中国药理学与毒理学杂志

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    2020, 34(3): 0-0.
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    麦冬皂苷D通过上调CYP2J3/EET减轻H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤
    黄小燕1*， 张照研2，3*， 陈伯钧1， 高 月3
    2020, 34(3): 161-170. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.001
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    目的  探讨麦冬皂苷D（OP-D）对H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法  通过H2O2诱导建立H9c2细胞氧化损伤模型，细胞分为正常对照组（予以无血清培养基培养28 h）、H2O2损伤模型组（H2O2 400 μmol·L-1处理3 h）、OP-D 5，10和20 μmol·L-1预处理组（OP-D预处理24 h后+H2O2 400 μmol·L-1处理3 h）、花生四烯酸CYP环氧酶活性抑制剂6-（2-炔丙基羟苯基）己酸（PPOH）干预组（OP-D 20 μmol·L-1+PPOH 10 μmol·L-1，PPOH于OP-D处理前1 h加入细胞）。MTT法测定细胞活性，酶联免疫吸附法（ELISA）检测环氧-二十碳-三烯酸（11，12-DHET和14，15-DHET）含量，ELISA法检测细胞内丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量及乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，流式细胞术（FCM）检测活性氧（ROS）水平及细胞凋亡水平、Western印迹法检测细胞色素P450 2J3 （CYP2J3）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白和磷酸化内皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白在细胞中的表达，利用PPOH进一步验证OP-D减轻细胞氧化应激的可能内在机制。结果  H2O2 400 μmol·L-1明显抑制H9c2细胞存活率（P<0.01），OP-D可明显增加H2O2损伤后细胞存活率（P<0.01）；不同浓度OP-D增加11，12-DHET和14，15-DHET含量（P<0.05，P<0.01）；OP-D增加H2O2损伤后细胞NO含量（P<0.05，P<0.01）、增强SOD活性（P<0.05）及降低MDA、LDH含量（P<0.05，P<0.01）；OP-D显著降低H2O2损伤后细胞氧化应激及凋亡水平（P<0.05， P<0.01）；OP-D预处理上调H2O2损伤后细胞CYP2J3蛋白和mRNA表达（P<0.05，P<0.01）、激活PI3K/Akt-eNOS通路的磷酸化水平（P<0.05，P<0.01）；提前给予PPOH后，OP-D保护效应被抑制（P<0.05，P<0.01）。结论  OP-D能减轻H2O2所致的H9c2细胞损伤，可能是通过诱导CYP2J3表达及增加11，12-DHET 和14， 15-DHET含量，激活PI3K通路促进其下游因子Akt和eNOS磷酸化发挥作用。
  • 论著
    基于构效关系模型和体外实验的acetylnerolin遗传毒性评价
    吴殷囡， 唐 婉， 尹 菁， 刘 洋， 汪玉馨， 陆益红
    2020, 34(3): 171-178. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.002
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    目的  评价萘普生的杂质acetylnerolin（Ace）的遗传毒性。 方法  采用基于定量构效关系的方法ADMET、Derek和Sarah，预测Ace的遗传毒性，利用体外染色体畸变和细菌反向突变（Ames）实验验证上述结果。在染色体畸变实验中，中国仓鼠肺（CHL）细胞与Ace 10，20，40 mg·L-1在有/无代谢活化系统混合液（S9 mix）的条件下，分别以甲基磺酸甲酯（MMS）20 mL·L-1及环磷酰胺（CP）12 mg·L-1作为阳性对照，孵育4 h后，对每个畸变中期（包括断裂、交换、环状、分裂和多倍体）的染色体数目计数并记录，当畸变率<5%为阴性，>10%为阳性。在Ames实验中，用5种鼠伤寒沙门氏菌（TA97，TA98，TA100，TA102和TA1535）对Ace进行致突变评价。这5种菌种分别与Ace 5，25，125和625 μg（每个平板）在有无S9 mix条件下孵育48~72 h。在不添加S9 mix的条件下，敌克松50 μg（每个平板）作为TA97和TA98组的阳性对照； MMS 2.0 μL（每个平板）作为TA100和TA102组的阳性对照；叠氮化钠1.5 μg（每个平板）作为TA1535的阳性对照；在添加S9 mix的条件下，2-氨基芴100 μg（每个平板）作为TA97，TA98和TA100的阳性对照；1，8-二羟基蒽醌100 μg（每个平板）和CP 50 μg（每个平板）分别作为TA102和TA1535的阳性对照，当菌落数≥2×阴性对照时，则认为该化合物具有致突变性，反之则为阴性。结果  Derek和Sarah软件预测NPX杂质不具有遗传毒性，但ADMET数据显示Ace可诱发染色体畸变。在染色体畸变实验中，Ace 40 mg·L-1致畸变率>5%，<10%；Ace <20 mg·L-1时致畸变率<5%，提示Ace可能诱发染色体畸变，这与ADMET结果一致；Ames试验结果表明，与阴性对照组相比，5种菌种每个平板给药Ace 5~625 μg后，各组的细菌数量没有显著增加，提示Ace无致突变性，这与ADMET结果相反。结论  Ace有潜在的致染色体畸变性，对于长期服用萘普生的患者，为保障用药安全，建议将Ace的含量从普通杂质的0.15%降至0.015%。
  • 论著
    胆碱能M受体调控细胞周期蛋白依赖性激酶5及其在敌敌畏诱导SH-SY5Y细胞毒性损伤中的作用
    杨 培， 周 琥， 王丽韫， 王永安
    2020, 34(3): 179-187. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.003
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    目的  研究胆碱能M受体（主要为M1受体）参与SH-SY5Y细胞周期依赖性蛋白激酶5（Cdk5）调控及其在敌敌畏（DDVP）诱导SH-SY5Y细胞毒性损伤中的作用。方法  ① 应用免疫荧光结合共聚焦显微镜检测胆碱能M1受体及Cdk5在SH-SY5Y细胞中的分布和表达。② 细胞对照组、氧化震颤素（Oxo-M）组（1×10-4 mol·L-1作用48 h）、罗考唯亭（Rosc）组（培养结束前1 h加入Rosc 1×10-4 mol·L-1）、Rosc+Oxo-M组（Rosc 1×10-4 mol·L-1预处理1 h后，再加入Oxo-M 1×10-4 mol·L-1 作用至48 h），应用MTT比色法检测细胞存活率，Western印迹法检测Cdk5表达。③ 细胞对照组、DDVP组（1×10-5 mol·L-1作用48 h）、Rosc组（培养结束前1 h加入1×10-4 mol·L-1）、Rosc+DDVP组（Rosc 1×10-4 mol·L-1预处理1 h后，再加入DDVP 1×10-5 mol·L-1 作用至48 h），用MTT比色法检测细胞存活率，Western印迹法检测Cdk5表达，流式细胞术膜联蛋白Ⅴ-碘化丙啶双染法检测细胞凋亡率，TUNEL法检测细胞凋亡。结果  ① 激光共聚焦显微镜结果表明，SH-SY5Y细胞中M1受体与Cdk5均有分布和表达。② Oxo-M 1×10-4 mol·L-1处理SH-SYSY细胞48 h，细胞存活率为（59.1±7.3）%，与细胞对照组相比显著降低（P<0.05），Cdk5表达显著升高（P<0.05）；Rosc 1×10-4 mol·L-1处理SH-SYSY细胞1 h，Cdk5表达显著降低（P<0.05）；Rosc+Oxo-M组细胞存活率为（84.5±20.9）%，与Oxo-M组相比明显升高（P<0.05），Cdk5表达明显降低（P<0.05）。③ DDVP 1×10-5 mol·L-1处理SH-SYSY细胞48 h，细胞存活率为（68.6±4.1）%，与细胞对照组相比显著降低（P<0.05），Cdk5表达显著升高（P<0.05）；Rosc+DDVP细胞存活率为（84.4±8.8）%，与DDVP组相比显著升高，Cdk5表达显著降低（P<0.05）。流式细胞术结合TUNEL染色结果显示，DDVP处理SH-SYSY细胞48 h，细胞凋亡率为（64.1±8.4）%，与细胞对照组相比明显升高（P<0.05），TUNEL阳性细胞增多；而Rosc+DDVP组细胞凋亡率为（34.4±9.5）%，与DDVP组相比明显降低 （P<0.05），TUNEL阳性细胞减少。结论  Oxo-M和DDVP可通过增强Cdk5活性引起SH-SY5Y细胞损伤，提示抑制Cdk5活性可显著降低由Oxo-M和DDVP引发的细胞毒作用。
  • 论著
    匹诺塞林对高血糖诱导的大鼠卒中后出血转化的作用
    孔令雷， 陈燕霞， 刘楠楠， 马国栋， 杨海光， 石瑞丽， 杜冠华
    2020, 34(3): 188-195. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.004
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    目的  研究匹诺塞林（pinocembrin）对高血糖诱导的大鼠卒中后出血转化的作用。方法  实验分为假手术组、大脑中动脉堵塞（MCAO）模型组、高糖+MCAO模型组、高糖+匹诺塞林+MCAO组。MCAO模型采用线栓法造模，缺血1.5 h；高糖+MCAO模型组于造模前30 min腹腔注射50%葡萄糖；高糖+匹诺塞林+MCAO组于再灌前5 min尾静脉注射匹诺塞林10 mg·kg-1。葡萄糖注射前、后30 min及MCAO术后1，2和3 h用血糖仪检测血糖。缺血24 h后，采用改良的大鼠神经功能缺损评分法进行神经学评分，TTC染色测定脑梗死体积，血红蛋白检测试剂盒检测脑组织中血红蛋白含量，伊文斯蓝渗漏实验观察对血脑屏障的影响，通过脑病理切片观察脑组织出血情况。全部实验结束后统计脑组织出血发生率和大鼠死亡率。结果  MCAO模型组各时间点血糖水平与假手术组比较均无明显变化；高糖+MCAO模型组，提前30 min腹腔注射50%葡萄糖能使血糖水平从注射前4.0升至20.9 mmol·L-1，且各时间点血糖水平均显著高于MCAO模型组（P<0.01）；匹诺塞林对高糖+MCAO模型大鼠血糖水平无影响。MCAO模型组和高糖+MCAO模型组的神经学评分（分别为9.4±1.5和10.0±0.6）无显著性差异；匹诺塞林使高糖+MCAO模型大鼠神经学评分降至7.4±1.1（P<0.01）。MCAO模型组脑梗体积为（23.3±11.3）%，高糖+MCAO模型组脑梗体积增加至（36.9±8.2）%（P<0.05），匹诺塞林使脑梗体积降至（26.9±5.8）%（P<0.05）。与MCAO模型组相比，高糖+MCAO模型组大鼠脑组织中血红蛋白含量和伊文斯蓝含量分别由（195.5±30.1） mg·L-1和（74.6±46.8） μg·g-1组织增加至（472.0±166.9） mg·L-1（P<0.01）和（132.9±49.6） μg·g-1组织（P<0.05）；匹诺塞林可显著减轻高糖+MCAO模型大鼠出血损伤，使血红蛋白含量和伊文斯蓝含量降至（299.8±47.7） mg·L-1（P<0.01）和（70.4±39.2） μg·g-1组织（P<0.05）。MCAO模型组脑出血发生率和死亡率分别为18.2%和16.7%，高糖+MCAO模型组显著增加，分别为95.4%和57.3%；给予匹诺塞林后分别降至59.1%和18.9%。结论  匹诺塞林能减轻高血糖诱导的出血转化，降低出血的发生率和死亡率，是一种具有潜力的抗出血转化药物。
  • 论著
    麦角甾醇与吉非替尼联合用药协同抑制非小细胞肺癌A549和PC-9细胞增殖
    米完完， 黄 挺， 张梦迪， 黄绳武
    2020, 34(3): 196-206. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.005
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    目的  研究麦角甾醇（ERG）与吉非替尼（GEF）联合用药协同对非小细胞肺癌A549（GEF耐药细胞）和PC-9（GEF敏感细胞）细胞的抑制作用。方法  将人肺癌细胞A549和PC-9细胞分别分为对照组、ERG 5～160 μmol·L-1单药组、GEF 5～160 μmol·L-1（A549）或0.625～20 μmol·L-1 （PC-9）单药组及不同浓度ERG+GEF联合用药组，MTT法测定细胞增殖；Hoechst 33258观察细胞核形态变化；流式细胞术测定细胞凋亡率及细胞周期；Western印迹法检测蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt），磷酸化AKT（p-Akt），表皮生长因子受体（EGFR），磷酸化EGFR（p-EGFR）蛋白的表达。结果  在不同作用时间点，与ERG和GEF单药组相比，相应浓度两药联用组对A549和PC-9细胞的增殖抑制率提高（P<0.01），表现出明显的协同效应（q>1.15）；Hoechst 33258凋亡染色结果显示，与单药组相比，联用组A549细胞和PC-9细胞各给药组细胞出现明显核分叶、碎裂、凋亡样小体和核大小不一等典型凋亡样特征。与相应浓度GEF和ERG单药组相比，ERG+GEF联用（10+10） μmol·L-1和（40+40） μmol·L-1组A549细胞凋亡率升高（P<0.01），ERG+GEF （40+5） μmol·L-1和（80+10） μmol·L-1组PC-9细胞凋亡率显著升高（P<0.01）；两药联用组（20+20） μmol·L-1 A549细胞的p-EGFR/EGFR蛋白比值显著降低（P<0.01），两药联用组（40+5） μmol·L-1 PC-9细胞的p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白比值显著下调（P<0.05，P<0.01）；细胞周期结果显示，对于A549细胞，两药联用改变了G0/G1，G2/M和S期细胞比例，主要将细胞阻滞在G0/G1期。对于PC-9细胞，两药联用未改变G0/G1，G2/M和S期细胞比例。结论  ERG与GEF联用具有协同抑制A549和PC-9细胞增殖的作用，诱导细胞凋亡，其作用机制可能是抑制EGFR信号通路相关蛋白。
  • 论著
    双硫仑对人脂肪肉瘤细胞系SW872细胞的抑制作用及其机制
    韩 冰， 苗成利， 张 林， 高川成， 肖凤君， 王立生
    2020, 34(3): 207-214. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.006
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    目的  观察双硫仑（DSF）对人脂肪肉瘤细胞SW872的抑制作用，并探讨其相关分子机制。方法  体外培养SW872细胞，设立正常细胞对照组及DSF 1，2.5，5和10 μmol·L-1组，采用CCK-8法检测药物处理24 h后对细胞增殖的抑制作用；光镜下观察DSF处理后SW872细胞形态变化；流式细胞术检测细胞凋亡；克隆形成实验检测DSF对SW872细胞克隆形成能力的影响；Western印迹法检测A20的表达； CCK-8法检测铁离子螯合剂Fer-1及炎症小体NLRP3抑制剂MCC950能否逆转DSF对SW872细胞的抑制作用；RT-PCR法检测DSF对SW872细胞中A20和醛脱氢酶（ALDH1）的mRNA水平。结果  DSF对SW872细胞增殖有显著抑制作用（P<0.01）；DSF处理后使SW872细胞发生皱缩变圆且细胞间隙增大；DSF作用于SW872细胞24 h后，与正常细胞对照组相比，DSF 1 μmol·L-1组细胞早期凋亡率明显增加〔（32.6±1.82）% vs （3.50±0.64）%，P<0.05〕；DSF 0.1 μmol·L-1组明显抑制SW872细胞的克隆形成〔（16.7±7.02）% vs （129±5.29）%，P<0.05〕；DSF 处理能够明显提高SW872细胞中炎症调节分子A20的表达；铁离子鳌合剂Fer-1不能逆转DSF导致的细胞生长抑制，而炎症小体抑制剂MCC950可以部分逆转DSF对SW872细胞增殖的抑制作用。结论  DSF能抑制SW872细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能通过细胞炎症小体介导，细胞炎症调节分子A20参与DSF对SW872细胞的抑制作用。
  • 论著
    稳定表达敲入增强绿色荧光蛋白标记的干扰素γ受体2基因Ifngr2的黑素瘤细胞系的构建与鉴定
    樊 浩， 周 涛， 李卫华
    2020, 34(3): 215-223. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.007
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    目的  构建稳定表达敲入增强绿色荧光蛋白（EGFP）标记的干扰素γ（IFN-γ）受体2基因Ifngr2的黑素瘤B16细胞系，进行IFNGR2表达和功能调控研究。方法  首先应用http：//chopchop.cbu.uib.no/网站设计引导RNA，使用分子克隆的方法构建基于CRISPR-Cas9和CRIS-PITCh（v2）的表达载体，并将2种载体使用LTX共同转染入B16细胞系，筛选单克隆。然后，应用基因组PCR、流式分析以及荧光显微镜技术，对基因敲入位置和基因表达进行分析鉴定。对阳性克隆E10和B4进行IFN-γ 20 mg·L-1刺激48 h，分析IFN-γ下游靶基因的表达以检测阳性细胞系对IFN-γ的反应性。最后应用流式分析和实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测肿瘤坏死因子α（TNF-α） 20 mg·L-1和奥沙利铂2 mmol·L-1处理3和48 h后，E10和B4细胞系Ifngr2和EGFP的表达。结果  基因组PCR及测序分析显示，PCR产物与预期一致，EGFP插入基因组正确位置。流式细胞分析及荧光显微镜观察分析，可看到绿色荧光峰值右移及绿色荧光，说明该细胞系正常表达EGFP。RT-PCR分析显示，IFN-γ刺激后，Cd274（PDL1）在阳性克隆E10和B4细胞中显著上调63和138倍，Psmb9显著上调2885和4616倍，上调幅度与B16母细胞相当，说明E10和B4细胞系具有正常的IFN-γ 信号通路。流式细胞分析显示，TNF-α处理后，E10和B4细胞平均荧光强度由3845和4456上升到5720和5972；奥沙利铂处理后，E10和B4细胞平均荧光强度由3032和2786上升到4285和4179。
    RT-PCR分析显示，TNF-α刺激后，Ifngr2在B16，E10和B4细胞中分别上升11.40，9.31和21.39倍，EGFP在E10和B4细胞中分别上升2.50和5.37倍；奥沙利铂刺激后，Ifngr2在B16，E10和B4细胞中分别上升10.99，3.54和5.39倍，EGFP在E10和B4细胞中分别上升2.70和2.44倍。IFN-γ处理不能上调Ifngr2和EGFP的表达，因此绿色荧光强度反映了Ifngr2的表达。结论  成功构建稳定敲入EGFP标记的Ifngr2基因的黑素瘤细胞系，发现TNF-α和奥沙利铂可上调Ifngr2和EGFP的表达，表明该细胞系可用于IFNGR2表达和功能研究。
  • 论著
    溶瘤腺病毒修饰间充质干细胞裂解上清对小鼠乳腺癌细胞4T1生物学特性的影响
    刘 超， 孟虹芳， 戴诗云， 荆 杰
    2020, 34(3): 224-231. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.008
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    目的  评价溶瘤腺病毒（rAd）修饰间充质干细胞（MSC）裂解上清对小鼠乳腺癌4T1细胞生物学特性的影响。方法  采用携带核心蛋白聚糖（DCN）基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN和对照病毒rAd.Null感染MSC，命名为MSC.DCN和MSC.Null。感染后48 h，收集MSC.DCN，MSC.Null和MSC的裂解上清，将其与小鼠乳腺癌细胞4T1共培养，同时设4T1细胞对照组，用实时定量PCR法和Western印迹法检测小鼠乳腺癌4T1细胞DCN mRNA和蛋白表达；通过Dye670标记，用流式细胞术检测4T1细胞增殖；用FITC-Annexin Ⅴ/PI凋亡试剂盒检测4T1细胞凋亡；通过细胞划痕实验检测4T1细胞的迁移能力。结果  MSC.DCN裂解上清处理后，4T1细胞DCN mRNA和蛋白表达均高于其余2组（P<0.01）。共培养3 d后，与细胞对照组相比，MSC组4T1细胞增殖指数下降（P<0.01）；共培养3和5 d后，与MSC组相比，MSC.Null组和MSC.DCN组4T1细胞增殖指数下降（P<0.05），凋亡比例上升（P<0.05）；MSC.Null与MSC.DCN组间差异无统计学意义。MSC，MSC.Null和MSC.DCN裂解上清与4T1细胞共培养12 h后，与细胞对照组相比，MSC组迁移率升高（P<0.01）；与MSC组和MSC.Null组相比，MSC.DCN组迁移率下降（P<0.05）。结论  MSC.DCN裂解上清可抑制小鼠乳腺癌细胞4T1细胞增殖和MSC裂解上清所诱导的4T1细胞迁移，同时促进4T1细胞凋亡。
    • 综述
  • 综述
    酸性鞘磷脂酶活性调控及相关药物研究进展
    刘思思， 杨嘉辉， 王 安
    2020, 34(3): 232-240. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.009
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    酸性鞘磷脂酶（ASM）是鞘磷脂代谢的关键酶，调节细胞增殖、分化、衰老和凋亡等。ASM过少或缺陷易引起尼曼-匹克病，过多会导致神经性病变、抑郁症、脓毒症和糖尿病等。研究发现，ASM的激活受环境因素、药物因素和其他因素的影响，细菌、病毒、电离辐射、重金属、心理压力、乙醇和细胞因子等可激活ASM，诱发上述疾病发生。应用ASM直接抑制或功能性抑制药物可减轻相关疾病带来的损伤。ASM活性增强，可促使肿瘤细胞凋亡，具有抗肿瘤作用，有望成为新的抗肿瘤药物靶标及肿瘤预测因子。本文就ASM活性调控及相关药物研究进展进行简要综述。