论著
唐 轩, 吴旭敏, 陈可一, 胡 亮, 李基晟, 刘传丽, 覃金华, 张博文, 李艳华
目的 建立人胚胎干细胞（hESCs）来源巨核细胞（MKs）及其衍生微囊泡的制备体系，评价巨核细胞微囊泡（MKMPs）对血管新生的促进作用。方法 ① 干细胞来源MKs的制备：将hESCs接种于基质胶包被的培养板中，通过贴壁培养法进行诱导，添加第一阶段诱导培养基培养2 d后将细胞诱导至中胚层祖细胞，添加第二阶段诱导培养基培养3 d后将细胞诱导至生血内皮/造血祖细胞。随后将细胞消化成单细胞并接种至低吸附孔板，通过悬浮培养再诱导8 d。通过细胞形态观察、流式分析各阶段特征分子标志物〔hESCs：TRA-1-60、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4（SSEA4）；中胚层祖细胞：brachyury；生血内皮细胞/造血祖细胞：CD34、CD43；MKs：CD41a、CD42b〕，细胞免疫荧光染色β微管蛋白（β1-tubulin）、血管性血友病因子（VWF）、Friend白血病病毒整合位点1（FLI1）、CD42鉴定MKs的特征蛋白；② MKMPs收集和验证：通过差速离心法收集MKMPs，利用纳米颗粒跟踪分析实验（NTA）检测粒径，透射电镜观察形态及超微结构，蛋白免疫印迹法检测特征蛋白CD41、肿瘤易感基因101（TSG101）及CD9的表达水平；③ MKMPs生物学功能分析：将MKMPs和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分别用CD41a-PE及CD34-APC抗体标记后进行孵育，结合活细胞成像观察培养3 h后细胞吞噬MKMPs的现象；以HUVECs为实验对象分别开展管腔形成实验和细胞迁移实验，以血小板微囊泡（PMPs）作为阳性对照，评估MKMPs对内皮细胞迁移及血管新生的作用。实验分为未添加微囊泡组（0 mg·L-1，对照组）及添加不同浓度微囊泡组（1、5、10和20 mg·L-1，实验组），对细胞在基质胶内培养5 h后形成管腔的结点数量进行计数，并分析6 h细胞迁移率；ELISA检测微囊泡中血管内皮生长因子（VEGF）浓度。结果 ① 流式检测结果表明分化前细胞表达多能性标志物SSEA4及TRA-1-60，诱导至第2 d的细胞表达中胚层祖细胞标志brachyury；诱导至第5 d的细胞表达生血内皮标志CD34和早期造血细胞标志物CD43；诱导至第13 d的细胞表达MKs标志物CD41a和CD42b。分化第13 d细胞表达MKs特征蛋白CD42、β1-tubulin、VWF及FLI1；② MKMPs具有典型双层膜状结构，NTA分析表明该囊泡粒径为（164.3±14.0） nm，且表达TSG101、CD9及CD41等标志蛋白；③ 荧光标记的MKMPs与HUVECs共培养3 h后，HUVECs能够摄取MKMPs；与对照组相比，添加MKMPs能够显著提高HUVECs的管腔形成能力及迁移能力，其中MKMPs 5 mg·L-1处理促进管腔形成及细胞迁移能力最强，其促进细胞迁移及管腔形成的能力均显著高于5 mg·L-1的PMPs处理组；与PMPs相比，MKMPs中VEGF的含量显著升高。结论 hESCs来源MKs具备产生微囊泡的能力，MKMPs具有促进血管新生的作用。
