论著
丁 旭， 肖云萍， 郭佳琦， 解宇浩， 张嘉琪， 聂文营， 郝 峰
目的 构建基于钙激活氯离子通道蛋白1（ANO1）的Piezo1调节剂高通量筛选模型。方法 RT-PCR和Western 印迹法分别检测Fischer大鼠甲状腺上皮（FRT）细胞Piezo1 mRNA和蛋白表达。构建共表达增强型绿色荧光蛋白标记的ANO1（ANO1-EGFP）和黄色荧光蛋白双突变体（YFP-H148Q/I152L）的FRT细胞株（简称FRT模型细胞），倒置荧光显微镜检测ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L在FRT模型细胞中的表达，加入ANO1激活剂离子霉素10 μmol·L-1，应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值。加入Piezo1调节剂Jedi1（200 μmol·L-1），Jedi2（150 μmol·L-1），Yoda1（20 μmol·L-1）和Gd3+（20 μmol·L-1），应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值。加入Piezo1激活剂Jedi1，Jedi2和Yoda1，按0.2，1，5，10，25，50，75，100，200，300，400，500，600，700，800，900和1000 μmol·L-1设置浓度梯度，应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值并绘制浓度依赖曲线。向FRT细胞中加入Yoda1，按同样的方法设置浓度梯度，通过Fura-2/AM荧光探针检测细胞内的钙信号随Yoda1浓度的变化，分析细胞内Ca2+浓度与FRT模型细胞相对荧光强度变化值之间的关系。计算模型Z′因子及信噪比。结果 RT-PCR、DNA测序比对和Western 印迹结果表明，FRT细胞内源性表达Piezo1。ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L表达清晰，位置正确，并且ANO1-EGFP被离子霉素激活后模型荧光淬灭，证实转染基因表达的蛋白具有生物学活性，FRT模型细胞构建成功。FRT模型细胞加入Jedi1，Jedi2和Yoda1荧光均淬灭，加入Gd3+后再加入Yoda1荧光不淬灭，证实模型可以用于筛选Piezo1通道调节剂；在FRT模型细胞中离子霉素的EC50为（7.76±0.53）μmol·L-1，Yoda1的EC50为（17.27±1.21）μmol·L-1，Jedi1的EC50为（200.60±4.46）μmol·L-1，Jedi2的EC50为（158.10±4.65）μmol·L-1 。FRT模型细胞相对荧光强度变化值与细胞内Ca2+浓度呈正相关，模型能敏感地反应细胞内钙信号变化。模型Z′因子为0.82，信噪比为13.29∶1，可用于Piezo1通道调节剂高通量筛选。结论 成功构建了可快速、准确、便捷筛选Piezo1通道激活剂和抑制剂的高通量筛选模型。
