第十七届全国神经精神药理学学术会议论文摘要
蒋文学，姜 静，阳雨虹，陆佳彤，卢韵碧，魏尔清，唐 淳,张纬萍
2016, 30(4): 461-461.
目的 建立活细胞标记 G蛋白偶联受体（GPCR）
的方法， 采用荧光寿命成像（FLIM）结合荧光共振能量转移
（FRET）分析 GPR17（一种 P2Y/CysLT受体）同源二聚体相
互作用。方法 建立基于切割绿色荧光蛋白（split GFP，
sGFP）的 GPCR标记方法， 以 sGFP分别标记到 GPR17细
胞外 3个 loop， 或以 GFP融合到 GPR17的 N端或细胞内第
3个 loop， 以 mcherry融合到 GPR17的 N端或细胞内第 3个
loop， 以 sGFP 或 GFP 作为 FRET 的供体， 以 mcherry 作为
FRET 的受体， 采用 FLIM-FRET 方法分析不同标记供体和
受体之间的绝对距离， 基于距离约束， 使用结构预测软件 ITASSER 预测获得 GPR17 单体的结构， 然后使用 XplorNIH基于距离约束和单体结构， 进一步计算研究 GPR17同
源二聚体之间的相互作用。结果 将GFP的第10~11 β片段
（GFP10~11）作 为 标 签 ，采 用 基 因 工 程 的 方 法 插 入 到
GPR17的细胞外不同 loop上，合成并纯化 GFP， 采用酶切
的方法获得带成熟荧光基团的含 1~9 β片段（GFP1~9）， 将
携带 GFP10~11标签的 GPR17转到 HEK293细胞表达， 在
活细胞水平获得快速的（<5 min）、 高度特异的细胞表面标
记。FLIM-FRET 检测显示， GPR17-N-GFP 单转时 GFP 的
寿命为2.143 ns， 与GPR17-N-mcherry共转时为2.033 ns，
GPR17- K255GFP 单 转 时 GFP 的 寿 命 为 2.096 ns，与
GPR17-K255mcherry共转时为 2.047ns， GPR17-R291sGFP
单转时 sGFP 的寿命为 2.076 ns， 与 GPR17-N-mcherry 共
转时为 1.744 ns， GPR17-R214sGFP 单转时 sGFP 的寿命
为 1.923 ns， 与 GPR17-N-mcherry 共转时为 1.761 ns。根
据 GFP或 sGFP荧光寿命的变化， 我们获得了距离的信息，
采用距离约束， 构建了 GPR17 的同源二聚模型。结论
GPR17能够形成同源二聚体， 构建的模型可以指导突变， 以
促进或抑制二聚体形成， 来研究同源二聚体的生物学功能，
同时类似标记及 FLIM-FRET方法可以用于其他 GPCRs同
源、 异源二聚体的研究。
