中国药理学与毒理学杂志

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    2018, 32(2): 0-0.
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    体外评价药物性肝损伤检测终点研究及其在检测系统中的应用
    葛帅，汤纳平，马璟
    2018, 32(2): 81-88. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.001
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    药物性肝损伤（DILI）是临床上导致急性肝衰竭的重要原因。众多新建细胞模型和高通量筛选技术正在被广泛应用于肝毒性筛选评价。在应用这些新技术和新方法之前，重要的是确定哪些毒性终点应被纳入评价体系，以提高对DILI 的预测能力。本文结合DILI 相关的重要作用机制，介绍了体外肝毒性评价应考虑的检测终点，包括肝细胞毒性、线粒体毒性、胆汁淤积、反应性代谢物导致的肝损伤以及免疫反应相关的肝损伤等，并归纳了这些毒性终点在DILI 检测系统中的应用及在应用过程中面临的挑战，以期为新药开发早期的体外肝毒性筛选评价提供参考。
    • 论著
  • 论著
    依帕司他通过抑制醛糖还原酶表达抑制血小板衍生生长因子诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖
    张倩，俞婷婷，蒋莉莉，左东泽，李先伟，洪宗元
    2018, 32(2): 89-98. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.002
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    目的  观察依帕司他（EPS）对血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖的影响，并探讨与醛糖还原酶（AR）表达的关系。方法  组织块贴壁法制备PASMC，PDGF 30 mg•L-1诱导细胞增殖，用Lipofectamin 3000将AR 小干扰RNA（ARsiRNA）干扰片段转入PASMC 细胞，24 h 后，检测AR 的mRNA 和蛋白水平。另取细胞分为6 组，分别为正常对照组，PDGF 30 mg•L-1组，PDGF+EPS 1，10 和100 μmol•L-1组，EPS 100 μmol•L-1组，定量PCR 法和Western蛋白印迹法检测增殖细胞核抗原（PCNA）、胶原蛋白Ⅰ和AR 的mRNA 和蛋白表达水平。BrdU法和流式细胞术检测细胞增殖，检测PCNA、胶原蛋白Ⅰ和AR的表达。结果  与正常对照相比，PDGF 30 μg•L-1处理48 h 后，PASMC增殖显著增加（P<0.01），PCNA 和胶原蛋白Ⅰ的表达明显升高（P<0.01）；与PDGF 组相比，ARsiRNA 干扰组细胞增殖显著减少（P<0.01），PCNA 和胶原蛋白Ⅰ的表达明显降低（P<0.01）；与PDGF组相比，EPS 1，10 和100 μmol•L-1组增殖显著减少（P<0.05，P<0.01），PCNA和胶原蛋白Ⅰ的表达也明显降低（P<0.05，P<0.01）。提示PDGF 诱导细胞增殖与其上调AR 的表达有关，提示EPS抑制细胞增殖与其下调AR的表达有关。结论  EPS对PDGF诱导的PASMC增殖具有一定的抑制作用，其机制可能与其抑制PDGF诱导AR的表达有关。
  • 论著
    丹参总酚酸诱导PC12细胞分化机制
    沈杨，张琦，赵佳奇，田雅娟，李钦青，楚世峰，贺文彬
    2018, 32(2): 99-104. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.003
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    目的  观察丹参总酚酸（Tsa）诱导PC12 细胞分化的作用机制。方法  甲基噻唑基四唑（MTT）法检测Tsa 0.01，0.1 和1.0 μg•L-1对PC12 细胞存活的影响以及对氧糖剥夺（OGD）损伤后细胞的修复作用；计数PC12细胞突起数量；Western蛋白印迹法检测微管相关蛋白质2（MAP-2），细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2），磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2），丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2（MEK1/2）及p-MEK1/2 的表达，并观察MEK 抑制剂U0126 对Tsa 1.0 μg•L-1作用PC12 细胞后p-ERK1/ 2与ERK1/ 2蛋白表达的影响。结果  MTT检测结果显示，与细胞对照组相比，Tsa 0.01和0.1 μg•L-1对PC12细胞存活率无显著影响，Tsa 1.0 μg•L-1能促进PC12 细胞增殖，存活率升高90%（P<0.01）；与OGD 损伤细胞组相比，OGD+Tsa 0.1，1.0 μg•L-1细胞存活率分别上升至（47.7±1.8）%和（63.2±13.0）%（P<0.05，P<0.01）。PC12细胞突起数量结果显示，与细胞对照组相比，Tsa 0.01，0.1 和1.0 μg•L-1均能促进细胞突起生长（P<0.01）；Western蛋白印迹检测结果显示，Tsa可促进MAP-2，p-ERK1/2 和p-MEK1/2 蛋白的表达（P<0.05，P<0.01），并且这种作用可被U0126抑制剂阻断（P<0.01）。结论  Tsa能促进PC12细胞的增殖及分化，其机制可能与激活p-MEK及p-ERK1/2来促进PC12 细胞分化有关。
  • 论著
    柴胡皂苷及其代谢产物潜在靶点蛋白预测和部分验证
    钟倩雯，朱安，王旗
    2018, 32(2): 105-111. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.004
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    目的  以柴胡的主要药效/毒性成分柴胡皂苷（SS）及代谢产物（共30 种化合物）为研究对象，预测并验证部分靶点蛋白。方法  ① 通过PharmMapper 反向分子对接法和Sybyl X 正向分子对接预测SS 及其代谢产物的潜在靶点蛋白，并预测了柴胡皂苷a（SSa）与潜在靶点蛋白谷胱甘肽S 转移酶A2（GST A2）间的结合模式。② 体外实验：用SSa 0，0.03，0.06，0.13，0.25 和0.50 mmol•L-1处理HepaRG细胞24 h，采用CCK-8法检测细胞存活率；HepaRG细胞用SSa 0，0.03，0.13和0.50 mmol•L-1处理24 h，GST 活性检测试剂盒检测细胞GST 酶活性。结果  ① PharmMapper 和Sybyl X 预测SS 及代谢产物的潜在靶点蛋白包括：GST A2、磷脂酰胆碱转移蛋白、腺苷激酶、胸苷酸合成酶、雌激素受体、雌二醇17-β-脱氢酶1、原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pim1、胆汁酸受体和维A酸结合蛋白2。预测结果显示，SSa与GST A2之间对接得分最高，二者匹配良好，很可能存在相互作用。② 体外实验：SSa 能抑制HepaRG 细胞存活，呈一定的量效关系（R2=0.8848，P<0.05）；随着SSa浓度升高，细胞内GST活性升高（P<0.01）。结论  SS及其代谢产物的潜在靶点蛋白为GST和磷脂酰胆碱转移蛋白等，GST可能是SSa的靶点蛋白之一。
  • 论著
    依托泊苷的高载药量纳米化制备及其体外血脑屏障穿透性
    孟凡荣，王甲朋，范丽雪，刘梅梅，李万华，刘大伟，隋昕，骆媛，杨军，王永安
    2018, 32(2): 112-118. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.005
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    目的  为改善依托泊苷（VP-16）水溶性差和活性较低的问题，将VP-16制备成纳米颗粒（NP）悬浊液（VP-16 NP），以提高其对肿瘤细胞的杀伤作用，并通过体外血脑屏障（BBB）模型评价其穿透性。方法  利用反溶液交换法将VP-16 制备为VP-16 NP，扫描电镜（SEM）观察形态，透射电镜（TEM）观察内部结构，动态光散射（DLS）测定粒径大小。通过测定VP-16 粉末和VP-16 NP 的药物释放曲线比较两者的释放率。采用MTT 比色法检测VP-16 NP 对KB 细胞存活的影响。采用2周龄SD大鼠的第1～2 代原代脑微血管内皮细胞构建体外BBB模型。依据经典的4 h 渗漏实验、跨内皮电阻（TEER）实验和荧光素钠（FLU）穿透性实验，验证体外BBB模型，评价VP-16 NP的BBB穿透性。结果  TEM，SEM 和DLS观察可见，制备的VP-16 NP为实心结构的球形，粒径约为140 nm。药物释放曲线结果显示，VP-16 NP的药物累积释放率是VP-16粉末的3 倍。MTT比色法检测结果表明，VP-16粉末对KB细胞存活无抑制作用，而VP-16 NP能有效地抑制KB细胞存活。4 h渗漏实验中，Transwell细胞模型上室与下室能维持>0.5 cm的液面差，说明体外BBB模型初步形成。TEER实验有效电阻值为223 Ω•cm2，表明体外BBB 模型基本建成。FLU 穿透性实验结果显示，在15，30 和60 min 时，穿透系数分别为（0.33±0.04）×10-3，（0.42±0.07）×10-3和（0.52±0.06）×10-3 cm•min-1，说明模型的通透性低。体外BBB模型VP-16 NP穿透性结果显示，其在30 min的穿透系数为（1.87±0.03）×10-3 cm•min-1，显示出较高的穿透性，表明VP-16 NP 对BBB 有较好的穿透效果。结论  VP-16 NP可提高药物的释放率，并有较好的BBB 穿透性。
  • 论著
    ZnO纳米颗粒水凝胶高分子材料的合成及梭曼体内外染毒洗消性能的评价
    王甲朋，孟凡荣，范丽雪，李万华，隋昕，骆媛，田萌，全东琴，王永安，张有志，杨军
    2018, 32(2): 119-124. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.006
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    目的  评价氧化锌纳米颗粒（ZnO NP）水凝胶（ZnO NP-gel）高分子材料对梭曼染毒的洗消的效果。方法  化学沉淀法制备ZnO NP 后，制备ZnO NP-戊烯酸，最后制备ZnO NP-gel。扫描电子显微镜（SEM）下观察形貌表征，透射电子显微镜（TEM）观察内部结构表征，粒度分布仪测定zeta 电位，红外光谱（IR）分析其化学键结构，采用X 射线衍射（XRD）分析其衍射图谱。通过梭曼的联苯胺显色反应测定体外梭曼的残余量。10 mL梭曼52.2 mg•L-1分别与ZnO NP 1 g•L-1和ZnO NP-gel 1 g•L-1混匀（V∶V=3∶1）静置30 min，过滤，小鼠sc 给予滤出液40 μL•g-1，观察小鼠的中毒症状及死亡情况。结果  SEM 和TEM下见ZnO NP-gel均为块状结构；ZnO NP-gel zeta 电位为（-7.89±0.04）mV；IR 分析显示，ZnO NP-gel的波数在754 和618 cm-1处出现较强吸收峰；XRD图谱显示，合成的ZnO NP-gel在2θ=8.06738°可见明显尖峰。在相同浓度的ZnO NP-gel 和ZnO NP，ZnO NP-gel体外洗消效率均显著高于ZnO NP组（n=3，P<0.05）；洗消50%梭曼的时间缩短了4 倍。皮下注射梭曼经ZnO NP-gel洗消后的过滤液的小鼠均未出现惊厥和死亡。结论  ZnO NP-gel对梭曼具有快速的吸附和催化双重功能的复合洗消效果，高分子修饰后能提高ZnONP的洗消能力。
  • 论著
    piggyBac转座子介导HepG2细胞不同亚型药物代谢酶稳定共表达方法比较
    庞士慧，钟国瑞，谢水林，李浩健，邹淑香，贾英，戴仁科，黄黎珍
    2018, 32(2): 125-134. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.007
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    目的  在piggyBac（PB）转座子介导下，探索在HepG2 细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略，为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础。方法  首先选择3 种目前针对大片段DNA 使用较广的转染方法：Lipofectamine® LTX，GenJetTM（Ver.Ⅱ）和Neon® Transfection System，分别转染N 端标记增强型绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-N2）和2A 串联重组细胞色素3A4（CYP3A4）和CYP2C19 的PB 转座子质粒（pPB-CYP3A4-2A-2C19）至HepG2细胞，48 h后比较不同方法的转染效率和细胞毒性，确立高效低毒的HepG2细胞转染方法。然后选择该法进行转染，将设计的3 组PB重组转座子：单基因转座子（PB-CYP3A4）、2A串联多基因转座子（PB-CYP3A4-2A-2C19）、多个单基因转座子混合物〔PB-CYP3A4，PBCYP2C8，PB-CYP2A6，有机阴离子转运多肽1B1 的PB 转座子（PB-OATP1B1）〕分别转染HepG2 细胞，利用嘌呤霉素和GFP 进行单克隆细胞筛选：挑选具有抗性且表达GFP的细胞单克隆并进行扩大培养，采用实时荧光定量PCR、Western 蛋白质印迹和高效液相色谱-串联质谱联用法分别检测各组药物代谢酶mRNA、蛋白质水平及酶活性，并进行统计分析。结果  3种转染方法比较发现，GenJetTM法的转染效率显著高于其他2种（P<0.01），介导pEGFP-N2 和pPB-CYP3A4-2A-2C19 的转染效率分别高达（94.2±2.5）%和（89.3±3.3）%，且该法具有较低的细胞毒性。因此选择GenJetTM法进行后续PB转座子转染。分别转染3组PB重组转座子发现，单个转座子PB-CYP3A4 和PB-CYP3A4-2A-2C19 转染后，筛选获得的抗性细胞克隆中各个药物代谢酶在mRNA、蛋白质及活性水平均显著提高，其中2A 可实现CYP3A4 和CYP2C19药物代谢酶协同稳定表达；而多个转座子混合共转染细胞中，仅有随机几个基因表达；且各药物代谢酶基因的表达不均衡，仅CYP3A4 药物代谢酶基因在单克隆细胞中表达水平明显升高。结论  GenJetTM法可成为PB重组转座子转染HepG2细胞的有效方法。PB转座子可介导基因稳定表达；但在实现多基因共表达时，与病毒载体法不同，理论上可行的PB多转座子共转染方法其基因表达效率下降，且各基因表达不均衡。相比之下，应用2A串联多个基因串联重组PB 单转座子可实现各基因稳定表达。
    • 综述
  • 综述
    糖皮质激素受体基因甲基化在抑郁症中的作用研究进展
    付治凤，马浩，陈春林
    2018, 32(2): 136-140. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.008
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    下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能亢进和糖皮质激素（GC）水平升高是抑郁症典型的病理生理改变之一，其中糖皮质激素受体（GR）在这一过程中起到关键调节作用。近年研究发现，环境因素可通过影响GR 表观遗传学调控并参与抑郁症的病理生理学机制。GR 基因甲基化作为一种表观遗传调控方式影响GR 表达和HPA 轴功能，从而在抑郁症的发生发展中扮演重要的角色。本文综述了GR 基因甲基化与抑郁症的相关研究进展，以期为抑郁症的诊断和治疗提供新思路。
  • 综述
    PARP-1在肺部炎症性疾病中的作用研究进展
    罗超，喻鹏久
    2018, 32(2): 141-149. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.009
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    聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）是一种广泛存在于真核细胞中具有显著生物活性的核酶，其活化参与了肺部炎症性疾病的信号转导过程。本文从PARP-1 的结构与功能、参与炎症信号调节、调控肺部炎症疾病及抑制剂研究进展等方面对PARP-1 与肺部炎症疾病的调控及其治疗前景进行综述。旨在进一步阐明肺部炎症性疾病的发病机制，并为该类疾病的预防与治疗提供参考。
  • 综述
    细胞色素P450酶表观遗传学改变与间接致癌物致癌作用研究进展
    刘娇凤，胡建安
    2018, 32(2): 150-160. https://doi.org/10.3867/j.issn.1000-3002.2018.02.010
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    细胞色素P450（CYP450）酶系是最受关注的人体内介导间接毒物活化及毒作用发挥的酶系，主要亚型包括CYP1A，CYP1B，CYP2A，CYP2B，CYP2C，CYP2E，CYP2W 和CYP3A 等，其活性受到表观遗传学调控。苯并（a）芘、2，3，7，8-四氯二苯并对二噁英、己烯雌酚、黄曲霉毒素B1和环磷酰胺等间接致癌物，可通过引起DNA 甲基化特异性改变，组蛋白乙酰化、甲基化或泛素化等修饰以及微RNA 表达上调或下调等表观遗传学改变，影响CYP450 主要亚型的功能及其对间接致癌物活化的作用。