kg^-1)、不同给药速度(3, 6和10 ml·min^-1)对大鼠体内红细胞溶血影响,发现5%甘油和10%甘油能引起体内兔红细胞的溶血,而甘露醇甘油注射液及其他受试品则无溶血作用;10%甘油在两种速度静脉给予时,大鼠红细胞均有明显的溶血,5%甘油未见溶血。结论 甘露醇甘油注射液对SD大鼠体内红细胞无明显溶血作用。
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  T3.79 HJ提取物对Beagle犬心血管系统和呼吸系统的影响

  彭冬冬;邓友田;卢宁湖;曾贵荣;王徽;潘善庆;姜德建

  2013, 27(S1): 109-110.

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  目的 研究HJ提取物对Beagle犬心血管系统和呼吸系统功能的影响。方法 健康Bealge犬按5 ml·kg^-1灌胃HJ提取物高、中、低剂量组(750, 375和25 mg·kg^-1)给药。测量血压,采用标准Ⅱ导联测量心电各项指标,采用一次性气管插管,测量呼吸频率和呼吸深度,分别记录给药后15, 30, 45, 60, 90, 120, 180及240 min等时间点血压、心电及呼吸值。观察HJ提取物对Beagle犬血压、呼吸及心电指标的影响,评价其对Beagle犬心血管和呼吸系统的安全性。结果 (1)对血压的影响:HJ提取物高、中、低剂量组(750, 375和25 mg·kg^-1)收缩压、舒张压、平均压各时间点与阴性对照组比较均无显著性差异。与同组给药前基础值比较,HJ提取物低剂量组(25 mg·kg^-1)平均压给药后240 min值较基础值显著性降低(P<0.05),且在正常范围内。(2)对心电指标的影响:HJ提取物(25, 375和750 mg·kg^-1)对动物心率、P波、T波、R波、PR间期、QT间期、QRS间期与同时间点阴性对照组比较,均无明显差异。与同组给药前(基础值)比较,心率、P波、T波、PR间期、QRS间期、QT间期、ST段均无显著性差异;HJ提取物(25, 375和750 mg·kg^-1)给药后90, 120和180 min R波与基础值比较显著升高(P<0.05),但与同时间点阴性对照组R波值比较无显著差异,且值与其他时间点各值变化不大,均在正常波动范围内,说明此变化与供试品无关,无毒理学意义。(3)对呼吸指标的影响:HJ提取物各给药剂量组动物的呼吸频率与潮气量与阴性对照组比较均未见与药物相关的毒理学改变。结论: 在本试验条件下,HJ提取物各剂量对Beagle犬血压、心电指标和呼吸功能未见明显影响。
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  T5.16 4E-BP1在放射损伤细胞中参与蛋白质的翻译调控

  骆慧惠;周平坤

  2013, 27(S1): 151-151.

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  目的 本研究进一步确定真核翻译起始因子4E-结合蛋白1(4E-BP1)磷酸化在电离辐射细胞中对蛋白质翻译的调节作用以及电离辐射细胞中G₂/M检查点和纺锤体结构检查点的功能,研究 磷酸化4E-BP1在维持细胞基因组稳定性中的作用。方法 采用shRNA技术构建4E-BP1基因沉默的细胞模型;采用⁶⁰Co γ射线室温照射处理HepG2细胞;组蛋白H3 Ser10磷酸化分子标记物(M期细胞)结合流式细胞术,实时监测γ射线照射诱发DNA损伤细胞的细胞周期进程改变;用微管破坏剂Nocodazole诱发细胞有丝分裂阻滞,从有丝分裂阻滞细胞比例及撤出Nocodazole药物后细胞恢复有丝分裂进程的时程变化,判断纺锤体结构检查点机制;细胞克隆形成实验检测细胞存活率;Western blot分析蛋白质的表达。结果 经4 Gy照射HepG2细胞,T37/46位点磷酸化的4E-BP1在照射后1~2 h内降低,随后恢复至正常水平,S65位点的磷酸化在2~4 h内表现下降的趋势。结论 电离辐射能够引起4E-BP1磷酸化的改变。
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  T5.17 ⁶⁰Coγ射线对人外周血淋巴细胞凋亡和周期的影响

  刘红艳;刘建功;张慧芳;党旭红;左雅慧;段志凯

  2013, 27(S1): 151-151.

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  目的 探讨⁶⁰Co γ射线对人外周血淋巴细胞凋亡和周期的影响。方法 采用⁶⁰Co γ射线照射人外周血淋巴Peng-EBV,照射剂量为0, 0.2, 0.6, 3.0和6.0 Gy,剂量率为1.013 Gy·min^-1,于照射24 h后,用流式细胞仪检测细胞周期(PI染料)和凋亡(Annexin V-FITC/PI染料)的变化。结果 (1)流式细胞术(FCM)分析显示,0, 0.2, 0.6, 3.0和6.0 Gy 5组细胞的凋亡率分别为:(12.05±0.59)%, (13.38±1.16)%, (10.89±1.55)%, (9.12±0.39)%和(11.67±0.67)%,P=0.18, 组间没有统计学意义;但细胞的早期凋亡率分别为:(3.34±0.43)%,(4.31±0.31)%,(3.39±0.09)%,(2.40±0.25)%和(3.06±0.43)%,P=0.05, 组间有统计学意义;死亡率分别为:(2.63±0.77)%, (2.20±0.26)%, (2.24±0.35)%, (5.05±0.26)%和(4.18±0.26)%,P=0.06,组间有统计学意义;正常细胞所占比例分别为(84.98±1.37)%, (84.43±1.36)%, (86.88±1.53)%, (85.83±0.12)%和(84.15±0.42)%;P=0.05, 组间有统计学意义;(2)细胞滞留于G₂/M期的比率分别:(5.47±1.46)%, (5.90±2.60)%, (8.74±4.71)%, (14.55±5.75)%和(22.65±14.05)%; P=0.01, 组间有统计学意义;S期的比例分别:(31.72±2.94)%, (30.53±4.5)%, (29.64±4.2)%, (23.94±3.2)%和(22.77±1.61)%;P=0.13, 组间有统计学意义;结论 0.2 Gy的⁶⁰Coγ射线能够诱导淋巴细胞株Peng-EBV发生早期凋亡。在0.2~6 Gy范围的⁶⁰Coγ射线能够使淋巴细胞株发生 G₂/M期阻滞,随着剂量的增加,S期细胞呈下降趋势,G₂/M期细胞比例呈上升趋势。
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  T3.62 ICAM-1和MCP-1在糖尿病肾病SD大鼠肾中的表达

  孙侠;武昕;林小婷;饶子亮;钟志勇;邝少松

  2013, 27(S1): 100-101.

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  目的 制作糖尿病肾病SD大鼠模型,观察糖尿病肾病大鼠肾的病理学改变,测定ICAM-1和MCP-1在糖尿病肾病大鼠肾中的表达。方法 SD大鼠随机分成正常对照组、模型组两组,模型组SD大鼠隔夜空腹12 h,按65 mg·kg^-1一次性腹腔注射1%的链脲佐菌素(STZ)溶液,12周后行安乐死处死动物取双侧肾,4%多聚甲醛固定,常规制片,H&E染色,PAS染色,显微镜下观察肾组织的病理学改变,同时免疫组化法测定肾组织中ICAM-1和MCP-1的表达。结果 正常对照组SD大鼠肾未见明显病理异常;模型组SD大鼠肾镜下见部分肾小球体积增大、肾小球毛细血管基质增生,部分肾小管上皮细胞轻度透明变性,其中1只大鼠肾见慢性肾盂肾炎。模型组SD大鼠肾小球平均横截面积(MGA)较正常对照组显著增大,模型组SD大鼠肾小管上皮细胞透明变性、肾小球基质增生较正常对照组显著增多。模型组SD大鼠髓质部分肾小管内ICAM-1表达阳性,阳性着色平均光密度值较正常对照组显著增加;模型组SD大鼠肾皮质部分肾小管MCP-1阳性表达,阳性着色平均光密度值与正常对照组比较未见统计学差异。结论 模型组SD大鼠肾ICAM-1表达升高,提示ICAM-1在糖尿病肾病早期发挥重要作用。
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  T3.81 恒河猴静脉注射TX002单次给药毒性试验及伴随毒代动力学

  赵素微;崔艳君;魏金峰;王爱平;

  2013, 27(S1): 110-111.

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  目的 采用近似致死剂量法,通过食蟹恒河猴单次静脉注射TX002,观察动物出现的急性毒性反应和药物暴露情况,为TX002毒性评价和临床用药提供参考信息。方法 采用近似致死剂量法进行测定,共使用6只食蟹猴,雌雄各半,静脉注射,给药体积5 ml·kg^-1,给药剂量分别为2000, 3000, 4500, 6750, 10 125和15 500 U·kg^-1,其中15 500 U·kg^-1剂量已为最大给药剂量。同时分别在给药前、给药后第14天采血,进行相应的血液学、血清生化、凝血、心电图指标测定;在给药前、给药后第7和14天进行体重、体温测定。给药当天,药前、药后10 min, 30 min, 2, 3, 6, 8和24 h采血进行毒代分析。结果 给药后第7和14天,各给药组动物体温未见明显异常。给药后第7天15 500,10 125,6750和4500 U·kg^-1组动物体重下降,给药后第14天15 500和10 125 U·kg^-1组动物体重下降。给药后第14天:各给药组动物心电图、血液学、血清生化、凝血指标与药前比较,均未见明显异常。食蟹猴单次给予TX002的全身暴露水平,用T_max, T_time和AUC衡量,其在给药后所有的剂量水平,都与剂量基本正相关;给药后C_max值,也与剂量呈近似正相关增高;各剂量间t_1/2基本相同,与剂量无关,均与线性药代动力学特征一致。15 500,10 125,6750,4500,3000和2000 U·kg^-1组动物大体解剖均未见明显异常,未发现与给药相关的毒性病理改变。结论 在本试验条件下,食蟹猴单次静脉注射TX002近似致死剂量大于20 000 U·kg^-1。
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  T4.21 北冬虫夏草30 d喂养实验研究

  施伟庆;周伟;奚清丽;石根勇;陆罗定

  2013, 27(S1): 131-131.

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  目的 为北冬虫夏草毒性研究和产品开发提供实验依据。方法 4周龄健康SD大鼠96只,雌雄各半。大鼠随机分0.5,1.0,2.0 g·kg^-1 3个剂量组和1个对照组,每组24只。大鼠连续30 d按剂量喂饲含受试物饲料,实验期末禁食16 h,取血检查肝肾功能指标,取肝、肾、脾、睾丸称重并计算脏体比,留取肝、肾、脾、胃、肠、睾丸、卵巢进行组织病理学检查。结果 各组SD大鼠活动、生长正常,体重增加、食物利用率均无异常;剂量组动物体重、脏体比与对照组比较无显著性差异(P>0.05);各剂量组的血液学指标检测值、生化指标检测值均在正常波动范围内。大体解剖均未见明显异常,肝、胃、十二指肠、脾、性腺均未出现组织病理学改变。1.0和2.0 g·kg^-1剂量组大鼠肾近髓质侧部分近曲小管上皮细胞体积增大,细胞核增大、染色变深、形状不规则;雄性大鼠较雌性大鼠形态学改变程度重、范围广。结论 北冬虫夏草1.0和2.0 g·kg^-1剂量组,雄、雌大鼠肾近髓质侧的近曲小管形态有明显改变,但肾脏功能相关生化指标(BUN, CRE)正常,故此变化尚难认定为肾脏毒性作用引起的病理变化,也可能是北冬虫夏草的药理作用导致。
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  T3.84 药物警戒与药物安全性评价

  秦丹;王爱平;靳洪涛;

  2013, 27(S1): 112-112.

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  世界卫生组织关于药物警戒的定义是发现、评估、理解和预防不良反应或其他任何可能与药物相关问题有关的科学和活动。药物警戒的最终目的是帮助制定决策,包括临床上选择准确的治疗方案,药监部门可据以确定是否准可该药品作出管理规划。实践证明,仅停留在药品不良反应监测阶段,是不能完全解决药品的安全性问题,故WHO在2002年推荐各国建立国家级药物警戒中心,其地位与国家药品不良反应监测中心平行。 发展至今,世界上已有多个国家包括尼日利亚、巴西等都先后开展药物警戒工作,而我国尚在起步之中。我国于上世纪80年代初开始ADR监测工作,到2002年底,全国已成立32个ADR监测中心,但尚未设立专门的药物警戒机构。从监管体系上来讲,尽管国内外均采用了中央集权式辅以地区中心的管理体系,但在职能建设方面存在很大的差异;我国上市后药品安全监管体系较为重要的特色是各个地方省局中心的行政职能更加明显。同时,在药物警戒工作中,制药厂商以及医疗机构的地位也是举足轻重的。从药品的开发、生产、直到通过上市后监测发现严重不良事件而主动撤市,制药厂商始终处在独特的地位。而对于我国在这个环节中就显得较为薄弱。目前我国的药物警戒的工作进程中,药物不良反应监测依然是核心工作。而Begaud认为:防止和监测ADR的所有方法不应仅限于针对上市后药品,还应包括上市前的临床试验甚至临床前的研究阶段。药物警戒可以借用流行病学方法,可以在实验室里进行,在使用动物模型去摸清不良反应形成的机制对不良反应定下准确的归因时,正是临床判断之所在。药品的不良反应仅仅从对ADR检测报告进行统计分析并不能解决实际的问题,如何首乌的肝毒性,细辛黄樟醚的致癌性,富含生物碱类中药的致癌性等问题均需要结合实验室的药物安全性评价研究。临床警戒工作与药物安全性评价研究工作各有其特点,但在一定程度上也都具有其局限性,因此,在开展不良反应监测的同时更应高度重视临床警戒与安全性评价研究的密切结合,促使我国的药物警戒工作更加全面的开展,充分发挥药物毒理学工作者的作用。
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  T3.85 运用ELISA间接法评价重组人胰岛素在Beagle犬体内的免疫原性

  赵一璐;周莹

  2013, 27(S1): 112-113.

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  目的 阐述临床前研究中抗重组人胰岛素抗体检测方法的建立与验证并用于评估重组人胰岛素免疫原性的基本策略。方法 建立并验证经典的ELISA间接法来检测抗重组人胰岛素抗体;该方法的原理描述如下:在包被重组人胰岛素的酶标板上,加入阳性对照抗人胰岛素抗体,充分反应并洗涤后加入二抗,最后加入底物显色,终止反应并读取光吸光度值(A)。结果 检测抗重组人胰岛素抗体免疫分析法验证包括:最适抗原包被浓度为2 mgL^-1,最低检测限为6.25 μg·L^-1,稀释线性在抗人胰岛素抗体浓度在3.13~200 μg·L^-1的范围内均呈线性,线性相关系数 >0.99,且CV均<10%。运用该分析方法对30只Beagle犬给药前、给药2周、给药期末及恢复期末采集的血清样本进行原倍、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640倍比稀释后检测,结果表明给药2周、4周和恢复4周低、中、高剂量组动物血清原液及1:40, 1:80, 1:160, 1:320和1:640稀释液A值与同板16份阴性Beagle犬血清平均A值比较,其比值均小于2.1,即检测结果全为阴性。而同时进行检测的阳性对照血清A值与16份阴性Beagle犬血清平均A值比较,其比值远大于2.1,即检测结果均为阳性。结论 在本实验条件下,重组人胰岛素注射液皮下注射4周,无抗重组人胰岛素特异性抗体IgG产生。
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  T20.48 百草枯诱导PC12细胞损害中microRNA的变化及bcl-2调控机制

  黄敏;娄丹;常秀丽;周志俊

  2013, 27(S1): 383-384.

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  目的 探讨百草枯(PQ)诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)细胞毒性中microRNA(miR)的表达变化及bcl-2的调控机制。方法 以PC12细胞为多巴胺能神经元的细胞模型,PQ 62.5 μmol·L^-1分别诱导PC12细胞24 h,用微列阵芯片技术筛选变化显著的miRNA,实时荧光定量逆转录-聚合酶连反应(Real Time PCR)进行验证;根据microRNA数据库(TargetScan 5.1)提供的靶标预测分析结果,搜寻其相关的靶标;用终浓度为PQ 62.5, 125, 250, 500和1000 μmol·L^-1处理细胞24 h,AnnexinⅤ-FITC/PI法流式细胞仪测定细胞凋亡,RT-PCR测定miR-34a, miR-Let-7e的相对表达水平,Western blot测定bcl-2蛋白表达水平。结果 与对照组比较,PQ 125, 250, 500和1000 μmol·L^-1)作用PC12细胞24 h后,细胞存活率显著降低;细胞凋亡率显著上升,且呈现剂量依赖方式(P<0.05);基因芯片技术显示,PQ 62.5 μmol·L^-1作用于PC12细胞24 h引起8个miRNA表达下调,11个miRNA表达上调;其中miR-34a上调、miR-Let-7e下调最为明显(P<0.01);RT-PCR显示,随着PQ浓度的增加,miR-Let-7e表达水平持续下降,miR-34a表达水平持续上升,与芯片结果一致;bcl-2蛋白表达水平随着PQ染毒剂量的增加明显降低,且与miR-34a的表达量呈负相关(P<0.05)。结论 miR的异常表达参与了PQ致PC12细胞损伤过程。PQ可能通过上调miR-34a表达增加bcl-2蛋白表达,进而诱导PC12细胞凋亡。
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  T20.50 呋喃唑酮诱导HeLa细胞凋亡及其分子机制

  邓思君;王丛丛;张朝明;张燊;周延;汤树生;肖希龙

  2013, 27(S1): 384-385.

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  目的 研究呋喃唑酮(FZD)诱导凋亡及其调控机制。方法 以HeLa细胞为模型,呋喃唑酮0,6.25,12.5,25,50 mg·L^-1浓度的作用24 h后,分别用荧光探针DCFH-DA和罗丹明123检测线粒体膜电位、活性氧(ROS)的变化。流式细胞术检测呋喃唑酮引起的HeLa细胞凋亡的变化。Western blot 检测凋亡相关蛋白PARP, Bcl-2,Bax, 以及线粒体通路相关蛋白胱天蛋白酶9, 胱天蛋白酶3和Cyt c的表达变化。NAC 10 mmol与呋喃唑酮50 mg·L^-1共同处理HeLa细胞24 h后,检测细胞线粒体膜电位,ROS,细胞凋亡率以及相关凋亡蛋白表达变化。结果 与空白组相比,呋喃唑酮极显著的升高胞内ROS水平,减低线粒体膜电位。凋亡检测表明,随着药物浓度的升高,细胞凋亡现象越明显。凋亡相关蛋白也发生了相应的变化,呋喃唑酮引起PARP和procaspase-9,3发生剪切而发挥促凋亡作用,同时促凋亡蛋白Bax和Cyt c表达增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少,呈剂量依赖性。NAC对呋喃唑酮的细胞毒性有较好的拮抗作用,与呋喃唑酮单独给药组相比,NAC能阻止呋喃唑酮诱导的线粒体膜电位降低,降低细胞内ROS水平,同时降低呋喃唑酮诱导的细胞凋亡率,凋亡相关蛋白也发生相应变化,Bax,cytC表达减少,Bcl-2表达增加,胱天蛋白酶3,胱天蛋白酶9和PARP前体增加。结论 呋喃唑酮诱导Hela细胞发生了凋亡,可能与细胞内ROS急剧增加有关,而且线粒体通路可能在凋亡中发挥重要作用。
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  T20.53 典型全氟化合物的拟/抗雌激素效应

  黎娟;曹慧明;傅健捷;张爱茜

  2013, 27(S1): 386-386.

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  目的与方法 本文以乳腺癌细胞MCF-7为离体模型,通过MVLN荧光素酶报告基因实验和荧光定量PCR检测等手段,探讨典型全氟化合物的拟/抗雌激素效应及其分子机制。结果与讨论 研究结果表明,在MVLN检测中全氟丁酸和全氟戊酸等短链全氟化合物能够抑制荧光素酶报告基因的表达,表现出抗雌激素效应;而全氟己基磺酸和全氟辛基磺酸等全氟化合物单独暴露时表现出明显的拟雌激素效应。然而,有趣的是基因检测结果表明,无论4~6碳短链全氟化合物还是中长链典型氟化合物均能够抑制雌二醇所诱导的雌激素标志基因pS2和EGR3的表达。定量结构活性相关研究显示全氟化合物的抗雌激素效应与其分子中C-F键所引起的分子大小与体积变化具有良好相关性且全氟化合物所表现出的拟/抗雌激素效应具有统计学意义的碳链相关性。
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  T20.54 氨基酸R410和Y411的变构调控影响全氟辛磺酸结合人血清白蛋白

  曹慧明;孙玉贞;蔺远;冯鸿儒;傅建捷;张爱茜

  2013, 27(S1): 386-387.

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  目的 全氟辛磺酸(PFOS)与人血清白蛋白(HSA)相互作用的机制。方法 基于PFOS高浓度条件下与HSA形成复合物的X射线衍射结构,综合大量荧光淬灭实验结果,利用分子动力学模拟手段,在经典的amber-ff03立场下,模拟了PFOS在HSA的两个性质不同的脂肪酸结合位点的动态结合过程。在此基础上,进一步采用mmpbsa.py模块测试了PFOS在这两个位点的相对结合能力,并将结合自由能分解到有相互作用的关键氨基酸,计算了每个氨基酸对结合能的贡献;同时我们亦考察了PFOS结合对HSA二级结构稳定性的动态影响。结果 分子动力学模拟结果显示,PFOS结合在HSA的脂肪酸结合位点6(FA6)的结合自由能弱于结合在部分脂肪酸结合位点3/4(FA3/4)。结合自由能贡献分解指出R209和K351对PFOS在FA6的结合能力起主要作用,而在FA3/4则为R410。并且PFOS结合在FA6对HAS的二级结构稳定性的影响强于结合在FA3/4。荧光氨基酸TRP214周围微环境的微扰主要是由PFOS结合在FA6引起的。 结论 基于分子动力学模拟了PFOS与HSA的作用过程。动态结合过程分析发现在结合一分子PFOS在位点FA6后,氨基酸R410和Y411通过变构调节,打开门控开关,允许第二分子PFOS结合进入HSA的位点FA3/4。确定在低浓度时的结合位点位于传统定义上的脂肪酸结合位点6。
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  T20.28 淮安食管癌与癌旁组织中差异表达LncRNA的初步分析

  李夏君;杨淼;刘冉;尹立红

  2013, 27(S1): 372-372.

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  目的 初步筛选淮安食管鳞癌与癌旁组织中差异表达的LncRNA,为进一步研究与肿瘤相关的lncRNAs在食管鳞癌发病机制中的作用奠定基础。方法 分别提取3例患者食管癌组织及配对癌旁组织的总RNA,体外逆转录制备并标记为双链cDNA(ds-cDNA),与人类LncRNA表达谱芯片进行杂交,经扫描后,用Agilent GeneSpringGX v11.5.1软件进行分析运算,筛选出差异表达的LncRNA。结果 按照fold change ≥2.0, P<0.05的标准,筛选出表达差异有统计学意义的LncRNA共1019个,其中399个上调, 620个下调。GO分析发现这些LncRNA可能调控的mRNA主要参与了细胞周期、细胞分化、蛋白酶活动等过程。Pathway分析发现蛋白酶通路相关的BF510189和同源重组通路相关的AL122013.1可能与肿瘤的发生、发展关系密切。对筛选出的差异表达LncRNA进行分类和亚型分析,发现差异表达的lincRNA和附近的编码基因对(距离<300 kb)有25对,差异表达的增强子样LncRNA和其附近的编码基因(距离<300 kb)有11对,其中lincRNA-TSPAN8和lincRNA-CCDC33预测与食管癌关系较为密切。与现有食管癌相关LncRNA数据库的比对分析显示,在本次研究中有13个差异表达LncRNA与已有研究报道相同,分别为:AJ006998.2,AC034220.3,AL035610.2,RP11-38M15.6,NCRNA00092,UCA1,CTA-134P22.2,NCRNA00152,RP11-540N6.1,RP11-597D13.8,RP11-47P18.1,RP11-480D4.3和AC007250.4。结论 本次研究共筛选出1019个具有统计学意义的差异表达LncRNA,其中17个候选LncRNA可能成为食管癌早期发现和诊断的生物标志物。
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  T20.29 蛋白磷酸酶2A介导重金属化合物诱导细胞毒性的作用

  陈丽萍;马璐;朱小年;柏青;张劲苗;陈雯

  2013, 27(S1): 373-373.

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  目的 探讨利用蛋白磷酸酶2A(PP2A)亚基缺失细胞模型来筛查影响重金属化诱导细胞毒性的关键靶点以及通路,揭示重金属化合物诱导细胞毒性的机制。方法 构建PP2A亚基表达缺陷的稳定细胞株,用7种重金属化合物包括氯化镉(CdCl₂)、硫酸锌(ZnSO₄)、硫酸铜(CuSO₄)、醋酸铅(PbAc)、硫酸镍(NiSO₄)、亚砷酸钠(NaAsO₂)、重铬酸钾(K₂Cr₂O₇)处理各细胞株,利用蛋白印迹、MTT等实验筛查影响重金属化合物诱导细胞毒性的PP2A亚基,并进一步引入与重金属毒性密切相关的金属硫蛋白MT和热休克蛋白(HSP)作为靶点分子来探讨PP2A参与重金属化合物诱导细胞急性毒性的调控机制。结果 细胞毒性检测结果显示与对照细胞株比,5个PP2A亚基(PR130, PR110, B56β, B56ε, B56δ)的表达缺失导致多种重金属化合物诱导的细胞毒性显著增强。蛋白印迹结果显示这些亚基的表达下调导致多种重金属化合物诱导的MT和HSP表达也显著下降。进一步通过免疫沉淀、激光共聚焦等实验发现包含特异B56亚基的PP2A全酶通过调控转录因子的磷酸化来影响MT和HSPs的表达。结论 本研究鉴定出调控重金属化合物诱导细胞毒性通路的关键靶点和通路,并阐明PP2A介导的去磷酸作用在调控重金属诱导细胞毒性中起着重要作用,特异的PP2A全酶通过影响MT或HSP的表达来调控重金属化合物诱导的细胞毒性。
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  T20.56 ERK1/2信号通路相关蛋白在NaAsO₂诱导L-02肝细胞凋亡中的作用

  罗鹏;张爱华;张开菊;曾小盼;方文豪;叶建方;肖佳艳

  2013, 27(S1): 387-388.

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  目的 探讨不同浓度亚砷酸钠(NaAsO₂)对人正常肝细胞(L-02)生长和凋亡的影响,以及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号通路中相关蛋白在该过程中的作用。方法 采用不同浓度(0, 50, 100和150 μmol·L^-1)NaAsO₂作用L-02肝细胞24 h,建立砷中毒细胞模型;采用ERK1/2特异性抑制剂(PD98059)处理L-02肝细胞30 min,再用不同浓度NaAsO₂作用L-02肝细胞24 h,建立ERK1/2抑制剂干预模型;运用四甲基偶氮唑蓝法检测L-02肝细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫印迹技术检测L-02肝细胞中ERK1/2, p-ERK1/2和BaX, Bcl-2蛋白表达水平的差异。结果 (1)随着NaAsO₂浓度的增加L-02肝细胞的存活率降低、凋亡率升高,差异具有统计学意义(P<0.05);ERK1和ERK2蛋白及磷酸化水平的表达随NaAsO₂浓度的增加而升高,NaAsO₂ 100和150 μmol·L^-1组的表达明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05);BaX蛋白的表达亦随NaAsO₂浓度的增加而升高,NaAsO₂ 150 μmol·L^-1组表达最强,差异具有统计学意义(P<0.05);Bcl-2蛋白的表达随NaAsO₂浓度的增加而降低,NaAsO₂ 150 μmol·L^-1组表达明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05);BaX/Bcl-2比值随剂量的增加而升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)ERK1/2抑制剂PD98059可降低NaAsO₂对L-02肝细胞的生长抑制作用,明显提高细胞存活率和降低凋亡率;ERK1和ERK2蛋白的表达较拮抗前升高但差异无统计学意义;而ERK1和ERK2磷酸化水平的表达较拮抗前下降,其中NaAsO₂ 100 μmol·L^-1组的p-ERK1表达明显减弱,NaAsO₂ 150 μmol·L^-1组的p-ERK2表达明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05);BaX和Bcl-2蛋白的表达较拮抗前明显升高,BaX/Bcl-2比值较拮抗前降低,NaAsO₂ 150μmol·L^-1组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 NaAsO₂致肝损伤的作用机制可能与改变ERK1/2蛋白的表达、增强磷酸化ERK1/2水平,继而改变BaX和Bcl-2等相关蛋白的表达有关。
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  T20.33 二氧化硫对血管张力影响的离子通道分子机制

  张全喜;田晶晶;白云龙;杨振华;孟紫强

  2013, 27(S1): 375-375.

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  目的 研究二氧化硫(SO₂)对血管舒张作用的离子通道分子机制。方法 (1)采用离体大鼠胸主动脉血管环灌流技术,研究不同离子通道在SO₂舒张血管效应中的作用。(2)分别采用体内和体外实验,研究SO₂对血管L型钙离子通道、大电导钙激活的钾离子(BK_Ca)通道和三磷酸腺苷敏感的钾离子(K_ATP)通道不同亚基基因表达的影响。亚基包括L型钙离子通道的Cav1.2和Cav1.3亚基,BK_Ca通道的α和β1亚基,K_ATP通道的Kir6.1, Kir6.2, SUR2A和SUR2B亚基。体内实验使用浓度为0, 3.5, 7.0和14 mg·m^-3的SO₂染毒整体Wistar雄性大鼠30 d,每天4 h,然后采用实时荧光定量PCR法和Western blot法分别检测各组血管中三种离子通道不同亚基mRNA和蛋白表达水平的变化;体外实验分别使用浓度为0, 30, 300和1500 μmol·L^-1的SO₂染毒离体大鼠血管2 h,然后检测不同亚基mRNA和蛋白表达水平的变化。结果 (1)BK_Ca通道阻断剂可部分抑制SO₂ 30和300 μmol·L^-1对内皮完整血管的舒张作用,而L型钙离子通道阻断剂和K_ATP通道阻断剂可部分抑制SO₂ 1500 μmol·L^-1对内皮完整及去内皮血管的舒张作用。(2)SO₂对不同亚基基因表达影响的体内与体外实验结果相似,与对照组相比,SO₂染毒组中BK_Ca通道的α, β1亚基以及K_ATP通道的Kir6.1, Kir6.2, SUR2B亚基mRNA和蛋白表达水平明显增加,而L型钙离子通道的Cav1.2和Cav1.3亚基的表达水平明显降低。结论 SO₂是一种血管活性物质,低浓度SO₂对血管的舒张作用是内皮依赖性的,其作用机制可能与SO₂上调BK_Ca通道的α和β1亚基基因表达水平有关,而高浓度SO₂对血管的舒张作用与内皮无关,其作用机制可能与SO₂下调L型钙离子通道的Cav1.2, Cav1.3亚基和上调K_ATP通道的Kir6.1, Kir6.2, SUR2B亚基基因表达水平有关。
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  T7.8 Mechanism of lead exposure on synapse formation and homeostatic synaptic plasticity

  WANG Hui-li;RUAN Di-yun;HU Fan;GE Meng-meng;TANG Yu-qing;LIU Zhi-hua

  2013, 27(S1): 186-186.

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  Lead (Pb) exposure is well-known to impair synaptic transmission and input-specific synaptic plasticity (LTP, LTD) in developing hippocampus. But whether lead affects the synapse formation and homeostatic synaptic plasticity remains elucidated. Our recent work showed lead exposure during synaptogenesis alters Wnt signals expression and thus affects the dendritic spine formation and synapse strength. To investigate the alteration of spine formation, Golgi-Cox staining method was used to analyze the spine density of pyramidal neurons in hippocampus (CA1) of P14 and P21 rats, which received Pb²⁺ from milk of dams. The results showed that Pb²⁺ obviously down-regulated the spine density in these two critical time points. The western blot results showed that there was also a significant age-related decline of the Wnt7a expression and its downstream protein stability after chronically lead exposure. In the cultured hippocampal neurons, Pb²⁺ significantly decreased the spine density in a dose-dependent manner. After exogenous Wnt7a application, the frequency of miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) in the Pb²⁺-treated group was rescued. Additionally, Pb²⁺-induced decrease of spine density was attenuated by Wnt7a, accompanying with the increasing of molecular stability in the Wnt pathway. Our results suggest that Pb²⁺ induced deficit in spine growth and synaptic transmission of developing hippocampus involving presynaptic Wnt7a signaling alteration.
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  T7.9 脑脉络丛中锰毒性蛋白的鉴定验证及锰致细胞周期阻滞的调控机制

  李国君;敬海明;董一文;魏开华;杨帆;刘君丽;刘羽;马玲;赵超英;刘建中;郑珊;高文晖;谭壮生;李煜;李明;焦智浩

  2013, 27(S1): 187-187.

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  目的 动物整体水平和体外细胞水平,应用差异蛋白组学技术,筛查鉴定及验证脉络丛(CP)中锰毒性差异表达的关键蛋白,并在细胞水平进一步揭示抑制素蛋白(PHB1)在锰所致CP上皮细胞周期阻滞效应中的调控作用机制。通过本研究将从脉络丛这个新视点为锰神经毒性作用的分子机制理论增加新的认识,为锰中毒的早期防治提供新的思路。方法 (1)锰中毒大鼠模型的建立 雄性SD大鼠随机分为6个实验组,30 d染毒组与对照组,90 d染毒组与对照组,90 d染毒+30 d恢复期与对照组。染毒组腹腔注射MnCl₂,6 mg·kg^-1·d^-1,对照组予以生理盐水。(2)透射电镜等验证模型中锰对CP的病理损伤。(3)差异蛋白组学方法检测2D-PAGE结合Nano-LC-MS/MS鉴定CP中锰毒性差异谱。(4)Western blot及Real time RT PCR验证锰差异蛋白。 (5) siRNA及转染技术建立PHB1敲低型细胞系。(6)流式细胞术测定细胞周期。结果与结论 (1)以2-DE结合nanoLC-IT-MS的方法在CP中鉴定到了32个锰毒性病程相关的差异蛋白质,其中有27个上调蛋白,5个下调蛋白。GO分类分析后发现差异表达蛋白主要分布在线粒体、膜表面以及细胞质内,以结合、催化活性以及转运功能为主,参与代谢与转运等生物学过程。(2)对6个差异蛋白进行体内外实验验证,证实了通过差异蛋白组学技术获得的大鼠脑脉络丛组织中锰毒性差异表达蛋白PHB1, β肌动蛋白, STIP1和TTR的变化趋势结果是可靠准确的。(3)锰作用于大鼠永生化的脉络丛上皮细胞Z310可引起PHB1时间依赖性和剂量依赖性的上调。(4)锰引起野生型Z310细胞以及空载体转染对照细胞在G₁/S期的阻滞,但不引起PHB1敲低Z310细胞的周期阻滞,说明PHB1在锰致Z310细胞周期阻滞效应中具有调控作用。
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  T7.10 苯并(a)芘与神经退行性变关系

  聂继盛

  2013, 27(S1): 187-188.

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  目的 研究苯并(a)芘与神经退行性变的关系。方法 通过职业人群调查、动物实验和体外神经细胞培养不同层次研究苯并(a)芘与神经退行性变的关系。结果 职业人群调查发现,苯并(a)芘可引起焦炉作业工人学习记忆能力降低,其变化水平与作业工龄和内暴露尿1-羟基芘的浓度呈负相关。动物实验显示,大鼠腹腔注射染毒苯并(a)芘1到3个月后,脑中苯并(a)芘的生物标志BPDE-DNA加合物的水平随染毒时间延长和染毒剂量的增加而增多,苯并(a)芘在6.25和2.5 mg·kg^-1剂量水平都可引起学习记忆能力降低,并且具有剂量和时间反应关系;进而对神经退行性变的特征之一神经细胞凋亡进行TUNEL和电镜检测,发现大鼠海马和皮质的神经细胞凋亡率与苯并(a)芘的染毒剂量和染毒时间存在剂量和时间反应关系,同时发现神经退行性变标志分子磷酸化Tau蛋白与苯并(a)芘的染毒剂量和染毒时间也存在剂量和时间反应关系。体外神经元培养发现,BPDE-DNA加合物的水平随染毒时间延长和染毒剂量的增加而增多,苯并(a)芘可引起DNA断裂和神经元凋亡。结论 苯并(a)芘可引起神经退行性变。
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  T7.11 有丝分裂平面取向作为农药神经发育毒性新型标志物的研究

  陈伟峰;陈晓萍

  2013, 27(S1): 188-188.

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  目的 探讨神经发育毒性胚胎早期评价的新型细胞标志物,为农药毒性早期预警提供新的方法。方法 将ICR小鼠按雌雄1:1比例合笼,阴栓检出法确定准确的胚胎时间。在胚胎7.5~11.5 d,给妊娠母鼠皮下注射毒死蜱2 mg·kg^-1·d^-1、二嗪农2 mg·kg^-1·d^-1或乙酰甲胺磷50 mg·kg^-1·d^-1。收集第16天胚胎,经多聚甲醛固定、石蜡包埋,以冠状位将胚胎脑切为4μm连续薄片,HE染色。在显微镜下观察侧脑室VZ区室腔面表层细胞,计数其中处于有丝分裂相的细胞,按有丝分裂平面与室腔面的角度分为垂直(60~90°)、倾斜(30~60°)、水平(0~30°)三种取向。结果 在胚胎第16天,神经前体细胞中分裂细胞占总细胞数的32%左右,3种有机磷农药处理对分裂细胞的比例无明显影响,对细胞的基本形态也无明显影响。但有机磷农药的处理影响了分裂细胞的有丝分裂平面取向,其中,毒死蜱使垂直分裂的细胞减少了8.64%,倾斜分裂的细胞增加了42.76%,水平分裂的细胞增加了2.58%;二嗪农使垂直分裂的细胞减少了6.84%,倾斜分裂的细胞增加了21.41%,水平分裂的细胞增加了47.33%;而乙酰甲胺磷对有丝分裂平面取向无明显影响。即有机磷农药毒死蜱与二嗪农使神经前体细胞的有丝分裂平面取向发生了由垂直向水平方向的偏转。结论 侧脑室顶端神经前体细胞的有丝分裂平面取向,有可能作为农药神经发育毒性评价的一种新型标志物。
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  T7.14 对氨基水杨酸钠对锰中毒大鼠学习记忆和海马神经发生的影响

  蒙浩洋;唐方萍;黄艳妮;李少军;罗海兰;区仕燕;邓祥发;姜岳明

  2013, 27(S1): 189-190.

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  目的 观察对氨基水杨酸钠(PAS-Na)对锰中毒大鼠学习记忆能力和海马神经发生水平的影响。方法 40只健康成年雄性SD大鼠被随机分为对照组和染锰组。染锰组、每日腹腔注射(ip)MnCl₂·4H₂O 15 mg·kg^-1,对照组ip等容量生理盐水,每周5 d,连续6周。然后,将染锰组分为染锰组、低、中、高PAS-Na(L, M和H-PAS)治疗组,L, M和H-PAS治疗组每日分别背部皮下注射(sc)PSA-Na 100, 200或300 mg·kg^-1,对照组、染锰组背部sc等容量生理盐水,每周用药4 d,停药3 d,连续4周。采用Morris水迷宫系统检测大鼠学习记忆能力,免疫组化检测5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的神经发生细胞数量。结果 染锰组逃避潜伏期、游泳路程均比对照组长,平台穿越次数比对照组少(P<0.01)。各PAS-Na治疗组逃避潜伏期、游泳路程均较染锰组短,M-和H-PAS治疗组平台穿越次数比染锰组多(P<0.05)。染锰组海马BrdU阳性细胞数目低于对照组,M-和H-PAS治疗组海马BrdU阳性细胞数目高于染锰组(P<0.01)。结论 锰暴露能减弱成年大鼠学习记忆能力,降低海马神经发生水平。PAS-Na可以改善锰中毒大鼠的学习记忆能力,促进其海马神经发生。
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  T7.15 发育关键期双酚A暴露对大鼠海马神经元突触形成的影响及可能机制

  刘志华;阳烨;阮迪云;汪惠丽

  2013, 27(S1): 190-190.

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  目的 探讨双酚A(BPA)对发育关键期海马神经元突触形成的影响,并探讨Wnt 经典信号通路在其中的贡献。方法 本研究以发育关键期的SD大鼠和离体培养的海马神经元为研究对象,采用golgi-cox染色及慢病毒转染方法研究BPA对神经发育形态学方面的影响,Western blot方法研究Wnt信号通路相关蛋白的表达变化。并结合行为学方法,阐明神经元结构变化与行为功能的相关性。结果 在体及离体实验结果均显示,BPA暴露会引起树突棘数目显著降低;Wnt经典信号通路的核心分子β-catenin的磷酸化水平升高,提示β-catenin降解增多;Wnt信号通路上游分子Wnt7a表达水平明显降低,体外实验加入Wnt7a细胞因子,发现Wnt7a对BPA导致的树突棘下降等损伤有一定的修复作用。结论 BPA可使处于发育关键期的SD大鼠树突棘减少,这在一定程度上损害了突触形成,并可能影响其以后的学习记忆能力;BPA暴露后Wnt经典信号通路中β-catenin磷酸化水平升高及Wnt7a表达水平下降,提示Wnt 信号通路可能参与了BPA导致的树突棘下降这一过程。
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  T7.16 NMDA受体神经毒性与阿尔茨海默病

  刘靓靓;张丹参;王倩;田慧;沈丽霞

  2013, 27(S1): 190-191.

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  兴奋性氨基酸(EAA)是广泛存在于哺乳类动物中枢神经系统的正常兴奋性神经递质,参与突触兴奋传递,学习记忆形成。兴奋性氨基酸包括谷氨酸(Glu)和天门冬氨酸。兴奋性谷氨酸受体分为:离子型谷氨酸受体、代谢型谷氨酸受体,前者按其药理学和电生理学特性的不同又分为N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体、红藻氨酸盐受体三种亚型。NMDA受体是离子型谷氨酸受体的一种,为配体门控性离子通道,不仅对Na⁺和K⁺通透,对Ca²⁺离子有更高的通透性。兴奋性毒性细胞死亡发生在一些病理性疾病状态,包括中风、老年痴呆症、亨廷顿氏病和与艾滋病相关的痴呆,当脑出血、脑外伤或其它理化因素导致脑神经细胞外液谷氨酸或天门冬氨酸等兴奋性氨基酸剧增时,过度刺激神经元上的相应受体引起神经兴奋性毒性。研究表明,阿尔茨海默病(AD)可能导致EAA代谢紊乱,产生毒性作用。兴奋性毒性神经元变性有急慢两种形式。Glu与突触后非NMDA受体结合,Na⁺通道开放,大量的Na⁺向细胞内移动, 可以在1~2 h内出现急性细胞肿胀,甚至溶解,造成立即性神经元死亡此为急性兴奋性毒性神经元变性。线粒体功能不全是慢性兴奋性Glu神经毒性的主要步骤,当神经元细胞内能量代谢水平下降,细胞膜持续地部分去极化,导致NMDA等离子通道受损,NMDA介导的谷氨酸神经毒性显著增强,引起缓慢持续的Ca²⁺和Na⁺内流,细胞内Ca²⁺水平增高,而增高的Ca²⁺水平又刺激谷氨酸的释放,进一步激活NMDA受体,细胞内Ca²⁺水平持续升高,细胞内钙稳态破坏。长期、慢性兴奋性毒性将导致海马和大脑皮层的神经元突出缺失和神经元细胞凋亡。突触外NMDA受体引起氧应激、细胞凋亡信号转导途径,突触NMDA体受体则能抗氧应激和抑制凋亡蛋白发挥神经保护作用。流行病学研究表明通过对AD患者和健康对照者血清中EAA含量的测定比较得出,AD组血清中EAA含量明显高于健康组。大量Glu过度刺激突触外NMDA受体引起神经兴奋性毒性作用。突触外NMDA受体激活时持续大量的钙内流,导致细胞内钙超载,诱导突触长时程抑制,损伤线粒体同时激活细胞凋亡和氧应激信号的转导途径,最终引起细胞死亡。此外,由于线粒体功能不全NMDA受体受损导致细胞内钙稳态的破坏,使淀粉样蛋白前体的加工、tau蛋白的去磷酸化和降解、神经递质的释放和记忆的形成等一系列依赖于钙的生化过程出现异常,这些都将加快AD的发生和发展。
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  T7.17 氯化锰对PC12细胞组蛋白乙酰化酶/去乙酰化酶活性的影响

  郭振坤;吴思英;袁朱桐;李煌元

  2013, 27(S1): 191-191.

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  目的 探讨氯化锰(MnCl₂)处理PC12细胞不同时间后细胞核内组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性的变化。方法 体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞,用终浓度分别为0, 100和300 μmol·L^-1 MnCl₂分别对其处理0, 3, 6和12 h(两因素析因设计),用"NE-PER"试剂盒提取细胞核蛋白,用HDAC Colorimetric Assay Kit和HAT Colorimetric Assay Kit分别检测HDAC和HAT的活性酶标仪检测其吸光度。结果 析因设计实验统计结果表明,MnCl₂浓度(①)和处理时间(②)两因素在HDAC和HAT活性改变中具有统计学意义(P<0.05)。(1) HDACs活性:① MnCl₂处理3 h: 与其他组比较,MnCl₂ 300 μmol·L^-1处理组HDAC活性均升高,差异具有统计学意义(P<0.01);MnCl₂处理6 h: 与对照组比较,MnCl2 100和 300 μmol·L^-1 处理组HDAC活性均升高,具有统计学意义(P<0.01);MnCl₂处理12 h: 与对照组比较,MnCl₂ 100和300 μmol·L^-1处理组HDAC活性升高,与MnCl₂ 100 μmol·L^-1处理组比较,MnCl₂ 300 μmol·L^-1处理组HDAC活性升高,具有剂量效应关系,差异具有统计学意义(P<0.01)。② MnCl₂ 100 μmol·L^-1处理: 与对照组、3 h组比较,6 h组和12 h组HDAC活性均升高,差异具有统计学意义(P<0.01);MnCl₂ 300 μmol·L^-1处理: 与对照组比较, 3, 6和12 h组HDAC活性均升高;与6 h组比较, 12 h组HDAC活性升高,但与3 h组比较,6 h组HDAC活性降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。(2)HATs活性:① MnCl₂处理6 h: 与对照组、MnCl₂ 100 μmol·L^-1处理组比较,MnCl₂ 300 μmol·L^-1处理组HAT活性降低,差异具有统计学意义(P<0.01);MnCl₂处理12 h: 与对照组、MnCl₂ 100 μmol·L^-1处理组比较,MnCl₂ 300 μmol·L^-1处理组HAT活性降低,具有统计学意义(P<0.01)。② MnCl₂ 100 μmol·L^-1处理: 与对照组比较,6 h组HAT活性升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与6 h组比较, 12 h组HAT活性降低,差异具有统计学意义(P<0.05); 与对照组及3和6 h组比较,MnCl₂ 300 μmol·L^-1处理12 h组HAT活性降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 氯化锰可诱导神经细胞HDAC活性升高和HAT活性降低,组蛋白乙酰化调控酶活性的影响可能是锰神经表观遗传毒性的机制之一。
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  T7.18 α-分泌酶在铝引起大鼠脑内Aβ蓄积中的作用

  王林平;牛侨

  2013, 27(S1): 192-192.

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  目的 探讨α-分泌酶在铝引起脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)蓄积中的作用。方法 健康雄性SD大鼠32只,按体重随机分为4组,对照组(生理盐水组),低剂量组(0.4 mg·kg^-1),中剂量组(0.8 mg·kg^-1)和高剂量(1.2 mg·kg^-1)组,每组8只。染毒结束后,采用ELISA检测大鼠皮质和海马Aβ的量。用Western-blot检测大鼠脑皮质和海马中α-分泌酶各亚型(ADAM9, ADAM10及ADAM17)的表达情况。结果 在皮质和海马内,与对照组比较,各染毒组Aβ₄₀无明显变化;在皮质内,高剂量染铝组Aβ₄₂为(51±21)ng·L^-1,在海马内,低、中、高剂量染铝组Aβ₄₂分别为(25±5), (43±12), (54±8)ng·L^-1,明显高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,各染毒组大鼠脑皮质ADAM9表达量差异无统计学意义(P>0.05),在海马内中、高剂量组ADAM9表达量显著降低(P<0.05);在皮质和海马内,ADAM10表达量在低、中、高剂量组均显著降低(P<0.05),ADAM17表达量在脑皮质和海马内中、高剂量组显著降低(P<0.05)。结论 铝可以引起大鼠脑皮质和海马Aβ水平升高,α-分泌酶水平的降低是铝引起大鼠脑内Aβ蓄积的重要原因之一。
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  T7.39 Involvement of Kv1.3 in methamphetamine induced microglia damage

  WANG JunWANG JunQIAN Wen-yiZHAO Jing-jingLIU Jing-liJIANG LeiZHOU JingGAO RongXIAO Hang

  2013, 27(S1): 203-203.

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  OBJECTIVE Methamphetamine (Meth) abusing represents a major public health problem worldwide. Meth has long been known to induce neurotoxicity. However, the mechanism is still unclear. The aim of the present study was to identify the specific targets mediated by Meth in microglia. Growing evidences indicated that the voltage-gated potassium channels (Kv) were participated in neuronal damage and microglia functionality. Therefore, in present study, we explored the effects of Kv1.3 in microglia damage mediated by Meth. METHODS Microglial cell from 18-day-old embryonic rats were divided into 4 groups treat with methamphetamine(0, 100, 300, 1000 μmol·L^-1). CCK8 assay was applied to indicate cell viability. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) was employed to detect apoptotic cells. Immunohistochemistry was used to identify Microglial cell. Real-time PCR was applied to observe the expressions of IL-6 and iNOS. Western blot assay were performed to determine the expressions of Kv1.3 and Kv1.5 in Microglial cell. RESULTS Our study showed that Meth substantially decreased the cell viability in a dose dependent manner, while the Kv blocker, TEA, 4-AP and Kv1.3 specific antagonist margatoxin (MgTx), preventing against the damage mediated by Meth. Accordingly, the association between cell damage and Kv1.3 expression was discussed and the results revealed that treatment of microglia with Meth increased Kv1.3 mRNA expression. In parallel, western-blot study indicated an up-regulation of Kv1.3 protein, which was partly blocked by MgTx. However, Kv1.5, another K⁺ channel in microglia, was not obviously affected by Meth treatment. Meth also stimulated a significant increment of IL-6 mRNA expression, and this process can be partly blocked by MgTx. CONCLUSION These results together not only revealed the effects of Kv1.3 in Meth induced microglia damage, but also suggested a potential target for the development of therapeutic strategies for Meth abuse.
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  T7.40 Lead-induced Iron overload and attenuated effects of ferroportin 1 overexpression in PC12 cells and cultured rat hippocampal neurons

  ZHOU Fan-kun;FAN Guang-qin;CHEN Ying;DUA Gui-hua;FENG Chang;ZHU Gao-chun

  2013, 27(S1): 203-204.

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  Lead (Pb) exposure and iron (Fe) metabolism disorders can both cause cognitive deficits. Our previous in vivo experiments suggested that Pb exposure increases the Fe content in the rats' brain, which may be associated with the decreased ferroportin1 (FP1) expression. In the current study, we further investigated the effect of Pb exposure on iron homeostasis in the PC12 cell line and cultured rat hippocampal neurons and whether FP1 overexpression could attenuate Lead-induced iron metabolism disorders. The gradient concentrations of Pb (0, 0.01, 0.1, 1, 10 or 100 μmol·L^-1) were added to PC12 cells for 24, 48 and 72 h as well as primary cultured rat hippocampal neurons for 24 h. Perl's staining and confocal laser scanning microscope were used to detect cellular iron level. PCR and Western blot were applied to analyze the expression level of gene and protein, respectively. Perl's staining indicated that iron increased in a concentration-dependant manner when exposed to Pb 10-100 μmol·L^-1 for 24 h in PC12 cells, and increased in a concentration-dependant manner when exposed to Pb 0.1-100 μmol·L^-1 in primary cultured rat hippocampal neurons and 48, 72 h in PC12. Western blot analyses indicated that FP1 protein levels were down-regulated in a concentration-dependant manner when exposed to Pb 10-100 μmol·L^-1 for 24 h while Pb 0.1-100 μmol·L^-1 for 48 and 72 h in PC12 cells. FP1 mRNA was significantly decreased only when exposure to Pb 10-100 μmol·L^-1 for 72 h as measured using PCR analyses. Then, we transfected FP1-pEGFP-N1 plasmid and pEGFP-N1 vector into PC12 cells using Lipofectamine LTX reagent before being exposed to Pb²⁺ 10 μmol·L^-1 for 24 h. Both perl's staining and fluorescence signals detected by confocal laser scanning microscope showed that overexpression of FP1 decreased cellular iron level. These results suggest that Pb exposure could induce iron overload, and FP1 might directly contribute to iron efflux from neurons in conditions of overexpression that prevent cellular iron accumulation and subsequently protect cells from iron-induced neurotoxicology consequences induced by Pb exposure.
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  T15.2 有机磷、氨基甲酸酯及拟除虫菊酯类农药联合染毒对大鼠肝氧化损伤作用的影响

  许明圆;王会平;梁宇杰;朱丽;伍一军

  2013, 27(S1): 284-284.

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  目的 研究有机磷农药、拟除虫菊酯农药和氨基甲酸酯类农药在单独及混合染毒后对大鼠肝组织氧化损伤作用的影响。方法 以成年Wistar大鼠为实验动物,以有机磷农药敌敌畏、拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯和氯菊酯、以及氨基甲酸酯类农药残杀威共4个农药,分别两两联合,分别以低、中、高3种剂量(分别是0.64, 1.60, 4.00 mg·kg^-1·d^-1;1.02, 2.56, 6.40 mg·kg^-1·d^-1;0.68, 1.70, 4.25 mg·kg^-1·d^-1;和 12, 30, 75 mg·kg^-1·d^-1),进行单独和联合染毒90 d,通过分光光度分析等生化检测方法测定大鼠肝组织中SOD, CAT, MDA和PCO等酶的活性,以了解这4种化学农药在单独和联合作用下对大鼠肝组织氧化损伤作用的影响。结果 这4种农药无论是单独还是联合染毒大鼠都会表现出明显的脂质过氧化损伤,脂质可能是这4种农药的敏感靶标;敌敌畏和溴氰菊酯对大鼠肝组织氧化损伤的影响主要表现出一种潜在的拮抗作用, 而且溴氰菊酯的对肝的毒性作用要强于敌敌畏;残杀威和氯菊酯也同样的表现出一种拮抗作用。结论 敌敌畏和溴氰菊酯以及残杀威和氯菊酯对大鼠肝组织氧化损伤的影响主要为拮抗作用,而且脂质是这4种农药的敏感靶标。
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  T15.3 苯暴露小鼠骨髓,血浆和尿液的代谢组学研究

  孙蓉丽;韦海燕;谈柯宏;尹立红;张娟;浦跃朴

  2013, 27(S1): 284-285.

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  目的 苯是一种普遍存在的环境污染物,长期接触苯主要引起血液毒性,导致白细胞减少、骨髓抑制,甚至再生障碍性贫血及白血病。苯的血液毒性机制,涉及代谢活化、氧化损伤、染色体与基因突变、表遗传改变等,但迄今尚未完全阐明。代谢组学是研究生物体内小分子代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式。用代谢组学方法揭示的生物化学变化可以与传统手段的测定结果相联系,更容易发现毒物毒性作用的生物化学物质基础、作用机制及与疾病进展相关的效应标志物。方法 C3H/He雄性小鼠36只,随机分为3组,每组12只,染毒剂量为:对照组(0),苯1组(300 mg·kg^-1),苯2组(600 mg·kg^-1),连续7 d皮下注射染毒。染毒期间,隔天称重,记录小鼠体重。染毒结束,收集小鼠尿液,测定小鼠血常规,断颈处死小鼠,收集血浆及四肢骨全骨髓细胞,于-80度保存。应用高效液相色谱-飞行时间质谱联用系统(HPLC-Q-TOF/MS),对小鼠代谢样本进行代谢图谱分析。应用Mass Hunter提取色谱峰信息,MPP(Mass Profiler Professional)软件筛选处理数据,数据模式识别方法采用主成分分析法,分析小鼠骨髓细胞、尿液及血浆的代谢组学特征及生物标志物。结果 染毒7 d后,与对照组相比,苯暴露组小鼠体重无统计学差异;苯暴露组小鼠红细胞计数和血红蛋白降低(P<0.05)。与对照组相比,苯暴露小鼠骨髓细胞中对羟基苯丙烯酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量显著升高,赖氨酸和乙酰肉毒碱含量降低(P<0.05);血浆中组氨酸和吡咯烷酮羧酸含量升高,5-羟(基)吲哚乙酸、组胺、甲基组胺、软脂酰肉毒碱和乙酰肉毒碱含量降低(P<0.05);尿液中吡咯烷酮羧酸含量上升,组胺、甲基组胺、亚精胺和吲哚乳酸含量降低(P<0.05)。结论 苯对小鼠骨髓的脂肪酸代谢、色氨酸代谢、苯丙氨酸及酪氨酸代谢产生影响;在血浆和尿液中分别鉴定出7种和5种可能的生物标志物。此外在血浆及尿液中追踪在骨髓细胞中发生具有统计学差异改变的代谢物,发现在骨髓细胞中降低的乙酰肉毒碱在血浆中含量也降低,表明乙酰肉毒碱可能是能反映苯造血毒性的潜在的效应标志物。
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  T7.41 急性深部脑刺激外侧缰核抑制线索诱导的海洛因觅药行为

  杨澍均;朱华强;刘惠芬;顾钧;周文华;张富强;

  2013, 27(S1): 204-204.

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  目的 探究深部脑电刺激外侧缰核对海洛因自身给药和线索诱导的觅药行为的影响。方法 32只成年的SD雄性大鼠,清洁级,经颈静脉插管及外侧缰核立体脑定位后采用FR1训练程序,每天4 h,进行海洛因(0.05 mg/kg/infusion)自身给药训练,连续14 d。自身给药训练期间观察不同刺激对海洛因自身给药行为的影响,采用训练前15 min分别进行高频刺激(100 Hz,0.5 ms,0.2 mA)、低频刺激(10 Hz,0.5 ms,0.2 Ma)和复合刺激(10和100 Hz交替,0.2 mA)。接着动物进入14 d的行为消退,每天2 h,分成四组(高频组,低频组,复合刺激组和假手术组,n=8),消退前15 min进行三种不同的深部脑电刺激,消退训练结束后第2天进行慢性深部脑电刺激条件线索诱导的觅药行为恢复测试,测试前不刺激。测试结束后继续进行5 d的觅药行为消退,消退前不刺激。紧接着进行急性深部脑电刺激的条件线索诱导的觅药行为恢复测试,测试前15 min进行三种不同方式的深部脑电刺激。结果 与刺激前数据相比,高频和复合高低频交替刺激均显著性的增加海洛因自身给药中的有效注射针数(分别为P=0.02,P=0.025),低频刺激对此没有影响。慢性复合刺激能显著性的促进海洛因觅药行为恢复(P=0.045),慢性低频和高频刺激对此没有影响 (P>0.05)。急性深部脑电刺激的复合刺激组与假手术组(P=0.016)、低频组(P=0.04)和高频组(P=0.02)相比,能够显著性的抑制线索诱导的海洛因觅药行为恢复。结论 急性刺激外侧缰核可以抑制线索诱导的海洛因觅药行为,提示外侧缰核可能作为海洛因依赖治疗的潜在靶点。
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  T7.42 Environment sources of neurological and neurobehavioral alterations：From diet and chemical exposure to epigenetic modification

  Wei ZHENG;Terry DAVIDSON

  2013, 27(S1): 205-205.

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  There are currently more than 2.5 million and 4.2 million Americans suffering from Parkinson's and Alzheimer's diseases, respectively. In addition, according to the US Center for Disease Control and Prevention, more than 6 of 10 US citizens over the age of 20 and 3 of 10 children ages 2-19 are currently overweight or obese based on body weight index, for which a clear relationship to neurobehavioral alterations has been gradually established. Understandably, far beyond genetic origins, the contributions of environmental exposure, occupational experience, and/or life style to these neurological diseases and disorders have gained increasing attention. This symposium invites world-class scholars in their own research fields to offer the state-of-the-art review of the most recent developments on the related timely topics. The symposium will begin with an overview on the environmental, occupational and life style contributions to numerous neurological diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, essential tremor and perinatal/childhood developmental disorders by Professor Wei Zheng (Purdue University). Professor Terry Davidson (American University) will then discuss the latest discovery on the association between high-energy-diet consumption and hippocampal malfunction that ensues with the neurobehavioral alterations. Professor Michael Aschner (Albert Einstein College of Medicine) will further display the new evidences at the cellular level that support a dopaminergic damage in manganese-induced Parkinsonian injury from a C elegans model. Finally, Professor Robert Wright (New York Mount Sinai School of Medicine) will address the genetic susceptibility, particularly at epigenetic regulatory level, to lead toxicity based on pediatric birth cohorts. The examples on wide spectra of exposure agents and very diverse approaches presented in this symposium will challenge the existing notions and theories, enabling the audience to become acquainted with the latest scientific breakthroughs in related, fast-paced research areas. The information provided in this session should be of interest to risk assessors, toxicologists, neurobiologists, neurotoxicologists, as well as others in brain research and environmental epidemiology.
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  T8.1 浅谈供试品管理及关注问题

  苏来;陈晓艳;陈建;钱小珺

  2013, 27(S1): 205-206.

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  供试品管理目的是为了规范试验机构供试品管理流程,明确供试品生命周期过程的要求,有效控制供试品总量和保存条件。GLP作为一种重要的管理规范已经得到包括美国、欧盟等众多国家的认可和实施,供试品管理是GLP管理规范中关键环节之一。如何科学合理的管理供试品是保证安全评价结果可靠性的关键因素。在供试品管理过程中往往会有很多问题出现,本文将根据作者自身经验浅谈供试品管理及需要关注的一些问题。供试品接收前准备 供试品在到达试验机构前,供试品室应向委托方提供供试品接收单及送样须知,同时向委托方索取供试品的质检报告(COA)、MSDS及稳定性等相关资料。供试品室应关注供试品邮寄动态进行实时跟踪,做好供试品接收准备工作。供试品接收 供试品到达试验机构后,核对无误后,登记入库根据供试品接收单保存条件,选择存放区。接收供试品时要关注供试品接收时的温度条件、物理状态、接收量,详细描述供试品接收时的状态。若供试品出现异常情况,如容器破裂、保存温度条件偏离、相关文件丢失等,供试品室需及时与委托方联系,寻求解决建议。供试品保存及留样 存放供试品的设施内部应有满足不同保存条件的场所。供试品存放设施应配备具有报警功能的24小时不间断监测设备记录温度情况。应关注监测设备记录温度采集间隔时间和报警温度范围设置的合理性,应有验证报告支持。在保存温度出现异常时应有应急措施。供试品留样量按实际情况留取,要满足验证分析。留样时要关注留样供试品污染的可能性,建议在供试品接收时留取,对于不留样供试品应写明原因。此外,同批次多容器供试品要逐一进行留样。供试品分发 供试品分发过程中要避免交叉污染,称量室只允许有一个待发放供试品,建议分发的容器及称量勺采用一次性。发放时应当关注供试品的可追溯性,注意核对分发前重量与上一次剩余重量是否在允许误差内,以及供试品理论剩余重量与实际剩余重量偏差是否在接受范围内。同批次多容器的供试品要详细记录每个容器使用情况。供试品配制与分析 供试品配制时,为避免交叉污染,配制区域只允许存放一个待配制供试品,配制容器建议选用一次性容器。配制供试品时应关注供试品的特性或状态,根据状态特性选择相应的操作平台配制供试品。配制原则从低浓度到高浓度。也可先配制出最高浓度,然后稀释成需要的浓度。供试品的均一性、稳定性测定可以在试验开始之前进行,也可试验开始后进行,为避免试验风险建议在试验开展之前进行,在获得供试品均一性和稳定性数据后再开展试验。 供试品或配制后供试品的返还 原则返还供试品不得用于其它试验,返还的供试品不允许放在原容器内,从供试品室领取的配制后供试品,还应返还至供试品室,返还的供试品按废弃物处理。返还时要关注同一课题多次返还的情况。剩余供试品处理 剩余供试品包括供试品室内未分发的供试品和分发使用后剩余的供试品, 根据委托方要求,返还委托方或机构按环保要求处理。供试品管理人员防护 供试品管理过程中接触供试品的人员应根据MSDS中描述的防护要求进行防护。当接触没有安全性数据的供试品时,接触人员应按照试验机构最高防护要求进行防护。
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  T8.2 茚虫威对大鼠的亚慢性毒性作用

  陈坚峰;张丽娜;胡楚源;胡雄飞

  2013, 27(S1): 206-206.

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  目的 探讨茚虫威对大鼠的亚慢性毒性,初步确定毒作用靶器官。方法 96只健康SPF级SD大鼠随机分为4组,分别为对照(玉米油)组和低(雌性、雄性分别为0.92和1.04 mg·kg^-1),中(雌性、雄性分别为3.68和4.18 mg·kg^-1),高(雌性、雄性分别为14.7和16.7 mg·kg^-1)剂量茚虫威染毒组,每组24只,雌雄各半。采用经口灌胃方式进行染毒,染毒容量为2 ml·kg^-1,每天1次,连续染毒90 d。测定大鼠血常规、尿常规、血清生化指标及各主要脏器系数。结果 染毒后第3~6周,高剂量茚虫威染毒组雌性大鼠和部分雄性大鼠(8/12)相继出现毛发蓬松、无光泽,腹部被毛脱落、活动减少等症状。与对照组比较,高剂量茚虫威染毒组大鼠红细胞计数、红细胞比积、血红蛋白含量均降低(P<0.01);雌性大鼠血清丙氨酸氨基转移酶活力增高(P<0.05);大部分雄性(5/6)大鼠尿胆原阳性。高剂量茚虫威染毒组雌性大鼠及中、高剂量茚虫威染毒组雄性大鼠肝系数和脾系数均增高(P<0.05)。大体解剖发现,高剂量茚虫威染毒组大鼠脾明显肿大,质地较硬,颜色较深。病理组织学检查显示,高剂量茚虫威染毒组全部大鼠和中剂量茚虫威染毒组2只雌性大鼠脾红髓髓窦高度扩张,其内充满大量红细胞,髓质内大量棕黄色含铁血黄素沉积。结论 脾是茚虫威毒作用的主要靶器官,在本实验条件下,雌、雄大鼠分别连续摄入14.7、16.7 mg·kg^-1以上茚虫威90d可导致严重的脾损伤。
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  T8.3 内分泌干扰物测试方法制订与最新动态

  蔡磊明

  2013, 27(S1): 207-207.

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  经济合作与发展组织(OECD)化学品测试方法是OECD试验准则国家协调员工作组负责组织、由各成员国、相关企业以及独立实验室相互认同,用于测试各类化学品如农药、医药和化学品、兽药、食物添加剂安全性的一系列试验方法。方法具体包括化学品的物理化学性质、对人类健康的影响、对环境影响,在环境中的降解与富集以及其它等5方面。自1981年起,试验方法已成为OECD成员国以及许多非成员国化学品测试及其潜在危害性评价工作认同的参考工具,也是OECD成员国化学品数据相互认可(MAD)的重要内容。目前这套测试方法已作为国际标准而被广泛采用。自2002年世界卫生组织、国际劳工组织及联合国环境规划署联合出版《GLOBAL ASSESSMENT OF THE STATE-OF-THE-SCIIENCEOF ENDOCRIINE DIISRUPTORS》以来,有关内分泌干扰物对人类健康和环境安全不利影响的问题引起了各国政府管理部门的高度重视。与此同时OECD工作组组织和协调各成员国,投入大量的人力、资源和财力,专门制订和评估化学品内分泌干扰效应的测试方法。OECD内分泌干扰物测试与评价研究工作由OECD试验准则国家协调员工作组负责,下设的内分泌干扰物测试与评价专家组(EDTA AG)和生态测试、哺乳动物测试以及非动物测试方法的3个专家组。专家组成员由各国国家协调员推荐的专家以及OECD的贸易与工业咨询委员会(BIAC)和动物保护国际委员会组成。近10来,OECD 制订了内分泌干扰物测试方法制订和评价的概念框架,提出了5个层次筛选程序,并在此基础上颁布了OECD内分泌干扰物筛选和测试方法的标准化要求。OECD专家组对其已经颁布的168个方法进行了筛选,提出其中二代繁殖毒性、致癌试验、鸟类繁殖毒性等11项试验方法可以用于分泌干扰物筛选和测试,截至2013年7月新制订并颁布了大鼠Hershberger试验、28天大鼠反复给药毒性试验、大型溞繁殖毒性试验、鱼性发育试验以及蛙变态试验等13项新方法。目前OECD专家组正在组织美国、英国、德国、日本、丹麦、瑞典等国家专家研究和制订鱼类繁殖毒性、蛙胚胎甲状腺检测、糠虾生活史毒性、软体动物繁殖毒性、鸟类二代繁殖毒性以及SST 检测雄性和抗雄性激素等16个方法。
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  T9.3 Characterizations in nanotoxicology and nanomedicine development：A regulatory perspective

  ZHANG Yong-bin;William SALMINEN;SHI Qiang;YANG Xi;Yvonne JONES;Paul HOWARD

  2013, 27(S1): 214-215.

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  With the rapid expansion of nanotechnology, there has been great concern on safety issue of the nano-product regulated by U.S Food and Drug Administration (FDA). Pre-clinical characterization and quality control during the manufacturing of nano-products is fundamental for understanding resulting safety issues during their wide application. All regulated products are required to submit basic physio-chemical characterization as part of Investigational New Drug (IND) Applications or New Drug Applications (NDA) submitted to the FDA for review. Characterization of gold nanoparticles (Au NPs), silver nanoparticles (Ag NPs) and single walled carbon nanotubes (SWCNTs) will be discussed as cases studies. The nanomaterials were characterized using transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS), Raman, and hyperspectral microscopy and other spectroscopy techniques. We examined their uptake and toxicity in primary rat hepatocytes, rat adrenal pheochromocytoma cells (PC12) or in vivo rodent models. Cytotoxicity was assessed by examining cell membrane integrity and mitochondrial activity (LDH, XTT and MTT assay) and oxidative stress (DCF assay; reduced glutathione levels; PCR array for ROS responsive gene expression). Uptake and subcellular localization were monitored using TEM, confocal Raman microscopy and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) analysis. Although Au NPs were taken up by the cells in a time- and size-dependent manner, no cytotoxicity or ROS stress was detected. Conversely, uptake of SWCNT was cytotoxic and generated ROS in surface coating-dependent manner. PEGylated SWCNT exhibited less potency than uncoated SWCNTs. On the other hand, Ag NPs decreased the body weight and locomotor activities after intravenous exposure in rats. These studies suggest the surface coating, size and composition play import roles in toxicity of the nanomaterials. The multiple characterization approaches used in this study provided the solid basis to understand the biological responses for regulatory purpose.
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  T9.4 纳米材料安全性评价的探索与思考

  唐萌

  2013, 27(S1): 215-215.

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  二十一世纪以来,纳米技术与纳米材料已发展成为推动世界各国经济发展最具潜力的主要驱动力之一,并逐渐具有开创全新产业和迅速改变其他领域国际竞争基础的潜力。纳米科学技术的飞速发展可能会导致生产方式与生活方式的革命,因而成为当前发达国家投入最多、发展最快的科学研究和技术开发领域之一。在人们逐渐认识纳米技术与纳米材料的优点及其蕴涵的巨大市场潜力的同时,美国、欧洲、中国的科学家也在讨论纳米颗粒对人体健康、生存环境和社会安全等方面是否存在潜在的负面影响?2003年4月以来,Science和Nature杂志曾多次发表编者文章,因此,纳米生物效应研究也逐步从简单的利用传统毒理学的实验方法和技术对新出现的纳米材料进行研究, 发展成一个前沿交叉的学科纳米毒理学。纳米材料的安全性毒理学评价是中国、美国、欧盟、英国、日本等国都十分重视的研究领域。我国先后对纳米毒理学研究设立了973计划和国家重大科学研究计划专项经费支持;美国《国家纳米技术计划》专项研究纳米生物安全性问题;欧盟把研究纳米生物环境健康效应问题的重要性列在欧洲纳米发展战略的前列;英国政府投入巨资研究纳米安全性问题;日本也拟建立纳米材料人类健康危害的评价方法并提出安全性管理办法。目前,全世界许多国家都在研究纳米材料的安全性,有一些国家已经提出了纳米材料安全性评价的构思,但是还没有哪个国家对纳米材料的安全性评价提交可以实施的程序和获得认可的方法。根据目前的研究成果,我们需要讨论纳米材料安全性评价的架构,提出新的可以用于纳米材料安全性毒理学评价的实验方法,以起到抛砖引玉的作用,推动我国纳米毒理学研究向着健康有序的方向发展。
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  T9.6 纳米二氧化钛对大鼠免疫毒性效应

  付艳云;张艳秋;马书梅;梁戈玉

  2013, 27(S1): 216-216.

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  目的 探讨纳米二氧化钛(nm-TiO₂)对大鼠的免疫毒性效应。方法 将30只SPF级雄性SD大鼠随机分为生理盐水对照组、纳米二氧化钛低剂量组(0.5 mg·kg^-1)、中剂量组(4 mg·kg^-1)、高剂量组(32 mg·kg^-1)三个实验组以及微米二氧化钛组(32 mg·kg^-1)。采用非暴露式气管滴注染毒法,每周染毒2次,反复染毒28 d,股动脉放血处死。应用流式细胞仪进行外周血淋巴细胞表型分析,分离脾细胞,CCK-8法检测脾T和B细胞增殖能力,乳酸脱氢酶法检测脾NK细胞活性的改变,组织病理学检测肺、淋巴结、脾及胸腺的损伤情况。结果 (1)对B淋巴细胞而言,随着纳米二氧化钛染毒剂量的增加,B淋巴细胞的数量增加,32 mg·kg^-1剂量组与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05),微米二氧化钛染毒组与对照组相比差别无统计学意义(P>0.05);各组的T细胞亚群数量、NK细胞数量与对照组相比,差别无统计学意义(P>0.05)。(2)纳米二氧化钛染毒后,随着剂量的增加,T和B细胞的增殖能力呈上升趋势,在4和32 mg·kg^-1的剂量下,纳米二氧化钛对大鼠T和B淋巴细胞的增殖能力与生理盐水组相比差别有统计学意义(P<0.05),未发现微米二氧化钛染毒组T和B细胞的增殖能力与对照组相比有统计学意义(P>0.05)。(3)纳米二氧化钛染毒后,随着染毒剂量的增加,在32 mg·kg^-1的剂量下,NK细胞活性与生理盐水组相比差别有统计学意义(P<0.05),未发现微米二氧化钛染毒组NK细胞活性与对照组相比有统计学意义(P>0.05)。(4)组织病理学结果显示,纳米二氧化钛高剂量组肺泡腔内见大量纳米棕色颗粒、团块状物质沉积,肺间隔增宽,间隔内见少量纤维组织增生、少量渗出液,见纳米棕色颗粒、团块状物质沉积。高剂量组淋巴结可见纳米棕色颗粒、团块状物质沉积。脾和胸腺均未见异常。结论 纳米二氧化钛对大鼠免疫细胞及器官有一定的影响,对T和B淋巴细胞介导的免疫应答均有增强作用,对NK细胞活性有一定的增强作用,对肺、淋巴结有一定的损伤作用。
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  T9.7 CdTe量子点影响木瓜蛋白酶结构和功能的热力学机制

  肖琦;丘杭娜;黄珊

  2013, 27(S1): 216-217.

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  目的 选择木瓜蛋白酶为研究对象,结合紫外-可见光谱、荧光光谱和圆二色谱等,系统研究在近似生理条件下CdTe量子点与木瓜蛋白酶之间的相互作用规律,从分子水平探讨其作用机制、作用模式以及作用位置等。方法 运用荧光共振能量转移理论探讨CdTe量子点在木瓜蛋白酶上的作用位置与色氨酸残基间的平均距离。通过三维荧光光谱、同步荧光光谱和圆二色谱等考察了CdTe量子点对木瓜蛋白酶二级结构的影响。结果 与常规物质相比,纳米材料具有独特的物理、化学性质,其对生态系统生物种群和个体的潜在负面影响更不容忽视。近几年来,纳米材料的生物效应受到了越来越多的关注和重视,特别是蛋白质等生物大分子同纳米颗粒的相互作用逐渐引起研究人员的兴趣。目前,有关荧光纳米颗粒量子点与酶之间相互作用的研究较少,其相互作用机制尚不清楚。因此,作为生物活体成像和医学诊断中广泛使用的纳米材料,研究其对生物体内常见的酶活性、构型等影响及其机制显得尤为重要。结论 利用紫外-可见吸收光谱及荧光光谱法研究了CdTe量子点与木瓜蛋白酶之间的相互作用规律,从分子水平探讨其作用机制和作用模式,并通过圆二色谱、三维荧光光谱、圆二色谱等考察了CdTe量子点对木瓜蛋白酶二级结构的影响。
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  T9.8 生理毒物动力学模型在纳米毒理学研究中的应用进展

  薛玉英;张婷;唐萌

  2013, 27(S1): 217-217.

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  纳米材料的生物安全性问题已引起全世界的高度重视。研究显示,纳米颗粒具有穿透各种生物膜屏障从而进入机体不同组织的能力,可能对人类健康和环境带来威胁。然而由于纳米材料的多样性及自身性质的特殊性,不同研究的实验数据难以互相比较,给纳米生物安全性研究提出了新的挑战,而生理毒物动力学(PBTK)模型是建立在机体性能和物质特性基础上的一种整体模型,不仅可预测组织中的浓度变化,而且可将动物实验结果外推至人,在纳米材料暴露风险评估中显示良好应用前景。毒物动力学(toxicokinetics)是用数学方法定量地研究化合物在体内的吸收、分布、代谢、排泄等动态变化过程的一门学科。经典毒物动力学房室模型已被广泛应用,但组成模型基本单位的"房室"仅是一个数学上的抽象概念,没有实际的解剖学和生理学意义。PBTK模型是指一种更符合毒物在体内动态变化的具体状况的模型。该模型中,以与毒物体内分布有主要关系的单个或多个脏器、组织或体液的"生理学室"来代替经典毒动学模型中的隔室,毒物以血流的传输为驱动力,随血流透过各种生物膜进入某"生理学室",离开时可能发生的消除则以该"生理学室"的各种清除率(代谢清除率、排泄清除率)进行描述。最后根据质量平衡关系,对每一生理学室可建立一个微分方程描述化学毒物在室内动态变化,涉及多少个生理学室,则可列出多少个方程,这一套方程组即是PBTK模型的表达方式。求解方程组可得到各组织或器官的毒物浓度与时间的关系。采用这种方法可更明确阐述毒物在人或动物体内吸收、分布、代谢、排泄过程的真实情况,从而预测靶组织中毒物的剂量。PBTK模型最大的优势在于可将动物实验结果进行"种属间外推",即将动物实验结果外推至人,并可实现不同生理条件下,不同剂量、不同给药途径和给药方案之间的"推导"。因此在新药开发和毒理学领域已得到广泛应用。在纳米材料风险评估研究中,PBTK模型的研究尚处于起步阶段,LI等在ACS Nano上发表综述强调PBTK模型在纳米研究和风险评估中的重要作用以及应用前景。OECD等组织也将PBPK模型列为纳米材料风险评估的有效定量工具。PBTK模型在纳米材料的设计、安全使用和风险评估中发挥重要作用。
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  T9.11 新型配位聚合物Fe₃O₄@Salphen-In^Ⅲ磁性纳米粒子特异性杀伤肿瘤细胞的研究

  徐帅;刘晶;李典;王黎明;郭佳;汪长春;陈春英

  2013, 27(S1): 219-219.

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  目的 探讨新型配位聚合Fe₃O₄@Salphen-In^Ⅲ磁性纳米药物与人肺癌细胞(A549)和正常人支气管上皮细胞(16HBE)的作用,研究其在胞内酸性pH条件下降解形成Fe-Salphen络合物对不同类型细胞作用的差异。方法 用高分辨率投射电子显微镜(HRTEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、热重分析和荧光光谱对Fe₃O₄@Salphen-In^Ⅲ表征;采用细胞毒性试剂盒(CCK-8)进行A549和16HBE的毒性评价;用电耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定入胞含量;用溶酶体荧光探针LysoSensor定量检测Fe₃O₄@Salphen-In^Ⅲ对溶酶体pH的影响;用AO染色评价溶酶体的完整性;用线粒体荧光探针罗丹明123检测线粒体膜完整性;用Western-blotting检测胱天蛋白酶3表达量的变化。结果 Fe₃O₄@Salphen-In^Ⅲ对A549有很强的细胞毒性,但是对16HBE几乎没有毒性;Fe₃O₄@Salphen-In^Ⅲ容易进入A549细胞,细胞摄入量有时间和浓度依赖性,大约是进入16HBE含量的3倍; A549溶酶体膜结构完整性被破坏,线粒体膜电位降低,胱天蛋白酶3前体的表达量减少,激活了凋亡途径而特异杀死肿瘤细胞。而正常上皮细胞16HBE溶酶体膜结构保持稳定性,线粒体膜结构稳态,胱天蛋白酶3前体表达量不受影响,纳米药物对细胞无明显毒性。结论 新型配位聚合物Fe₃O₄@Salphen-In^Ⅲ具有精细的核壳结构,进入细胞后在溶酶体中降解成为具有活性的Fe-Salphen络合物,触发线粒体介导的细胞凋亡途径。同时,Fe₃O₄@Salphen-In^Ⅲ对肿瘤细胞A549具有选择性杀伤作用,而不对正常细胞16HBE造成明显毒性。
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  T9.12 石杉碱甲预防梭曼中毒的研究

  张瑞华;李丽琴;石童;鹿晓晶;王陈;王惠芳

  2013, 27(S1): 219-220.

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  目的 评价石杉碱甲单方预防小鼠梭曼中毒的效果。方法 通过给ICR小鼠肌内注射不同剂量的梭曼,观察动物的症状及并记录动物的死亡数量,确定梭曼对小鼠的毒性效应关系,采用Bliss法进行数据处理,求出梭曼的LD₅₀和LD₉₅。ICR小鼠静脉注射不同剂量的石杉碱甲(0.3, 0.5和0.8 mg·kg^-1)15和30 min后,使用1×LD₉₅剂量的梭曼给小鼠肌内注射,观察动物的症状和死亡情况。对石杉碱甲预防小鼠梭曼中毒的效应剂量进行研究,以获得合适的预防剂量范围。结果 小鼠肌内注射梭曼的LD₅₀和LD₉₅分别为116和143 μg·kg^-1;三种剂量的石杉碱甲尾静脉注射后15和30 min时均能有效预防1×LD₉₅剂量的梭曼致死效应;但是0.8 mg·kg^-1剂量组动物出现了明显的毒性作用,且有10%的动物出现了死亡;0.3~0.5 mg·kg^-1剂量范围内均可以有效预防梭曼中毒,毒性作用较轻且很快恢复正常。结论 在梭曼剂量较低的情况下,单用石杉碱甲就可以起到很好的防护作用,能够预防梭曼中毒的发生及死亡。
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  T9.13 纳米镍的雄性生殖毒性作用

  孔璐;张婷;唐萌;浦跃朴

  2013, 27(S1): 220-220.

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  目的 研究金属纳米镍的雄性生殖毒性。方法 采用计算机辅助精子分析系统(CASA法)对大鼠附睾内精子能动性,即精子曲线运动速度(VCL,μm·s^-1)、平均路径速度(VAP,μm/s)、直线运动速度(VSL,μm·s^-1)、鞭打频率(BCF,Hz)、精子头侧摆幅度(ALH,μm)、直线性(LIN,%)、前向性(STR,%)和精子头长宽比(ELON,%)等反映运动能力和方式的参数进行测定;采用酶联免疫吸附法(ELISA法)对大鼠血清性激素水平,即卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和睾酮(T)进行测定。结果 VCL在纳米镍高剂量组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05);VAP与VSL值的差异虽无统计学意义,但纳米镍等各剂量组的数值与对照组相比,均有降低趋势。BCF在纳米镍各剂量组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。LIN随着纳米镍剂量的增加有下降趋势,且纳米镍中、高剂量组的LIN值显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)。其它参数纳米镍各剂量组等与对照组间未见显著性差异。纳米镍中、高剂量组血清FSH和T水平与对照组相比有显著性降低(P<0.01),且降低水平随纳米镍剂量增加而更加显著。结论 在本实验条件下,纳米镍对雄性大鼠具有生殖毒性作用,能引起大鼠附睾内精子的运动方式和运动速度发生改变,以及降低大鼠血清性激素水平。
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  T9.15 食品添加剂纳米二氧化硅对胃肠道细胞的毒性

  杨怡新;宋正梅;成斌;相锟;陈欣欣;刘佳蕙;王艳丽;刘元方;王海芳

  2013, 27(S1): 221-221.

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  目的 研究了食品添加剂纳米SiO₂对胃肠道细胞的作用。方法 选择四种来自不同厂家的食品添加剂纳米SiO₂(S1,S2,S3,S4,粒径均在10~50 nm),并进行详细的表征。研究不同剂量的四种纳米SiO₂在不同暴露时间下对人胃黏膜上皮细胞GES-1和人结肠癌细胞Caco-2的形态、活力、细胞膜完整性的影响,并通过测量纳米暴露下SiO₂细胞增殖、纳米颗粒摄入、线粒体膜电位、细胞周期、细胞凋亡与坏死及氧化应激等研究毒性的作用机制。另外,建立单层Caco-2细胞膜,研究了模拟条件下纳米SiO₂跨越小肠的能力。结果 纳米SiO₂对细胞活力的影响存在剂量和时间效应,即浓度越高,作用时间越长,细胞活力下降越明显;样品之间有一定的差异。纳米SiO₂不会造成细胞膜损伤、细胞形态改变、细胞凋亡与坏死,但会抑制细胞的增殖。超微结构分析结果表明纳米SiO₂会被胃肠道细胞大量摄入,而且导致轻微的氧化应激反应。纳米SiO₂对两种细胞的毒性影响和机制相似,即通过阻滞细胞停留在S期来抑制细胞的增殖。跨膜实验研究发现纳米SiO₂穿膜率很低,说明纳米SiO₂很难穿越小肠,进入血液循环。结论 一定剂量下的食品添加剂纳米SiO₂对胃肠道细胞是比较安全的,但高剂量和长时间作用会导致细胞损伤。
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  T11.3 伊维菌素对肠上皮紧密连接结构和功能的影响

  孙英健;张银花

  2013, 27(S1): 235-236.

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  目的 探讨阿维菌素类药物的毒性作用机制。方法 以人的肠道细胞Caco-2细胞为细胞模型,用MTT法研究伊维菌素(IVM)对细胞的增殖毒性,确定IVM的IC₅₀,以免疫荧光和Western blot方法检测IVM对紧密连接蛋白在Caco-2细胞膜上的定位及对紧密连接蛋白表达的影响。结果 IVM能抑制CaCo-2细胞增殖,IC₅₀为(15.9±4.0)μmol·L^-1,IVM对肠道细胞的毒性显著低于对神经细胞的毒性。免疫荧光和Western blot检测发现研究发现IVM处理后微丝蛋白发生聚集,并减少,在8和16 μmol·L^-1时微丝蛋白的形态改变和表达量显著下降。在药物处理48 h后紧密连接蛋白ZO-1和闭合蛋白表达也下降,ZO-1和闭合蛋白则随着药物处理浓度的增加在细胞膜上的分布明显减少。 而JAM-A的表达似乎变化不明显,但其分布发生改变,对照组及低浓度处理组JAM-A蛋白主要分布于细胞膜上,随之药物浓度增加,JAM-A在细胞膜上的分布减少,在8 μmol·L^-1浓度下JAM-A蛋白在细胞膜上的成聚集分布,并且多数分布于细胞质内。由此可见IVM虽然对肠道细胞的毒性较低,但是在相对安全的药物浓度下对肠道上皮细胞屏障的紧密连接结构有明显的影响。结论 IVM能降低细胞紧密连接蛋白的膜上的表达,干扰上皮细胞的屏障功能,这可能使IVM通过屏障进入循环系统的药物增加,而最终导致神经毒性。
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  T9.16 肠损伤对小鼠摄入纳米氧化锌的影响

  杜利静;刘佳蕙;马辛;方捷;宋正梅;陈欣欣;相锟;崔阳冬;王艳雯;王海芳

  2013, 27(S1): 221-222.

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  目的 肠道损伤时小鼠对纳米氧化锌的摄入。方法 选择纳米氧化锌作为研究对象,微米氧化锌为对照。两种氧化锌进行了详细表征,包括形貌、粒径、纯度以及溶解性。选择ICR小鼠,用吲哚美锌建立肠损伤模型。模型建立后,通过灌胃给药,4~24 h后,处死小鼠,收集血液和脏器。分离血清用于血生化指标的检测;固定肾、肝、小肠组织,用于病理检测。脏器中的锌、铁、铜元素含量用电感耦合等离子体质谱检测,结合同步辐射技术观察小肠绒毛中锌的分布。结果 两种氧化锌粒径均匀,纯度高。用髓过氧化物酶活性及小肠切片透射电镜观察确定肠损伤建模成功。正常及肠损伤ICR小鼠均摄入氧化锌,尺寸影响氧化锌的摄入。与正常组相比,肠损伤组导致纳米氧化锌在血、肝、肾、脾和小肠中摄入更高。在肠损伤状况下,血、肾、脾、肺和小肠摄入纳米氧化锌高于微米氧化锌,但肝脏摄入更多微米氧化锌;同步辐射测量小肠绒毛中锌含量和分布的结果验证了这一结论。不论正常模型,还是肠损伤模型,脏器中微量元素铁和铜含量不受氧化锌摄入的影响。在血生化方面,纳米氧化锌暴露影响了肠损伤组的ALT等水平,其余各指标变化不明显。结论 肠损伤影响小鼠对纳米氧化锌的摄入。
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  T9.17 表面修饰对量子点毒性影响的研究进展

  詹庆玲;唐萌

  2013, 27(S1): 222-222.

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  量子点(QD)因其优良的光谱特性已在生物学中获得广泛应用,如QD在细胞标记、活体和组织成像和光动力学治疗等生物学中的应用及其最新研究进展。随着其在科学研究中的运用越来越广泛,其潜在的生物学负效应和(或)毒效应也引起了国内外科学工作者的关注,成了近年研究的热点。于是围绕如何降低QD的毒性以进一步推广应用做了多方面的研究,本文简要阐述了QD的基本特性:(1) 在结构上,一个量子点由一个晶体类金属核心和一个可以将核物质性质钝化及提高QD生物相容性的"帽"或"壳"组成。QD核心是由半导体,重金属,和磁性过渡金属等各种各样的金属配合物构成。(2) 在尺寸上,QD三维尺寸小于或者接近激子波尔半径(一般直径不超过10 nm),外观恰似一极小的点状物体,是准零维(quasi.zero-dimensional)纳米材料。QD内部电子在各方向上的运动都受限,电子态呈量子化分布,显著的量子限制效应(quantum confinement effect)使其能带变成具有分子特性的分立能级。QD在生物医学领域的应用及其潜在的毒性:首先,量子点可以通过改变其尺寸大小来调整发射波长,它的发射波长范围从紫外线(UV)到近红外线(NIR)。QD有广泛的吸收光谱和较窄的发射光谱,他们可以用于多路复用成像,发出不同颜色光的量子点可以被相同波长的光所激发。其次,QD表面可携带活性组织这一生物功能,为他们执行目标传递任务提供了便捷。重点阐述了几类对QD的表面修饰:采用核壳结构修饰,包括以自身材料为壳,以二氧化硅(SiO₂)为壳;亲水性基团的修饰,包括巯基类,其他有机小配体;大分子聚合物对量子点的修饰;有针对性的表面修饰-功能性量子点,包括量子点作为药物载体,量子点作为示踪剂;以及各种表面修饰对降低QD毒性的作用;最后,对该领域的进一步研究进行了展望,随着各种相关研究相继完成后,在生物学上科学工作者们会给出新的见解,这可能会给临床诊断,甚至治疗提供新的应用方案。
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  T9.18 纳米碳酸钙对人群及大鼠神经行为功能的影响

  刘卫花;冯娟;胡博骅;钱怡;蒋勇;张盼红;马宁;仇玉兰;唐仕川;郑金平

  2013, 27(S1): 222-223.

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  目的 观察纳米碳酸钙对职业暴露人群神经行为功能的影响及对亚慢性染毒纳米碳酸钙大鼠神经行为功能的影响,探讨纳米碳酸钙的神经毒性。方法 (1)选取山西某纳米碳酸钙厂30名暴露水平较高的工人为测试对象,同时选取同厂机关工作人员22人为对照组。个体采样检测空气纳米密度。参照WHO推荐的神经行为核心测试组合(NCTB)对研究对象的情感状态和神经行为功能进行测试。(2)选取健康的SD大鼠随机分为对照 (生理盐水)、微米碳酸钙(200 mg·kg^-1)、纳米碳酸钙低剂量(12.5 mg·kg^-1)、中剂量(50 mg·kg^-1)、高剂量组(200 mg·kg^-1),滴鼻法染毒12周,每周5次,连续12周,采用Morris水迷宫和旷场试验观察大鼠的神经行为变化。结果 (1)暴露工人作业场所纳米碳酸钙浓度显著高于对照组(P<0.05)。人群神经行为测试结果显示,纳米碳酸钙暴露工人愤怒-敌意、慌张-困惑、疲劳-惰性等情感指标得分显著低于对照组(P<0.05);暴露组工人数字跨度(总分、顺序、倒序)、视觉记忆等神经行为功能指标得分显著低于对照组(P<0.05)。多元线性回归分析结果显示,年龄和职业暴露是人群神经行为改变的主要影响因素。(2)Morris水迷宫测试和旷场试验结果显示,与对照组、微米组比较,纳米碳酸钙染毒组大鼠平均潜伏期、平台象限停滞时间、平台象限滞留时间百分比、穿越平台次数、平均速度及旷场试验总运动路程、中央运动总路程、中央活动时间、站立次数均未见有显著性差异(P>0.05),各染毒组之间也未见有显著性差异(P>0.05)。结论 纳米碳酸钙作业环境可能与暴露工人神经行为功能损伤有关。纳米碳酸钙是否直接导致人和动物神经行为损伤尚待进一步研究。
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  T11.1 小动物CO₂安乐死装置的应用研究

  刘玉萍

  2013, 27(S1): 234-235.

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  目的 为了充分了解CO₂安乐死装置的应用和进行动物安乐死的效果,比较动物种属和数量间死亡时间有无差异,为评价和使用CO₂安乐死提供依据。方法 用HOPE-MED8160型小动物善终处置设备对三种实验室常用的啮齿类小动物(大鼠、小鼠、豚鼠)进行CO₂安乐死处理,向安乐死仓内缓慢充入CO₂气体直到到达最高浓度99.9%,分别观察1只、5只、10只动物在进行CO₂安乐死时达到死亡的CO₂浓度,动物死亡所需要的时间,动物在死亡过程中的各种反应,包括神经行为改变、呼吸变化,无线遥测系统检测的心率、体温以及活动度的变化等。结果 随着CO₂浓度的增加,动物的呼吸一般是先加快、加深后减慢,最终变得极其微弱直至死亡,心率逐渐减慢至0。大鼠和小鼠的死亡时间[分别是(4.80±0.64)min和(4.28±0.58)min]和死亡时CO₂浓度[分别是(89.20±4.32)%和(87.33±2.52)%]之间无统计学差异(P>0.05),豚鼠死亡时间较长(5.92±0.77)min,死亡时的CO₂浓度达到99.9%。动物的心跳终止均是在呼吸停止后一小段时间(约半分钟)。同时放置同种动物数量越多,死亡需要时间会有所延长。动物体温在整个安乐死过程中基本没变化,活动度在开始通CO₂时有所增加,到30%~40%的CO₂浓度时活动度变为0。结论 CO₂处理是一种合适的动物安乐死方式。
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  T11.2 中药制剂的急性毒性试验

  王宏军;周铁忠;蒋红;刘英姿;何钉玲

  2013, 27(S1): 235-235.

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  各种外源化学物包括工业化学品、农用化学品、药物、食品添加剂、日用化学品等,在被允许投产、进入市场或进出口贸易前,都必须进行安全性评价,急性毒性试验是进行安全性评价必做项目,该试验为安全性评价提供生物学信息,并为管理毒理学提供重要的决策资料。根据国家食品药品监督管理局对新药申报相关文件规定及农业部颁布的《新兽药申报注册管理办法》,均指出无论是化学药品还是中药、生物制品均需要开展安全性评价,急性毒性试验是最基础的毒性试验。中药安全性问题也引起多方学者的关注,本课题组在金银花、连翘、天花粉、甘草4味中药组成的银翘天甘制剂开发研究过程中,发现口服该复方制剂对雏鸡有一定毒性,小鼠腹腔注射亦有明显的刺激性;在给小鼠灌服过程中,拟寻找最大给药剂量、适宜的给药次数发现该制剂还可引起小鼠死亡。于是开展银翘天甘制剂的急性毒性试验。称取金银花-连翘-天花粉-甘草(2:4:3:9)180 g以70%乙醇为溶媒,用改良索氏提取法提取,提取3次,合并提取液,浓缩回收乙醇,60℃恒温干燥成药膏。将提取物配成相当于生药15 g·ml^-1的溶液,然后按1.5倍倍比稀释成6个浓度剂量,取(20±2)g清洁昆明系小鼠60只,随机区组法分成6组,每组10只,灌胃给药一次,灌胃量为0.2 ml/10 g,用改良寇氏法计算LD₅₀及95%可信限,得出昆明系小鼠口服银翘天甘醇提物的LD₅₀为83.676 g·kg^-1,其95%可信限为65.751~106.488 g·kg^-1。根据急性毒性分级,该复方制剂属于无毒性。通过文献查阅,并未见到金银花、连翘、天花粉、甘草单味中药的急性毒性试验报道,但在本项目研究过程中却发现其组合物的醇提物超过一定剂量对机体会引起损害。由此也提示我们,中药研发过程中,开展安全性评价是必要的,通过本项研究也为该制剂的进一步研发和应用提供剂量支持。尤其是设立临床用药剂量提供实验依据。
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  T9.23 纳米碳酸钙职业暴露人群的机体抗氧化系统的影响

  钱怡;仇玉兰;胡博骅;刘卫花;冯涓;马宁;张盼红;蒋勇;张文平;田凤洁;郑金平;唐仕川

  2013, 27(S1): 225-225.

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  目的 初步探讨纳米碳酸钙对职业人群的机体抗氧化系统的影响。方法 整群抽取山西某纳米碳酸钙生产厂全部工人119名,其中90名生产一线的工人为暴露组;29名行政管理人员为对照组。采集所有研究对象空腹静脉血血清及空腹中段尿样上清。血清中谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的测定采用比色法;超氧化物歧化酶(SOD)的测定采用羟胺法;丙二醛(MDA)的测定采用TBA法;一氧化氮(NO)的测定采用硝酸还原酶法以及尿中的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量测定采用ELISA法。结果 单因素分析结果表明,纳米碳酸钙暴露组与对照组比较,GSH水平明显降低且差异有统计学意义(P=0.047);GSH-Px, SOD和8-OHdG的含量呈下降趋势,差异均无统计学意义(P >0.05) ; MDA和NO的含量呈上升趋势,差异均无统计学意义(P >0.05)。多元线性回归分析显示,血清中GSH水平纳米碳酸钙暴露呈负相关,MDA水平与性别相关。结论 纳米碳酸钙会造成职业人群的氧化损伤。
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  T9.24 金纳米棒的表面化学性质调控其细胞生物学效应

  张田露;王黎明;陈春英

  2013, 27(S1): 225-226.

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  目的 研究表面化学性质对金纳米棒(AuNR)的影响和细胞膜的相互作用及其带来的细胞生物学效应。方法 通过电镜表征CTAB/AuNR的尺寸与形状,用环境扫描电子显微镜(ESEM)观察AuNR对细胞膜表面形态的影响,用透射电子显微镜(TEM)观察AuNR在细胞内外的定位和分布;通过CCK-8和Live-Dead染色的方法检测CTAB/AuNR对肺上皮细胞A549的毒性;分别用乳酸脱氢酶(LDH)定量测定和AO染色分析CTAB/AuNR对A549细胞膜和溶酶体膜完整性的影响;并用罗丹明123染色研究AuNR对线粒体膜电位(MMP)的影响。结果 CTAB/AuNR长径比为4.2,平均长度为(55.6±7.8)nm,宽度为(13.3±1.8)nm。CTAB/AuNR产生的细胞毒性大于其他表面修饰的AuNR, 原因是CTAB/AuNR可以插入、并渗透到细胞膜形成缺陷,诱导细胞膜损伤,LDH释放,细胞活力下降,最终导致细胞坏死。但同样带正电荷的PDDAC/AuNR并不对细胞膜造成明显损伤;在完整的细胞培养液中CTAB/AuNR可增加溶酶体膜渗透性,降低线粒体膜电位,最终导致细胞死亡。结论 CTAB/AuNR的细胞毒性源于其表面双亲性的CTAB双层结构,而非表面电荷;摄入的CTAB/AuNR影响细胞器膜结构完整性和功能引起细胞凋亡。
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  T9.25 小鼠吸入雾化纳米氧化锌诱发的不良反应

  范兰兰;陈仁焜;林嫔嫔;林家骅

  2013, 27(S1): 226-226.

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  比较不同的纳米氧化锌(ZnONP)暴露方式对其毒性效应的影响。体内实验部分,主要将小鼠暴露于雾化ZnONP的环境中,分析其产生的剂量依赖性不良反应。雌性BALB/c小鼠暴露于浓度为0,0.09,0.18和0.34 mg·m^-3、粒径为10 nm的雾化ZnONP中5 h,并在24 h后进行分析检测。体外实验部分,主要利用体外培养肺上皮细胞,通过淹没式(submerged)和气-液界面(ALI)两种暴露方式,进一步验证其生物毒性效应。肺上皮细胞暴露于ZnONP 48 h后,分析其细胞毒性和相关细胞发炎因子的分泌情况。物理性实验结果显示,10 nm ZnONP可较均匀分布在呼吸式暴露腔和ALI系统中,而在submerged系统中,ZnONP颗粒则产生明显聚集的现象。由体内实验结果发现,小鼠持续暴露于ZnONP 0.34 mg·m^-3中5 h,可引发其肺部产生急性发炎现象。通过呼吸方式进入体内的ZnONP主要分布在细支气管肺泡连接处,并于该处诱导发炎反应。由体外实验结果发现,ZnONP在两种体外暴露方式具有相似的细胞毒性效应。通过submered暴露方式,ZnONP可诱导细胞分泌相关发炎因子。然而在相同条件下,通过ALI暴露ZnONP的肺上皮细胞并无明显诱发发炎因子。由本研究结果看来,submerged暴露方式似乎比ALI暴露方式更能预测体内吸入ZnONP后诱发的炎症反应,但是本研究体内与体外实验中的相关条件,如ZnONP暴露剂量、ZnONP暴露粒径等的可比性并不高。因此,未来本研究团队将持续进行纳米物质毒性试验及体外评估系统的优化研究,除了希望可以进一步了解纳米物质可能对生物体产生的健康风险外,更期望能建立一个可替代体内的体外毒性检测系统,以提高纳米物质的毒性检测效率。
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  T9.26 手性干扰方法研究纳米ZnO对小球藻的氧化应激作用

  周慧;姚鸿州;周瑛;王晓军

  2013, 27(S1): 226-227.

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  目的 实验应用2,4-滴丙酸(DCPP)研究纳米ZnO对小球藻的毒性机制。方法 将处于生长对数期的小球藻暴露于不同浓度的两种构型的DCPP中,通过生长抑制试验,选取一个对小球藻生长低抑制的DCPP浓度用于后续试验。将暴露实验分成若干组:不同浓度的纳米ZnO(0, 5, 10和20 μmol·L^-1)作用组、不同浓度的纳米ZnO加一定浓度的R-DCPP作用组、不同浓度的纳米ZnO加S-DCPP作用组、对照组。暴露72 h后计算各作用组的抑制率来反映各物质在不同浓度下对小球藻的毒性。观察20 μmol·L^-1纳米ZnO及该浓度纳米ZnO中分别加入两种构型DCPP后小球藻SOD及MDA含量的变化。结果 不同浓度的纳米ZnO中加入两种构型DCPP后对小球藻的抑制率比单一纳米作用的均有所增加,且抑制率与纳米浓度成正相关性。纳米ZnO加R-DCPP作用组的小球藻抑制率增加量比加S-DCPP作用组的更显著。加入纳米处理的小球藻较对照组,MDA含量增加,SOD活性降低。并且纳米加R-DCPP作用后,MDA含量较加S-DCPP组的有所增加,而SOD活力则比加S-DCPP组的有所降低。结论 在两种构型DCPP影响下,纳米ZnO对小球藻的毒性大小发生不同变化,说明被广泛研究的溶出锌机制并非是纳米ZnO唯一的毒性机制。纳米ZnO与DCPP联合作用后,由于DCPP的低毒性,联合作用的毒性大小主要取决于纳米ZnO的浓度。SOD活性和MDA含量的变化说明纳米ZnO产生活性氧,使得R-DCPP处理后SOD的活性低于S-DCPP处理组,造成更严重的细胞脂质过氧化。综上所述,通过DCPP手性干扰研究表明氧化应激机制也是纳米ZnO的毒性机制之一。
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  T12.1 肾脏毒理

  郁红;冯怡;朱琳;周天胜;王蕾;郑艳生;张秀娟;杨秀英

  2013, 27(S1): 237-237.

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  对于治疗疾病的药物,肾是一个比较常规的毒性靶器官,它对药物及环境化合物的毒性作用极其易感,主要原因在于它有较高的血流/体重比,以及通过逆流机制对尿液及尿液组成(包括药物和化学物)独特的浓缩功能,尤其在供试品使用剂量较高的安全性评价实验。肾有比较高的血流量(RBF),约占心脏输出的25%,临床前毒性实验中供试品的高剂量投予使肾对很多药品有很高的排泄比例。肾小管上皮有高度代谢活性和高耗氧性,同时尿液中浓缩药物的能力,都使它易受毒性损伤。在较高的暴露条件下,肾毒性可能是药物的一种直接作用,也有可能是继发于其他组织的损伤。损伤的出现可能是由于肾小管或肾小球的损伤,或者是通过改变血液动力学的间接损伤。损伤特定类型取决于药物的组成,代谢特点,清除曲线以及特定代谢分布,最后决定其他局部组织的药物浓度和暴露时间。另外,当细胞能够从尿液和血液中特异性的摄取代谢物时,肾小管上皮细胞显著的转运活性使肾更加容易遭受损伤,这和综合治疗中药物和药物的相互作用相似。在用于毒性实验的实验动物,如啮齿类、狗和猴中存在一些和供试品不相关并常见的病变。这些病变常被认为是先天性的异常,如肾积水和多囊肾,他们和化合物引起的病变很容易被区分,但是有些药物也可引起相关病变。另外一些如慢性进行性肾病(CPN)或淀粉样变性通常出现的频率较高或者和年龄相关,在实验对照组和实验组动物中都有比较高的比例。在另外一些情况,出现背景病变的时间可能通过给药被加速,并且有明显剂量相关。因为许多化合物影响了肾小球的过滤率(GFR)或者RBF,这些都间接的加速了CPN的发展速度。尽管这些背景病变可能被认为与供试品无关,并且没有价值时,在一些情况下这些自发性病变,如CPN,事实上在一些药物摄取后发生的频率和严重程度都发生了增加。在这样的情况下,它与人类自发性病变相关性的了解比较缺乏,但可能与人肾生理一些临床效应相关。例如,一些影响肾小管蛋白质的吸收药物能使CPN在大鼠上被扩大,但是在人身上并不能引起相似的结果。因此,在临床前实验中被扩大的背景病变可能对临床上的肾毒性指征缺少直接意义,但是不可能没有临床相关性。对肾危害的定义需要在细胞及亚细胞水平对分子,生化,以及药物和化学物的结构作用有一个全面透彻的了解。而且需了解组织对各种化合物的基本反映使毒理病理学家能够推测肾毒性可能出现的直接或间接的作用机制。
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  T9.37 Combined toxicity of amorphous silica nanoparticles and methylmercury to human lung epithelial cells

  YU Yong-bo;DUAN Jun-chao;LI Yang;YU Yang;WANG Ya-pei;SUN Zhi-wei;

  2013, 27(S1): 232-232.

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  OBJECTIVE Exposure to the ambient particulate matters has been associated with cardiopulmonary morbidity and mortality. However, the interactive effects and health impacts of combinations of UFP and air pollutants are still not well understood. In the present study, we investigated the combined effects of amorphous silica nanoparticles (nano-SiO₂) and methyl mercury (MeHg) in a cellular system to understand their potential joint action type and underlying mechanisms of combined toxicity. METHODS A co-exposure model of nano-SiO₂ and MeHg was established. Lung adenocarcinoma cells (A549) were exposed to nano-SiO₂ only, mercury only, or a combination of nano-SiO₂ and MeHg. Factorial design was applied to analyze the potential interactions between nano-SiO₂ and MeHg. RESULTS Our results showed that co-exposure of nano-SiO₂ and MeHg could induce significantly enhanced reactive oxygen species (ROS) generation, lipid peroxidation and activity reduction of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px). The increasing oxidative stress resulted in oxidative DNA damage as well as cellular apoptosis. Additive and synergistic interactions were responsible for the combined toxicity of nano-SiO₂ and MeHg. CONCLUSION By providing information on combined toxicity research, our work takes a future step toward the studies investigating interactive effects and health impacts of co-exposure of UFP and air pollutants.
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  T9.38 Amorphous silica nanoparticles induce autophagic cell death in HepG2 cells triggered by reactive oxygen species

  YU Yong-bo;DUAN Jun-chao;YU Yang;LI Yang;LIU Xiao-mei;ZHOU Xian-qing;HUANG Pei-li;TIAN Lin-wei;SUN Zhi-wei;

  2013, 27(S1): 232-233.

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  OBJECTIVE The increasing of human exposure to silica nanoparticles (SNPs) makes it urgent for in-depth understanding of the toxic effects and underlying mechanisms of these materials on biological systems. Autophagic cell death is recognized as an alternative cell death pathway, yet there have been scarcely research of SNPs on the autophagic cell death and its associated mechanism. METHODS In the present study, we characterized the cellular uptake of the SNPs and further verified the activation of autophagy by MDC-staining of autophagic vacuoles, LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ conversion and TEM ultrastructural observation. Autophagic cell death was evaluated by the cellular co-staining assay. The underlying mechanisms of SNPs-induced autophagy and autophagic cell death were investigated by the intracellular ROS detection, autophagy inhibitor 3-MA and ROS scavenger NAC. RESULTS The results showed that all the MDC-positive cells, fluorescence intensity and LC3-Ⅱ protein level were gradually increased as the elevated concentrations of the SNPs. The typically morphological characteristics at different stage of autophagy development were observed (autophagosomes and autolysosomes). In addition, the double-stained cells were determined to be cell death by autophagy. The increasing cellular ROS level was correlated with the increase of autophagy activation and both the inhibitors of 3-MA and NAC were effectively suppressed the SNPs-induced autophagy and cell death. CONCLUSION For the first time, we reported a novel mode of action (MOA) for the SNPs involving dose-dependent autophagy induction and ultimate autophagic cell death resulting from the ROS generation in HepG2 cells. This study provides a new potential pathway of the SNPs-induced cell death and suggests the urgent need for safety evaluation of the SNPs before their utilization.
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  T10.1 生物毒素促进人类疾病机理解析和创新药物研发

  张云;王严戒;张勇;刘子超;赵峰;李文辉

  2013, 27(S1): 233-233.

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  生存策略和协同进化导致很多动物产生了动物肽类毒素可以与哺乳动物及人的目标蛋白分子相互作用,犹如天然的"矛与盾",并具有活性高、专一性强、分子多样性丰富的特征,是解析生命现象必备的"分子探针与解密器",也可以说是来自"上帝"的药方。血小板的主要生理功能是参与止血及血栓形成。通过抑制血小板激活达到防栓、治栓的目的,是血栓性心脑血管疾病(如中风,心肌梗死等)防治的重要手段之一。我们以新型两栖类三叶型多肽毒素Bm-TFF2为分子探针,发现抑素蛋白prohibitins调节蛋白酶激活受体1(PAR1)激活的功能。抑素蛋白是一类进化上保守的蛋白,参与调节衰老及很多疾病,如炎症和癌症等。在研究三叶型多肽毒素Bm-TFF2激动血小板的分子机制中,发现并鉴定了prohibitins在血小板的质膜上的表达并参与了凝血酶激动PAR1诱导的血小板聚集,PHBs被招募到脂筏中而富集从而调节G-蛋白偶联受体PAR1的激活和信号转导,提示了PHB蛋白做为新药物作用膜靶点的可能性。从一个5个氨基酸组成的五肽库(20⁵=325万个)中筛选出了一种可以与PHB1结合的小肽分子Pep5。通过Pep5的亲和层析及Pep5与PHB1的分子对接,揭示 Pep5可以与PHB1结合。同时,Pep5能够专一的抑制PAR1-AP或低剂量凝血酶引起的血小板聚集和钙释放,表明PHB1可以作为抑制血小板激活疾病治疗的有效靶点。蜈蚣是一味传统的重要动物药材,其中药药用已有几千年的历史。我们对蜈蚣的药效分子群和药理学活性进行了迄今为止最全面系统的揭秘。在转录组学层面:通过构建cDNA文库和随机测序,得到1122个全长cDNA序列,它们编码543个不同的蛋白质序列。蛋白质组学层面:从蜈蚣毒液中得到55个经过N端测序和质谱分析的蛋白质/多肽。生物学功能层面:生物学功能检测到下列活性:血小板聚集活性和溶血活性,抗凝活性,磷脂酶A2活性,蛋白酶抑制剂活性。进一步与华中科技大学分子生物物理重点实验室丁久平课题组合作,揭示了许多蜈蚣肽类生物活性物质可作用于不同的细胞膜离子通道(包括钠、钾、钙离子通道等)而发挥药理学作用。与已知数据库比对结果表明,这些蛋白质/多肽中大多数序列与目前已知序列无显著相似性,表明蜈蚣毒液成分的新颖性。
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  T12.10 双氢睾酮对成年比格犬心肌细胞中ERG钾离子通道表达及功能的影响

  王宛怡;David KIM;Sunny Z SUN;Nagappan MATHIALAGAN;盘瑶;蒋建军;尚兰琴;吴双;Bernard FERMINI;郝卫东

  2013, 27(S1): 242-242.

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  目的 探索5α-双氢睾酮(DHT)对成年比格犬心肌细胞中ether-á-go-go-related gene(ERG)钾离子通道的蛋白表达及快速延迟整流钾电流(I_Kr)电流密度的影响。方法 本研究采用RT-PCR的方法对比格犬心脏组织总RNA中转录异构体(AR)2 mRNA的表达进行检测,以犬雄激素受体基因中AR2特异性的外显子1B序列作为引物来区分两种转录异构体;用Langendorff灌流冠状动脉,以混合酶消化法获得成年比格犬的心肌细胞;以Western blot法检测心肌细胞中ERG钾离子通道的蛋白丰度;以全细胞膜片钳记录心肌细胞及稳定转染HERG基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-HERG)中的HERG及I_Kr电流密度,I_Kr定义为10 μmol·L^-1西沙必利所阻滞的敏感电流。结果 对RT-PCR分析结果测序显示,比格犬心肌组织中表达与人类AR2同源的雄激素受体转录异构体。电生理检测发现,在成年比格犬心肌细胞中,以生理浓度的DHT(10 nmol·L^-1)处理24 h能增加I_Kr的电流密度,而DHT对不表达雄激素受体的CHO-HERG细胞中的HERG电流密度没有影响。另外,DHT处理24 h也能增加比格犬心肌细胞中ERG编码的钾离子通道的蛋白丰度。结论 DHT在分离的成年比格犬心肌细胞中增加I_Kr的电流密度和ERG编码的钾离子通道的蛋白丰度。这可能为药物源性LQTS发病率的性别差异提供机制上的解释。
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  T12.11 Assessment of regional ventilation distribution：Comparison of vibration response imaging with electrical impedance tomography

  SHI Chang;Stefan BOEHME;Alexander H BENTLEY;Erik K HARTMANN;Klaus U KLEIN;Marc BODENSTEIN;Roman ULLRICH;Klaus MARKSTALLER

  2013, 27(S1): 242-243.

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  OBJECTIVE Vibration response imaging (VRI) is a new bedside technology to monitor ventilation by detecting lung sound vibrations. It is currently unknown whether VRI is able to accurately monitor the local distribution of ventilation within the lungs. We therefore compared VRI to electrical impedance tomography (EIT), an established technique used for the assessment of regional ventilation. METHODS For peer review,simultaneous EIT and VRI measurements were performed in the healthy and injured lungs (ALI; induced by saline lavage) at different PEEP levels (0, 5, 10, 15 mbar) in nine piglets. Vibration energy amplitude (VEA) by VRI, and amplitudes of relative impedance changes (rel.ΔZ) by EIT, were evaluated in seven regions of interest (ROIs). To assess the distribution of VT by VRI and EIT, absolute values were normalized to the VT obtained by simultaneous spirometry measurements. RESULTS Redistribution of ventilation by ALI and PEEP was detected by VRI and EIT. The linear correlation between pooled VT by VEA and rel.ΔZ was R=0.96. Bland-Altman analysis showed a bias of -1.07±24.71 ml and limits of agreement of -49.05 to +47.36 ml. Within the different ROIs, correlations of VT-distribution by EIT and VRI ranged between R values of0.29 and 0.96. ALI and PEEP did not alter the agreement of VT between VRI and EIT. CONCLUSION Measurements of regional ventilation distribution by VRI are similar to those obtained by EIT.
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  T13.1 Reproductive and developmental toxicology in nNonhuman primates and impact of new guidelines

  Norbert MAKORI

  2013, 27(S1): 243-243.

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  Most biopharmaceuticals are human proteins that are highly specific for their human target. The majority of these biopharmaceuticals therefore are pharmacologically active in humans, the final intended clinical species, and nonhuman primates (NHPs), a nonclinical model of research commonly used for Developmental and Reproductive Toxicology (DART) testing. For the first time, the last two years or so have seen revisions to the ICH guideline documents [ICH S5(R2) and ICH S2(R1)] to include DART in NHPs. This presentation will discuss the evolution of DART NHPs study designs, including juvenile toxicology, over the last six years, trends, and the impact the guidelines have had on the changes that have occurred.
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  T13.2 新生SD大鼠联合暴露苯并芘和多氯联苯对睾酮合成的影响及其表观遗传机制

  吴庆;朱鸿雁;梁继仁

  2013, 27(S1): 243-244.

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  目的 探讨新生SD大鼠联合暴露苯并芘(BaP)和多氯联苯PCB169对睾酮合成的近期和远期联合效应,以及表观遗传变化在其中的作用。方法 在大鼠出生后的PND1(出生后第1天为PND0),随机分成对照和处理组,每组30只。从PND 1开始连续7 d,对照和处理组分别经口给予等量的溶剂对照;或BaP 5, 10和25 mg·kg^-1 (体质量);或PCB169 0.25 mg·kg^-1,或PCB169 0.25 mg·kg^-1联合BaP 5, 10和25 mg·kg^-1。各组大鼠分别于染毒结束后24 h(PND 8)、青春期(PND35)和成年期(PND90),经麻醉后处死。用ELISA方法测定PND8,PND35和PND90血清中睾酮水平;用实时荧光定量PCR法检测睾丸组织中睾酮合成酶基因的mRNA表达;用染色质免疫沉淀法测定StAR基因启动子领域组蛋白H3K14乙酰化变化。结果 ① 新生期BaP暴露能引起血清中睾酮水平降低,在BaP高剂量组中,血清睾酮水平的抑制维持至PND90。联合暴露BaP和PCB169后,联合暴露组的血清睾酮水平比单暴露组受到更大的抑制,但交互作用未发现有统计学意义。② 新生期联合暴露BaP和PCB169可引起PND8睾酮合成限速酶基因StAR mRNA表达下降,交互作用有统计学意义。BaP和PCB169对StAR mRNA表达抑制持续至PND90。新生期联合暴露BaP和PCB169在PND8能抑制P450scc、P450c17,17β-HSD,3β-HSD mRNA表达,但交互作用未发现有统计学意义,并且交互作用未持续至PND90。③ 由于StAR mRNA表达被持续抑制,本研究进而探讨了StAR的表观遗传修饰变化。BaP以及BaP和PCB169联合暴露降低PND8时的睾丸StAR启动子组蛋白H3K14的乙酰化水平,交互作用有统计学意义。抑制作用持续维持至成年期。结论 StAR mRNA表达降低的同时伴随StAR启动子组蛋白H3K14乙酰化的降低,说明表观遗传修饰在BaP和PCB169联合暴露的雄性生殖毒性机制中发挥着重要作用。