论著
刘 峰, 肖智勇, 程军平, 蒋 宁, 周文霞, 张永祥
目的 构建多腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP-1）短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体质粒，获取稳定敲降PARP-1蛋白的人永生化表皮角化形成细胞HaCaT（PARP-1 KD HaCaT细胞）。 方法 针对PARP-1 mRNA设计干扰序列shRNA，用限制性内切酶技术将干扰序列shRNA插入慢病毒载体质粒pLVX-shRNA2-puro，构建含PARP-1 shRNA的慢病毒载体质粒（pLVX-shRNA2-puro-PARP-1），酶切和核酸测序鉴定该质粒是否构建成功。采用脂质体转染法将该质粒载体转染至HEK293T细胞包装慢病毒。将带有PARP-1 shRNA的慢病毒颗粒〔感染复数为100〕感染HaCaT细胞，经嘌呤霉素3 mg·L-1筛选15 d，用Western印迹法和实时定量PCR（RT-qPCR）检测PARP-1蛋白和mRNA表达水平，验证PARP-1 KD HaCaT细胞PAPR-1敲降效果。用相同方式构建阴性对照细胞（NC HaCaT细胞）。随后分别将NC HaCaT和PARP-1 KD HaCaT细胞分为细胞对照组、DNA损伤剂硫芥（SM）100和1000 μmol·L-1组，孵育6和24 h后制备细胞裂解液，用Luminex法测定磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）表达水平。结果 DNA测序和酶切结果表明，所构建的慢病毒载体质粒中含有PARP-1 shRNA序列，表明含PARP-1 shRNA的慢病毒载体质粒构建成功。RT-qPCR结果显示，PARP-1 KD HaCaT细胞中PARP-1 mRNA水平降低为NC HaCaT细胞的约14%；Western印迹法结果显示，PARP-1 KD HaCaT 细胞中PARP-1蛋白表达水平降低为 NC HaCaT细胞的约10%。DNA损伤剂SM 1000 μmol·L-1作用24 h后，与 NC HaCaT细胞相比，PARP-1 KD HaCaT细胞γ-H2AX表达水平明显增加（P<0.01）。结论 成功构建含PARP-1 shRNA的慢病毒载体质粒，并获得稳定敲降PARP-1的HaCaT细胞。
